El examen de las proteínas unidas al ADN naciente en células de mamífero utilizando BrdU-chip-Slot-occidental Técnica

Resumen

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Resumen

Histonas desacetilasas 1 y 2 (HDAC1,2) localizar a los sitios de la replicación del ADN. En el estudio anterior, el uso de un inhibidor selectivo y un sistema de caída genética, mostramos funciones novedosas para HDAC1,2 en la replicación del tenedor progresión y mantenimiento de la cromatina naciente en células de mamífero. Además, se utilizó una técnica de BrdU-chip-Slot-occidental que combina la cromatina immunoprecipitation (CHIP) de bromo-desoxiuridina (BrdU) ADN marcado con con slot blot y análisis Western para medir cuantitativamente las proteínas o modificación de las histonas asociadas con el ADN naciente.

Activamente células que se dividen fueron tratados con HDAC1,2 inhibidor selectivo o transfectadas con siRNAs contra HDAC1 y HDAC2 y luego ADN recién sintetizado se marcó con el análogo de la timidina bromodesoxiuridina (BrdU). El etiquetado BrdU se realizó en un punto de tiempo cuando no había detención del ciclo celular o apoptosis significativa debido a la pérdida de las funciones HDAC1,2. Después de lAbeling de las células con BrdU, inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) de las marcas de acetilación de histonas o la cromatina-remodelador se realizó con anticuerpos específicos. El ADN de entrada BrdU-etiquetado y la immunoprecipitated (o chiped) ADN fue descubierto en una membrana utilizando la técnica de transferencia de ranura y inmovilizaron utilizando UV. La cantidad de ADN naciente en cada ranura a continuación, se evaluó cuantitativamente utilizando el análisis de Western con un anticuerpo anti-BrdU. A continuación, el efecto de la pérdida de las funciones HDAC1,2 sobre los niveles de ADN asociado a histonas marcas de acetilación recién sintetizadas y remodelador de la cromatina se determinó mediante la normalización de la señal BrdU-Chip obtenido a partir de las muestras tratadas a las muestras de control.

Introducción

La reparación del ADN defectuoso y / o la replicación del ADN son una causa principal de la inestabilidad del genoma, lo que puede desencadenar la muerte celular. Una sola sin reparar rotura de doble cadena es suficiente para causar la muerte celular ^1. Organización de la cromatina se altera transitoriamente tanto durante la replicación y la reparación de ^2,3, y el fracaso para mantener la información epigenética durante estos procesos se traducirá en una amenaza para la integridad del genoma. Pérdida de HDAC3 o función HDAC1,2 impide la progresión de la fase S, la replicación y reparación del ADN que conduce a estrés genotóxico (daño en el ADN) y la muerte celular ^4-9. Es por lo tanto una estrategia práctica para usar inhibidores de HDAC selectivos para interrumpir la replicación, reparación y la cromatina en las células cancerosas y causar daño en el ADN, que a su vez puede detener el crecimiento y la muerte celular selectivamente inducir en las células cancerosas que crecen rápidamente.

Durante la replicación del ADN, la cromatina se desmonta rápidamente y luego se vuelve a montar después de la duplicación del ADN. Recién syhistona H4 nthesized es acetilada en K5 y K12 residuos (H4K5K12ac) y después de la deposición sobre la cromatina, se deacetylated rápidamente por desacetilasas de histonas (HDAC) ^10,11. El fracaso de las células para mantener la integridad de la cromatina naciente por desacetilación de histonas puede conducir al colapso tenedor, que a su vez puede dar lugar a daños en el ADN y la muerte celular. Recientemente hemos demostrado que la inhibición selectiva de HDAC1,2 aumenta la acetilación de histonas (H4K5ac, H4K12ac y H4K16ac) e inhibe la actividad smarca5 remodelador de cromatina en la cromatina naciente, que se correlaciona con una menor progresión de tenedor de replicación, aumentamos colapso tenedor y el aumento de la replicación del daño en el ADN inducido por el estrés ⁶ . Así, el tratamiento inhibidor de HDAC puede alterar la estructura de cromatina naciente para desencadenar el daño del ADN y la muerte muy rápidamente en las células cancerosas, ya que estos ciclo de las células rápidamente y pasar muchas veces a través de la fase S. Por tanto, es importante entender cómo las HDAC funcionan para regular la acetilación de histonas y proteínas binding para mantener la replicación del ADN en células de mamífero.

Para medir cuantitativamente la cantidad de acetilación de histonas y smarca5 remodelador de cromatina asociada con el ADN naciente durante la replicación del ADN, ideamos un chip de ensayo modificado llama la técnica de BrdU-chip-Slot-occidental. Después de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de una modificación de la proteína o histona se desea, la cantidad de ADN naciente (marcó usando análogo de la timidina, BrdU) en la muestra de chip puede ser detectado mediante análisis de Western de DNA chip BrdU marcado con transfirió a una membrana usando un Slot aparato Blot. Mediante esta técnica, se demostró que H4K16ac (una marca implicada en el embalaje de la cromatina) y el miembro de la familia ISWI smarca5 (actina dependiente regulador de la matriz asociada relacionada con el SNF SWI / de la cromatina) remodelador de cromatina se asocian con el ADN naciente en las células en fase S ^6. También se encontró que la marca naciente H4K16ac se desacetila por HDAC1,2 durante la replicación del ADN ^6. Inhibe H4K16acactividad remodelador de cromatina del familiar ISWI smarca5 ^12. Por lo tanto, utilizando la técnica de BrdU-CHIP-Slot-Western, podríamos conectar las funciones para HDAC1,2 en la regulación de remodelación de la cromatina durante la replicación del ADN. Por lo tanto, la técnica BrdU-chip-Slot-Western Blot es un enfoque poderoso para medir cuantitativamente la dinámica de asociación y disociación de proteínas o sus modificaciones posteriores a la traducción que se unen al ADN naciente.

Protocolo

1. La cromatina immunoprecipitation (CHIP) después de etiquetado BrdU

1. Cultura células NIH3T3 en presencia de DMSO o inhibidores selectivos HDAC1,2 como se describió previamente ^6.
2. Tras el tratamiento con inhibidores selectivos de DMSO o HDAC1,2, añadir BrdU a las células en una campana de cultivo de tejido estéril. Incubar 2 x 10 ⁶ NIH3T3 células sembradas en 10 ml de medio NIH3T3 con una concentración final de 20 mM de bromodesoxiuridina (BrdU) durante 60 minutos en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejidos estéril.
3. Reticular proteínas intracelulares en el ADN mediante la adición de formaldehído directamente a los medios de cultivo a una concentración final de 1%. Incubar 2 x 10 ⁶ células NIH3T3 con formaldehído a TA durante 10 min en un agitador.
4. Se detiene la reticulación mediante la adición de glicina a una concentración final de 125 mM. Incubar a TA durante 5 min en un agitador.
5. Quite el papel y recoger las células en PBS en un tubo de centrífuga de 15 ml. Girar cells a 956 xg durante 5 min a 4 ° C. Lavar el sedimento celular dos veces con PBS enfriado con hielo. Retirar PBS desde el tubo. Almacenar el sedimento celular reticulado sin PBS (el sobrenadante) a -80 ° C hasta su uso.
6. Preparar el lisado del sedimento celular reticulado mediante la adición de tampón FA140 500 l (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) complementado con cóctel inhibidor de proteasa.
7. Cortar la cromatina sonicando las muestras cinco veces en el poder el 35% y con un pulso de 15 segundos, 0,9 segundos encendido y 0,1 seg de ajuste. Mantener los tubos en hielo después de cada ronda de tratamiento con ultrasonidos para evitar el calentamiento de las muestras.
   1. Compruebe la esquila en un gel de ADN como la eficiencia esquila variará entre los diferentes sonicadores. Para comprobar la sonicación, invierta reticulación mediante la adición de NaCl a una concentración de 0,16 M y realizar los pasos 1.17.1. - 1.22. Run eluyó 10 l de ADN en un gel de agarosa al 1,5% para comprobar si el cizallamiento esentre 300-700 pb con una intensidad media en 500 pb.
8. Tras la sonicación, las muestras de centrifugación durante 10 min a 17.949 xg a 4 ° C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
   1. Efectuar la estimación de proteínas usando el kit de ensayo de proteína comercial según el protocolo del fabricante. Utilice la misma cantidad de lisado de chip de control y las muestras experimentales. En general, use 1 mg de lisado total por reacción chip.
9. Preparar suspensión al 50% de la proteína A-agarosa usando tampón que contiene FA140 cóctel inhibidor de proteasa. Añadir décima volumen del cóctel inhibidor de proteasa. Calcular el volumen de los granos necesarios basado en el número de muestras en total.
   1. Wash perlas de Proteína A-agarosa con tampón FA140 dos veces para eliminar el tampón de almacenamiento y añadir un volumen igual a tampón FA140 a las perlas para hacer suspensión al 50%.
   2. Para eliminar las proteínas que se unen no específicamente a las perlas, se añaden 50 l de suspensión al 50% de proteína A-agarosa y enCubate las muestras a 4 ° C con rotación constante de extremo sobre extremo en un mezclador asador durante 30 min.
10. Haga girar las muestras a 956 xga 4 ° C durante un minuto. Recoger el sobrenadante y llevar a cabo la inmunoprecipitación mediante la adición de ya sea 8 l de anticuerpo H4K16ac o 5 l (5 g) de 1 mg / ml de anticuerpo smarca5 al sobrenadante. Se incuba a 4 ° CO / N con la rotación de extremo a extremo constante en un mezclador rotisserie.
11. Guardar 1 / 10o del extracto para el control de "entrada" y configurarlo como un lado a -20 ° C. La entrada tiene que ser inversa reticulado junto con las muestras IP.
12. Utilice una cantidad igual de IgG de conejo (5 l de 1 mg / ml) como la muestra negativa inmunoprecipitación control.
13. El día siguiente, se añaden 50 l de 50% de proteína-A agarosa suspensión para el extracto y se incuba durante 1 hora a 4 ° C con rotación.
14. Pellet perlas de agarosa por centrifugación a 956 xg durante 2 min a 4 ° C, retire con cuidado el sobrenadante y wash de las bolitas con los siguientes tampones secuencialmente. En los preparativos de amortiguamiento, añadir inhibidores de proteasas justo antes de su uso.
    1. Lavar con Sal complejo inmune tampón de lavado Low (FA140; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo.
    2. Lavar con elevado de sal complejo inmune Wash Buffer (FA500; concentración final de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM de EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 y 0,1% de desoxicolato de sodio) para 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo.
    3. Lavar con LiCl complejo inmune tampón de lavado (concentración final de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% de NP40 y 0,5% de desoxicolato de sodio) durante 5 min a 4 ° C con rotación de extremo a extremo.
15. Después de lavados como se ha descrito anteriormente, añadir 200 l solución de elución (concentración final de 1% SDS y bicarbonato de sodio 100 mM) y incubate a TA durante 15 min con rotación de extremo a extremo a TA.
16. Girar las muestras a 956 xg a TA y transferir el material eluido a un nuevo tubo de 1,5 ml. Repita el paso 1,15 con una solución adicional de elución 200 l.
17. Para 400 l de eluato, añadir NaCl hasta una concentración de 0,16 M y mezclar bien.
    1. Además, añadir solución de elución a 400 l 10 l de entrada que se había reservado (paso 1,11) y se añade NaCl a una concentración de 0,16 M para revertir muestras de entrada de reticulación también. Invierta entrecruzar las muestras mediante la incubación de 65 ° C baño de agua durante 5 horas.
18. Añadir 1 ml de EtOH 100% al eluato reticulado inversa. Mezclar bien e incubar a 80 ° C durante 2-3 horas oa -20 ° CO / N. Haga girar las muestras a 17.949 xg durante 15 min y deseche etanol.
19. Añadir 800 l 70% de etanol para lavar el pellet. Vuelta a 17.949 xg durante 15 min a 4 ° C y descartar etanol. Girar brevemente para eliminar cualquier etanol residual. Seque las muestras a 37 ° C durante 10 min para eliminar el etanol residual.
20. Disolver el ADN en 90 l de RNasa y DNasa libre de agua y añadir 2 l 10 mg / ml RNasa a un / ml de concentración final 0,2 mg. Se incuba a 37 ° C en baño de agua durante 30 minutos.
21. Añadir 10 l de 10x proteinasa K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% de SDS). Mezclar bien y añadir 1 l de proteinasa K. Incubar a 42 ° C durante 1 hora.
22. Se purifica ADN de entrada y chip usando kit comercial de purificación de PCR según el protocolo del fabricante y eluir ADN en 50 l de agua. ADN tienda a -20 ° C hasta su uso posterior.

2. Ranura Análisis de transferencia de ADN chip

1. Medir el rendimiento de entrada y el ADN se eluyó en ChIP 50 l de agua como se describe en el paso 1.22 usando un espectrofotómetro a 280 nm de acuerdo con el protocolo del fabricante.
2. Tome volúmenes iguales (50 l) de la entrada o de ADN immunoprecipitated que están dentro del rango lineal de detección.
   1. Por ejemplo, si la entradaRendimiento de ADN es de 1,5 ng / l, luego tomar 30 l (o 45 ng de ADN total) y crea volumen de 50 l con agua. Para factor de chip, tome todo el eluato 50 l a partir del paso 2.1 y vaya al paso 2.3.
3. Desnaturalizar 50 l de entrada o ADN inmunoprecipitado mediante la adición de 2,5 volúmenes de NaOH 0,4 N, vórtice brevemente y centrifugar durante 956 xg durante 10 seg, y se incuba a TA durante 30 min.
4. Neutralizar la DNA desnaturalizado mediante la adición de 175 l de M Tris-HCl pH 6,8, 1, vórtice, de centrífuga de 956 xg durante 10 seg y colocar las muestras en hielo.
5. Preparar una dilución en serie de entrada y el ADN inmunoprecipitado para el ensayo de transferencia en ranura como se describe a continuación.
   1. Siga los pasos 2.3 - 2.4 para obtener un volumen de muestra total de 350 l (es decir, 50 l de entrada / DNA chip, 125 l NaOH 0,4 N, M Tris-HCl 175 l 1, pH 6,8).
      Nota: Para la instancia se ha dicho, 45 ng de ADN de entrada va a terminar siendo 0.129 ng / l.
   2. Para ADN de entrada, etiquetar tres tubos como 100, 50 y 25 y añadir 100 l, 50 l y 25 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer que el volumen final de 100 l con agua libre de nucleasa. Para chip de ADN, la etiqueta tres tubos como 200, 100 y 50 y añadir 200 l, 100 l y 50 l de la muestra de ADN desnaturalizado y neutralizado. Hacer volumen final de 200 l con agua libre de nucleasa.
6. Cortar la membrana con el tamaño del aparato de slot blot. Pre-humedecer la membrana y papeles secantes en 20x SSC antes y antes de añadir el ADN. Ensamblarlos en el aparato de slot blot de acuerdo con el protocolo del fabricante.
7. ADN Pipet desde el paso 2.5.2 en las ranuras apropiadas. Aplicar el vacío lentamente para sacar el ADN sobre la membrana zeta-sonda. Deje de vacío después de haber pasado todas las muestras a través del aparato.
   1. Desmontar el aparato e inmovilizar inmediatamente el ADN sobre la membrana utilizando un agente de reticulación UV. Tener el lado del ADN en el agente de reticulación UV y usar el autocrosslink establecer en el agente de reticulación. Siga el protocolo del fabricante.
8. Detectar BrdU en el slot blot mediante la realización de Western Blot.
   1. Bloquear la membrana con 5% de leche seca no grasa en PBS que contenía 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 1 hora a RT para evitar la unión no específica de anticuerpos a la membrana.
   2. Añadir anticuerpo primario anti-BrdU (1: 500 dilución) diluido en 1% de leche seca no grasa en PBST y se incuba el blot con el anticuerpo primario durante 3 horas a RT en un agitador. Se lava la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo primario.
   3. Añadir anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con HRP a la blot (1: 5000 dilución) y se incuba a RT durante 1 hr. Lavar la membrana con PBST tres veces después de la incubación del anticuerpo secundario.
      NOTA: Utilice un volumen suficiente de los anticuerpos para cubrir completamente la membrana durante incubaciones de anticuerpos primarios y secundarios.
9. Preparar la mezcla de ECL y agregarlo a la ac blotacuerdo con el protocolo del fabricante. Incubar la membrana con la mezcla de ECL durante 5 min a RT.
   1. Colocar la membrana en un casete de rayos X, exponer la membrana a la película de rayos X y desarrollar el blot utilizando el protocolo del fabricante.
   2. Cuantificar la señal obtenida para la entrada y el ADN chiped después de escanear las manchas utilizando la imagen J software de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para la cuantificación, utilizar la señal que está dentro del intervalo lineal de detección con el fin de asegurar la exactitud de la medición.

Resultados

Para determinar la especificidad de los inhibidores selectivos HDAC1,2, se utilizaron Hdac1,2 ^{FL / FL} y HDAC3 ^{FL / FL} células de fibrosarcoma. Se utilizó la recombinasa Cre (Ad-Cre) que contiene Adenovirus-eliminar Hdac1,2 y HDAC3 en estas células. Después de la infección Ad-Cre de Hdac1,2 ^{FL / FL} células, se observó un fuerte incremento en H4K5ac. El tratamiento de células knockou...

Discusión

El protocolo se describe en este manuscrito es un método relativamente rápido para demostrar la presencia de las proteínas o sus formas modificadas post-traduccionalmente en el ADN recién replicado o naciente. Además, esta técnica permite que un para medir la cinética de asociación-disociación de una proteína o su forma modificada con el ADN naciente. Esta técnica es complementaria a la tecnología elegante ipond ^13. En la tecnología ipond, ADN recién sintetizado se etiqueta con acetato de desoxi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators