Examen des protéines liées à Nascent ADN dans les cellules de mammifères utilisant la technique BrdU-Chip-Slot-Ouest

Résumé

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Résumé

Les histones désacétylases 1 et 2 (HDAC1,2) localisent sur les sites de réplication de l'ADN. Dans l'étude précédente, en utilisant un inhibiteur sélectif et un système de knock-down génétique, nous avons montré de nouvelles fonctions pour HDAC1,2 dans la réplication et la progression de la fourche naissant maintien de la chromatine dans les cellules de mammifères. En outre, nous avons utilisé une technique BrdU-Chip-Slot-Ouest qui combine immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) de bromo-désoxyuridine (BrdU) l'ADN marqué au avec slot blot et analyse Western de mesurer quantitativement les protéines ou la modification des histones associées à l'ADN naissant.

Activement les cellules en division ont été traités avec HDAC1,2 inhibiteur sélectif ou transfectées avec des ARNsi contre HDAC1 et HDAC2 puis l'ADN nouvellement synthétisé a été marqué avec la bromodésoxyuridine thymidine analogique (BrdU). Le marquage BrdU a été fait à un point de temps où il n'y avait pas l'arrêt du cycle cellulaire ou l'apoptose significative en raison de la perte des fonctions HDAC1,2. Après lAbeling de cellules avec BrdU, immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des marques d'acétylation des histones ou de la chromatine Remodeler a été réalisée avec des anticorps spécifiques. ADN d'entrée BrdU marqué et l'immunoprécipité (ou Pucée) a ensuite été repéré ADN sur une membrane en utilisant la technique slot blot et immobilisées en utilisant UV. La quantité d'ADN naissant dans chaque fente a ensuite été évaluée en utilisant l'analyse quantitative de Western avec un anticorps anti-BrdU. L'effet de la perte de fonctions HDAC1,2 sur les niveaux de l'histone marques d'acétylation nouvellement synthétisées ADN-associé et chromatine Remodeler a ensuite été déterminé en normalisant le signal BrdU puce obtenue à partir des échantillons traités à des échantillons de contrôle.

Introduction

Réparation de l'ADN défectueux et / ou la réplication de l'ADN sont une cause majeure de l'instabilité du génome, ce qui peut déclencher la mort cellulaire. Un seul non réparés double rupture des brins est suffisante pour causer la mort de ^la cellule 1. Organisation de la chromatine est transitoirement modifié au cours de la réplication et la réparation ^2,3, et l'incapacité à maintenir l'information épigénétique au cours de ces processus se traduira par une menace pour l'intégrité du génome. Perte de HDAC3 ou la fonction HDAC1,2 entrave la progression de la phase S, la réplication de l'ADN et de réparation qui entraîne un stress génotoxique (dommages à l'ADN) et la mort cellulaire ^4-9. Il est donc une stratégie pratique d'utiliser des inhibiteurs sélectifs de HDAC à perturber la replication, la réparation et la chromatine dans les cellules cancéreuses et provoquer des dommages à l'ADN, ce qui peut stopper la croissance et induire une mort cellulaire sélective dans les cellules cancéreuses à croissance rapide.

Lors de la réplication de l'ADN, la chromatine est rapidement démontés puis rassemblé suivante duplication de l'ADN. Nouvellement synthesized l'histone H4 est acétylée au K5 et K12 (résidus H4K5K12ac) et les dépôts suivants sur la chromatine, ils sont rapidement déacétylés par des histone désacétylases (HDAC) ^10,11. Échec de cellules de maintenir l'intégrité de la chromatine naissante par désacétylation des histones peut conduire à l'effondrement de fourche, qui à son tour peut entraîner des lésions de l'ADN et la mort cellulaire. Nous avons récemment montré que l'inhibition sélective de HDAC1,2 augmente l'acétylation des histones (H4K5ac, H4K12ac et H4K16ac) et inhibe SMARCA5 activité chromatine Remodeler sur la chromatine naissante, qui est en corrélation avec réduite la progression des fourches de replication, l'augmentation de l'effondrement fourchette et une réplication accrue induite par le stress dommages à l'ADN ⁶ . Ainsi, le traitement de l'inhibiteur de HDAC peut modifier la structure chromatinienne naissant pour déclencher dommages à l'ADN et de mort très rapidement dans les cellules cancéreuses, car elles cycle de cellules rapidement et passer plusieurs fois à travers la phase S. Il est donc important de comprendre comment fonctionnent les HDAC de réglementer l'acétylation des histones et des protéines binding pour maintenir replication de l'ADN dans des cellules mammaliennes.

Pour mesurer quantitativement la quantité de l'acétylation des histones et SMARCA5 remodeler la chromatine associée à ADN naissant lors de la réplication de l'ADN, nous avons conçu un test de ChIP modifié la technique dite BrdU-Chip-Slot-Ouest. Suite à immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) d'une modification de protéine ou histone on le souhaite, la quantité d'ADN naissant (marqué en utilisant analogue de la thymidine, la BrdU) dans l'échantillon de puce peut être détectée en utilisant une analyse Western de la puce ADN de BrdU marqué transféré sur une membrane en utilisant une fente Appareil Blot. En utilisant cette technique, nous avons montré que H4K16ac (une marque impliquée dans l'emballage de la chromatine) et le membre de la famille ISWI SMARCA5 (régulateur actine-dépendante matrice associée SWI / SNF-liés de la chromatine) remodeler la chromatine sont associés avec l'ADN naissante dans les cellules en phase S ^6. Nous avons également constaté que la marque H4K16ac naissante est désacétylé par HDAC1,2 lors de la réplication de l'ADN ^6. Inhibe H4K16acactivité de remodeler la chromatine du membre de la famille ISWI SMARCA5 ^12. Ainsi, en utilisant la technique BrdU-CHIP-Slot-Ouest, nous avons pu relier les fonctions pour HDAC1,2 dans la régulation de remodelage de la chromatine lors de la réplication de l'ADN. Par conséquent, la technique BrdU-Chip-Slot-Western Blot est une approche puissante pour mesurer quantitativement les association et de dissociation dynamique des protéines ou leurs modifications post-traductionnelles qui sont liés à l'ADN naissant.

Protocole

1. Immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivant BrdU Labeling

1. Culture des cellules NIH3T3 en présence de DMSO ou l'autre ou les inhibiteurs sélectifs HDAC1,2 tels que décrits précédemment ^6.
2. Après le traitement avec les inhibiteurs sélectifs de DMSO ou HDAC1,2, ajouter BrdU dans les cellules dans une hotte de culture tissulaire stérile. Incuber 2 x 10 ⁶ cellules NIH3T3 plaquées dans 10 ml médias NIH3T3 avec un 20 uM concentration finale de bromodésoxyuridine (BrdU) pendant 60 min dans une stérile 37 ° C culture de tissu incubateur.
3. Réticuler des protéines intracellulaires de l'ADN par addition de formaldehyde directement au milieu de culture à une concentration finale de 1%. Incuber 2 x 10 ⁶ cellules NIH3T3 avec du formaldehyde à température ambiante pendant 10 min sur un agitateur.
4. Stopper la reticulation par addition de glycine à une concentration finale de 125 mM. Incuber à température ambiante pendant 5 min sur un agitateur.
5. Retirer les médias et recueillir des cellules dans du PBS dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Spin cells à 956 g pendant 5 min à 4 ° C. Laver le culot de cellules deux fois avec du PBS glacé. Retirer le tube de PBS. Stocker le culot cellulaire réticulé sans PBS (le surnageant) à -80 ° C jusqu'à utilisation.
6. Préparation du lysat provenant de la pastille de cellules réticulées par addition d'un tampon de FA140 500 ul (50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 et le désoxycholate de sodium à 0,1%) complété avec inhibiteur de protéase cocktail.
7. Cisailler la chromatine par soniquant les échantillons cinq fois à 35% de puissance et avec une impulsion de 15 sec, 0,9 sec et 0,1 sec sur hors fonction. Gardez les tubes sur la glace après chaque cycle de traitement par ultrasons pour éviter de chauffer les échantillons.
   1. Vérifier le cisaillement sur un gel d'ADN telle que l'efficacité de cisaillement varie entre différents sonicateurs. Pour vérifier ultrasons, inverser réticulation par addition de NaCl à une concentration de 0,16 M et suivez les étapes 1.17.1. - 1,22. Exécuter élue 10 ul d'ADN sur un gel d'agarose à 1,5% afin de vérifier si la tonte estentre 300 à 700 pb avec une intensité moyenne à 500 pb.
8. Après sonication, centrifuger les échantillons pendant 10 min à 17 949 g à 4 ° C et transférer le surnageant dans un nouveau tube.
   1. Effectuer estimation de la protéine en utilisant le kit de dosage de protéine du commerce, selon le protocole du fabricant. Utilisez la même quantité de lysat pour la puce de contrôle et les échantillons expérimentaux. En règle générale, utiliser 1 mg de lysat total par réaction de puce.
9. Préparer 50% suspension de protéine A-agarose en utilisant un tampon de FA140 contenant inhibiteur de la protéase cocktail. Ajouter 1/10 du volume du cocktail d'inhibiteurs de protease. Calculer le volume de billes nécessaires sur la base du nombre d'échantillons au total.
   1. Laver billes de protéine A-agarose avec le tampon de FA140 deux fois pour supprimer le tampon de stockage et ajouter un volume égal à tampon FA140 aux perles pour faire 50% boue.
   2. Pour éliminer les protéines qui se lient de manière non spécifique aux billes, ajouter 50 ul de suspension de 50% de protéine A-agarose et encubate les échantillons à 4 ° C avec une constante de bout en bout au-dessus de la rotation dans un mélangeur pendant 30 minutes rôtissoire.
10. Faites tourner les échantillons à 956 g à 4 ° C pendant une minute. Recueillir le surnageant et effectuer immunoprécipitation en ajoutant soit 8 pi anticorps H4K16ac ou 5 pi (5 ug) de 1 mg d'anticorps / ml SMARCA5 au surnageant. Incuber à 4 ° CO / N avec une constante rotation de fin sur la fin dans un mélangeur de rôtisserie.
11. Enregistrer 1 / 10e de l'extrait pour le contrôle «d'entrée» et le définir comme côté à -20 ° C. L'entrée inverse doit être réticulé en même temps que les échantillons IP.
12. Utilisez montant égal d'IgG de lapin (5 pi de 1 mg / ml) comme le négatif échantillon contrôle de immunoprécipitation.
13. Le jour suivant, ajouter 50 ul de 50% de protéine A-agarose suspension de l'extrait et incuber pendant 1 heure à 4 ° C avec rotation.
14. Pellet billes d'agarose par centrifugation à 956 g pendant 2 min à 4 ° C, retirer délicatement le surnageant et wash les perles avec les tampons suivants séquentiellement. Dans les préparations de tampons, ajouter des inhibiteurs de la protéase juste avant l'utilisation.
    1. Laver à faible teneur en sel immunitaire tampon Complexe de lavage (en FA140; concentration finale de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 et 0,1% de désoxycholate de sodium) pour 5 min à 4 ° C avec rotation par rapport à l'extrémité extrémité.
    2. Laver à l'Sel immunitaire tampon à haute teneur Complexe de lavage (en FA500; concentration finale de 50 mM de HEPES KOH pH 7,5, 500 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA (pH 8,0), 1% de Triton-X-100 et 0,1% de désoxycholate de sodium) pour 5 min à 4 ° C avec rotation par rapport à l'extrémité extrémité.
    3. Laver avec LiCl immunitaire tampon Complexe de lavage (concentration finale de 10 mM de Tris-Cl pH 8,0, 250 mM de LiCl, 0,5% de NP40 et 0,5% de désoxycholate de sodium) pendant 5 min à 4 ° C avec rotation extrémité sur l'autre extrémité.
15. À la suite de lavages comme décrit ci-dessus, ajouter 200 ul de solution d'élution (concentration finale de 1% de SDS et du bicarbonate de sodium 100 mM) et Incubate à température ambiante pendant 15 min avec rotation par rapport à l'extrémité bout à TA.
16. Faites tourner les échantillons à 956 x g à la température ambiante et transférer l'éluat dans un nouveau tube de 1,5 ml. Répétez l'étape 1.15 avec une solution supplémentaire d'élution de 200 pi.
17. Pour 400 ul de l'éluat, ajouter NaCl à une concentration de 0,16 M et bien mélanger.
    1. En outre, ajouter une solution d'élution de 400 ul à 10 ul d'entrée qui a été mis de côté (étape 1.11) et ajouter NaCl à une concentration de 0,16 M à inverser échantillons d'entrée de reticulation ainsi. Inverser réticuler les échantillons en incubant à 65 ° C dans un bain d'eau pendant 5 heures.
18. Ajouter 1 ml de EtOH à 100% de l'éluat de la reverse-réticulé. Mélangez bien et incuber à -80 ° C pour les 2 - 3 heures ou à -20 ° CO / N. Faites tourner les échantillons à 17 949 g pendant 15 min et jeter l'éthanol.
19. Ajouter 800 ul d'éthanol à 70% pour laver le culot. Spin à 17 949 g pendant 15 min à 4 ° C et jeter l'éthanol. Centrifuger brièvement pour éliminer tout éthanol résiduel. Sécher à l'air les échantillons à 37 ° C pendant 10 min pour éliminer l'éthanol résiduel.
20. Dissoudre dans 90 ul ADN RNase et DNase eau libre et ajouter 2 ul de 10 mg / ml de RNase à 0,2 mg / ml de concentration finale. Incuber à 37 ° C au bain-marie pendant 30 min.
21. Ajouter 10 ul 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 5% de SDS). Bien mélanger et ajouter 1 pl Proteinase K. Incuber à 42 ° C pendant 1 heure.
22. Purifier l'ADN d'entrée et la puce en utilisant un kit de purification PCR commercial selon le protocole du fabricant et éluer l'ADN dans 50 ul d'eau. ADN de magasin à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

2. slot blot Analyse de puce à ADN

1. Mesurer le rendement de l'entrée et de la puce ADN élue dans 50 ul d'eau comme décrit dans l'étape en utilisant un spectrophotomètre 1,22 à 280 nm selon le protocole du fabricant.
2. Prenez des volumes égaux (50 pi) de l'entrée ou de l'ADN immunoprécipité qui sont dans la gamme linéaire de détection.
   1. Par exemple, si l'entréeLe rendement de l'ADN est de 1,5 ng / ul, puis prendre 30 pi (ou 45 ng d'ADN total) et faire du volume de 50 pi avec de l'eau. Pour facteur Chip, prendre la totalité éluat de 50 pi de l'étape 2.1 et passez à l'étape 2.3.
3. Dénaturer entrée 50 ul ADN ou une immunoprécipitation par addition de 2,5 volumes d'NaOH 0,4 N, vortex et centrifuger brièvement à 956 xg pendant 10 sec, et incubation à température ambiante pendant 30 min.
4. Neutraliser l'ADN dénaturé en ajoutant 175 pi de 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifuger pour 956 g pendant 10 sec et placer les échantillons sur la glace.
5. Préparer une dilution en série de l'entrée et de l'ADN immunoprécipité pour le slot dosage Blot comme décrit ci-dessous.
   1. Suivez les étapes 02.03 à 02.04 pour obtenir un volume total de l'échantillon de 350 pi (soit 50 Entrée ul / puce à ADN, NaOH 125 pi de 0,4, 175 pi 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
      Remarque: Pour l'instance indiqué ci-dessus, 45 ng d'ADN d'entrée finira par être 0,129 ng / ul.
   2. Pour l'ADN d'entrée, marquer trois tubess à 100, 50 et 25 et ajouter 100 ul, 50 ul et 25 ul de l'échantillon d'ADN dénaturé et neutralisé. Faites le volume final à 100 ul avec de l'eau sans nucléase. Pour la puce ADN, l'étiquette que trois tubes 200, 100 et 50 et ajouter 200 ul, 100 ul et 50 ul de l'échantillon d'ADN dénaturé et neutralisé. Faire un volume final de 200 pi avec de l'eau sans nucléase.
6. Couper la membrane à la taille de l'appareil Slot Blot. Pré-mouiller la membrane et buvards en 20x SSC avant et avant d'ajouter l'ADN. Assembler dans l'appareil de slot blot selon le protocole du fabricant.
7. Pipet ADN de l'étape 2.5.2 dans les fentes appropriées. Appliquez le vide lentement pour tirer l'ADN sur la membrane Zeta-sonde. Arrêtez vide après tous les échantillons ont transité par l'appareil.
   1. Démonter l'appareil immédiatement et immobiliser l'ADN sur la membrane en utilisant un agent de réticulation aux UV. Avoir le côté de l'ADN dans l'agent de réticulation UV et d'utiliser l'UAtocrosslink mise en l'agent de réticulation. Suivez le protocole du fabricant.
8. Détecter BrdU sur le slot blot en effectuant un transfert de Western.
   1. Bloquer la membrane avec 5% de lait sec non gras dans du PBS contenant 0,1% de Tween-20 (PBST) pendant une heure à température ambiante pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps sur la membrane.
   2. Ajouter anticorps primaire anti-BrdU (dilution 1: 500) dilué dans 1% de lait en poudre écrémé dans du PBST et incuber le blot avec l'anticorps primaire pendant 3 heures à température ambiante sur un agitateur. Laver la membrane avec du PBST trois fois après l'incubation de l'anticorps primaire.
   3. Ajouter un anticorps secondaire anti-souris conjugué à HRP à la tache (1: 5000 dilution) et incubation à température ambiante pendant 1 heure. Laver la membrane avec du PBST trois fois après l'incubation d'anticorps secondaire.
      REMARQUE: Utiliser un volume suffisant d'anticorps pour couvrir complètement la membrane pendant les incubations d'anticorps primaires et secondaires.
9. Préparer le mélange ECL et l'ajouter à l'AC blotcordonnet le protocole du fabricant. Incuber la membrane avec ECL mélange pendant 5 min à température ambiante.
   1. Placer la membrane dans une cassette de rayons X, exposer la membrane à la pellicule à rayons X et le développement du blot en utilisant le protocole du fabricant.
   2. Quantifier le signal obtenu pour la saisie et la numérisation de l'ADN Pucée après les blots en utilisant le logiciel Image J selon le protocole du fabricant. Pour la quantification, utiliser le signal qui est dans la gamme linéaire de détection, afin d'assurer la précision de la mesure.

Résultats

Pour déterminer la spécificité des inhibiteurs sélectifs HDAC1,2, Hdac1,2 ^{FL / FL et FL} HDAC3 ^{/ FL} cellules de fibrosarcome ont été utilisés. Recombinase Cre (Ad-Cre) contenant l'adénovirus a été utilisé pour supprimer Hdac1,2 et HDAC3 dans ces cellules. Après l'infection Ad-Cre de Hdac1,2 ^{FL / FL} cellules, on a observé une forte hausse de H4K5ac. L...

Discussion

Le protocole décrit dans ce manuscrit est une méthode relativement rapide pour démontrer la présence de protéines ou de leurs formes modifications post-traductionnelles sur l'ADN nouvellement répliqué ou naissant. En outre, cette technique permet à un pour mesurer les cinétiques association-dissociation d'une protéine ou sa forme modifiée avec de l'ADN naissant. Cette technique est complémentaire à l'élégant technologie iPOND ^13. Dans la technologie iPOND, l'ADN nouvellement...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators