JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Özet

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Giriş

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

Protokol

1. H2B-PSmOrange mRNA in vitro transkripsiyon ve mRNA Saflaştırma

  1. üreticinin talimatlarına uygun olarak Notl kısıtlama enzimi ile pCS2 plazmidi içeren H2B-PSmOrange linearize.
    Not: mRNA kontaminasyonu ve bozulmasını önlemek için eldiven ve laboratuvar kat olarak uygun korumaları kullanarak bir sonraki adımları gerçekleştirin.
  2. üreticinin protokollerine göre olan bir PCR Saflaştırma kiti ya da fenol-kloroform göre yöntemler kullanılarak Doğrusal hale getirilen DNA saflaştırılır.
  3. üreticinin talimatlarına göre Sp6-mRNA transkripsiyonu için doğrusallaştırılmış şablon DNA 1 ug kullanın.
  4. 37 ° C'de 10-20 dakika boyunca 1.0 U RNaz bilgilerini DNaseI eklenerek DNA çıkarın.
  5. Bir RNA üreticinin protokolüne göre kiti temizlemek kullanarak mRNA temizleyin.
  6. MRNA saflık ve konsantrasyon geliştirmek 6 ul sodyum asetat (3.0 M, pH 5.2) ve 150 ul% 96 ​​etanol eklenerek mRNA çökeltildi. m inkübeEn az 30 dakika boyunca ve 24 saat kadar, -20 ° C'de ixed çözeltisi.
  7. 4 ° C'de 45 dakika boyunca 18,407 x g'de çözelti eğirme mRNA toplayın. sıvı atılır ve 150 ul% 70 etanol içinde mRNA tekrar süspansiyon. Karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta ilave bir 15 dakika boyunca çözeltiden santrifüjlenir. , Sıvı atın buz üzerinde 5 dakika boyunca pelet kurutulur ve 20 ul ultra-saf RNazsız su içinde mRNA tekrar süspansiyon.
  8. 100 mRNA seyreltme (99 ul ultra-saf RNazsız su içinde 1 ul mRNA) bir 1: fotometrik ölçümüyle mRNA konsantrasyonu ve saflığı değerlendirmek.
  9. Kısa süreli depolama için, -20 ° C'de mRNA çözüm tutun. Uzun süreli depolama için, -80 ° C mRNA tutun.

Zebra balığı Embriyolar içine 2. H2B-PSmOrange mRNA Mikroenjeksiyon

  1. tg kullanarak enjeksiyon öncesi eşleyen gece çiftleşme kurmak (Foxd3: GFP); tg (FLH: GFP) çift transgenik balık (ya da diğer herhangi bir GFP transgenik balık). Bir boşluk koyarak ayrılmış balık bırakınAralarında çiftleşme kontrol etmek.
  2. enjeksiyon sabah ayırıcı çıkarın ve 20 dakika süre ile balık eş sağlar.
  3. süresi çiftleşme sırasında, 130 ug son konsantrasyona H2B-PSmOrange mRNA seyreltik / nl ve Microloader ucunu kullanarak mikroenjeksiyon, tüpün içine transferi 6 ul enjeksiyon çözeltisi (RNazsız su içinde). kalibre cam slayt ile enjeksiyon hacmi kontrol edin. 2 nl mRNA çözeltisi (260 pg) enjekte etmek için enjeksiyon basıncını ayarlayın.
  4. 1x Embriyo (E3) orta içeren bir sterilize plastik petri kabına yumurta toplamak.
  5. Bir plastik pastör pipet kullanarak bir enjeksiyon çanak 20 30 embriyoların transferi.
  6. Tek hücreli aşamada 11'de sarısı içine hücreye hücreye ya da hemen altında solüsyon içeren 2 nl mRNA enjekte edilir.
  7. 1x E3 ortamı içeren bir petri-çanak içine Transferi enjekte embriyolar, döllenmemiş veya normal gelişim gösteren embriyolar kaldırmak ve 28 ° C'de onları büyümek.
    Not: Işık koruma oembriyoların f deney boyunca gerekli değildir.
  8. 1x E3 ortam içinde zebra balığı embriyolar kaldırın ve pigmentasyonu önlemek için gastrulasyon sonra 0.2 mM PTU (1-fenil-2 tiyoüre) ekleyin. Bakteriyel kontaminasyon tehlikesini en aza indirmek için günde iki kez orta değiştirin.

3. Embriyo Gömme

  1. GFP (yeşil) ve PSmOrange bir floresan lamba ve uygun emisyon filtreleri ile donatılmış bir binoküler mikroskop kullanılarak (kırmızı / turuncu) birlikte ifade embriyolar seçin. 1x E3 ortamı içeren steril bir petri kabına pozitif embriyolar aktarın.
  2. Forseps 12 kullanarak bir stereomicroscope altında dechorionate embriyolar.
  3. 1.0 ml ihtiva eden 1.5 ml bir tüp içinde transferi bir embriyo, bir kesme ucu pipet (P200) kullanarak, ultra saf su içinde hazırlanmış% 1.0 düşük erimeli agaroz (LM) önceden ısıtılmış. Not: 80 ° C LMA ısıtın ve embriyo yerleştirmeden önce, oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca soğumaya.
  4. Bir içine 150 ul LMA embriyo transfercoverglass bölmeli ve ince bir plastik uç kullanılarak ters döndürülür konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + (ya da uygun olan herhangi bir mikroskop) için tarif edilen deneyde embriyonun yönünü örneğin dorsal tarafına ayarlayın. LMA polimerize olduğunda, anestezi için 0.2 mM propiltiourasil'in% 0.02 etil 3-aminobenzoat metansülfbnat (Tricaine) içeren balık su haznesi doldurun.
  5. örnek görüntüleme önce Tricaine etkisini tespit etmek için 15 dakika bekleyin. Anestezi aydınlık aydınlatma ile donatılmış bir stereomikroskop kullanılarak izlenebilir embriyo hareketleri önler.
    Not: odaları iki kez tekrar edilebilir.

4. PSmOrange Fotoçevrim

  1. konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve 488 nm ve sırasıyla GFP ve PSmOrange görüntüleme için 561 nm lazerler kullanarak photoconvert için bölgeyi tanımlamak için örnek tarayın.
    Not: ters sta üzerine ters konfokal lazer tarama mikroskobu A1R + kullanınge mikroskop görüntüleme yazılımı ile TiEcontrolled ve 488 nm, 561 nm ve Fotoçevrim ve görüntüleme için 640 nm lazer ile donatılmış. Bununla birlikte, uygulama kesinlikle uzun dönüşüm ve görüntüleme için bir lazer hattı mevcuttur Bu mikroskop ile sınırlı değildir.
    1. yerine 20X hava hedefi koydu (NA: 0.75; WD: 1,0 mm; FOV: 0.64 x 0.64 mm).
    2. Fotoçevrim önce PSmOrange proteini tespit etmek için aşağıdaki mikroskop ayarları kullanın: 561 nm lazer, objektif üzerindeki odak düzleminde ölçülen 0.74 mW.
      Not: Bu, bu sistemde% 40 tekabül (Odak düzleminde ölçme etkili gücünü belirlemek için tek yoldur). değişebilir H2B-PSmOrange enjeksiyonları verimliliği gibi deneysel ihtiyaçlarına göre lazer gücünü ayarlayın.
    3. ilgi alanı vurgulamak için yakınlaştırma faktörlerini ekleyin. Daha yüksek büyütme görüntü elde etme süresi ve bu nedenle fototoksisite azaltır.
  2. yapıyı kapsayan bir z-yığını Edinme488 nm ve sıralı mod (hat modu 1-> 4) 561 nm lazerler kullanarak ilgi s. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir.
  3. örnek Tarama ve photoconvert alanı vurgulamak için ilgi (ROI) aracı bölgeyi seçin. stimülasyon alanı olarak ROI sabitleyin. Fotoğraf Aktivasyon / Beyazlatma modülü seçin, ilgili kutucuğu işaretleyerek 488 nm lazer etkinleştirmek ve% 80 (objektif ölçülen 1 mW lazer gücü) için 488 nm lazer ayarlayın. 0.5 sn / Frame tarama hızını ayarlayabilirsiniz.
  4. Fotoçevrim programı (ND Uyarım) açın ve Fotoçevrim ayarlarını belirtin.
    1. Fotoçevrim protokolünü belirtmek için "Ekle" komutu üzerine tıklayın.
    2. "Toplama / Stimülasyon" menüsüne "Toplama" in "Faz" 1 Set ve görüntü sayısı "Döngüleri" menüsündeki Fotoçevrim önce elde edilecek göstermektedir.
    3. St "olarak ayarlayın" Faz "2imulation "ve stimülasyon olayların sayısını girmek yapılacak.
    4. Ayarı "Faz" 3 "Faz" 1. İsteğe bağlı için tarif edildiği gibi, görüntü alımı son turdan önce beklenecek süre girerek "Faz" 2 sonra bekleyen "Faz" takın.
    5. Tüm parametreler ayarlandıktan sonra, uyarım ayarı uygulamak ve Fotoçevrim çalıştırın.
      Lazer gücü, değişebilir Fotoçevrim her tur için tarama ve adım sayısı sıklığı ve embriyoya embriyo farklıdır: edin. Bir ayar Tablo 1'de gösterilmiştir ile başlayın.
  5. 488 nm, 561 nm ve yukarıdaki gibi ayarları uygulayarak 640 nm lazerler kullanarak nihai z-yığını edinin. (4.5 mW kadar) yüksek lazer gücünü kullanarak dönüştürülen PSmOrange görselleştirmek için 640 nm lazer ayarlayın.

LMA 5. Dismount Embriyo

  1. mikroskop bölmeyi içeren embriyo çıkarın. Dikkatle agaroz u embriyo kaldırmakforseps şarkı.
  2. Yeni bir steril plastik Petri-çanağı içine veya 1 x E3 ve 0.2 mM PTU içeren steril bir 6-yuvalı plaka içinde embriyo transferi. arzu edilen gelişme aşamasına kadar 28 ° C 'de embriyo inkübe edin.

6. Photoconverted PSmOrange proteini ifade eden hücrelerin kaderini analiz

  1. nokta 3.3 ve 3.4 bölümünde anlatıldığı gibi embriyo Yeniden embed.
  2. konfokal mikroskop altında örnek yerleştirin ve ilgi (488 nm) GFP transgenik yapısında photoconverted hücreleri (640 nm) tanımlamak için örnek tarayın.
  3. 488 nm, 561 nm ve sıralı mod (hat modu 1-> 4) 640 nm lazerler kullanarak ilgi yapıları kapsayan bir z-yığını edinin. 1.0 ve 2.0 mikron arasında z-adım sabitleyin. Çizgi ortalama ve tarama frekans görüntü kalitesini optimize etmek için de kullanılabilir.
  4. , Burada ko-ifade GFP ve photoconverted protein hücreleri belirlemek için, aşağıdaki yöntemlerden birini kullanabilirsiniz.
    1. Özel yapım otomatik Fiji GörüntüJ Makro 3
      1. Convolve "GaussianBlur" eklentisi kullanarak orijinal yığın (→ Süreç → GaussianBlur → Filtreler) ve "Görüntü Hesaplama" eklentisi (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) kullanarak orijinal pürüzsüz yığınları çıkarmak. ilgi yapılarını görselleştirmek ve analiz için hesaplama süresini azaltmak için bu adımı kullanın.
      2. photoconverted hücreleri vurgulamak amacıyla yeşil ve uzak-kırmızı kanallara özgü eşikler uygulayın (→ Görüntü → → Eşiği ayarlayın). Uygun bir ayar ile eşik alanlarını tespit etmek için "Parçacıklar Analiz" aracını kullanın (→ Parçacıklar Analiz → Analiz).
      3. "Görüntü Hesaplama" eklentisi açın ve sarı (→ Süreç → Görüntü Hesaplama) yeşil ve uzak-kırmızı kanalda örtüşen ROI'ları görüntüler.
    2. 3D veri değerlendirme için mikroskop görüntüleme yazılımı
      1. yığını görüntülemek(3D Görselleştirme Menü → göster Ses Görünüm →) göstermek hacmi görünümü seçeneğini kullanarak 3D. Yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı kanalları seçmek parlaklık ve kontrast ayarı ve photoconverted alanı (Şekil 1) vurgulamak için 3D yığını kırpmak için grafik arayüzü kullanın.
        Not: Veri görüntü analizi için ortak yazılımların çoğu mevcuttur analiz etmek için benzer yöntemler.

Sonuçlar

Şekil 1, PSmOrange Fotoçevrim sisteminin bir örneğini göstermektedir. epifiz kompleks omurgalı dorsal diensefalon korunmuş bir yapıdır. diğer omurgalılarda olduğu gibi, bu karmaşık diensefalon ve sol parapineal hücrelerin merkezinde epifiz organı oluşur. Zarif ama zaman alıcı uncaging deneyler parapineal hücreler epifiz organı 13 ön kısmında menşeli olduğu görüldü. TG (Foxd3 GFP); tg (FLH: GFP) transgenik embriyolar, epifiz ve para...

Tartışmalar

floresan gazetecilere taşıyan transgenik embriyolar embriyo gelişimini anlamak için temelde yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, özellikle yapıların belirli bir görselleştirme kolaylaştırmak için promotörler için gerekli ihtiyaç vardır. Onların yokluğunda, araştırmacılar kendi ilgi yapısının kökeni ve gelişimi hakkında bilgi edinmek için bu tür floresan proteinleri Fotoçevrim gibi teknikler güveniyor. Bu da onun gelişiminde rol oynayan moleküler mekanizmaları tanımlamak için öneml...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Teşekkürler

We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Purification KitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermanyNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective Nikon GmbH GermanyNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number

Referanslar

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
  12. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  13. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 108Zebra balepifizFoto evrimh cre izlemePSmOrangefloresang r nt lemeCLSMIn vivoGeli tirme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır