Esame di proteine ​​legate al DNA Nascente in cellule di mammifero utilizzando la tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale

Riepilogo

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Abstract

Istone deacetilasi 1 e 2 (HDAC1,2) localizzano ai siti di replicazione del DNA. Nello studio precedente, utilizzando un inibitore selettivo e di un sistema atterramento genetica, abbiamo dimostrato le funzioni nuovi per HDAC1,2 nella progressione della forcella replica e nascente manutenzione cromatina in cellule di mammifero. Inoltre, abbiamo utilizzato una tecnica BrdU-chip-Slot-occidentale che combina immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di bromo-deossiuridina (BrdU) DNA -labeled con macchia slot e occidentale analisi per misurare quantitativamente proteine ​​o modificazione degli istoni associati con il DNA nascente.

Attivamente cellule in divisione sono state trattate con HDAC1,2 inibitore selettivo o trasfettate con siRNA contro HDAC1 e HDAC2 e quindi il DNA di nuova sintesi è stato etichettato con il bromodeossiuridina timidina analogico (BrdU). L'etichettatura BrdU è stata fatta in un punto di tempo in cui non c'era significativo arresto del ciclo cellulare o apoptosi a causa della perdita delle funzioni HDAC1,2. Seguendo lAbeling di cellule con BrdU, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di marchi di acetilazione degli istoni o la cromatina-remodeler è stata effettuata con anticorpi specifici. BrdU marcato DNA ingresso e l'immunoprecipitato (o chip) DNA è stato poi trasferite su una membrana con la tecnica di slot blot ed immobilizzati mediante UV. La quantità di DNA nascente in ciascuno slot è stata poi valutata quantitativamente mediante analisi Western con un anticorpo anti-BrdU. L'effetto della perdita di funzioni HDAC1,2 sui livelli di nuova sintesi degli istoni marchi acetilazione DNA associate e cromatina remodeler è stato quindi determinato normalizzando il segnale di BrdU-Chip ottenute dai campioni trattati ai campioni di controllo.

Introduzione

Riparazione del DNA difettosa e / o replicazione del DNA sono una delle principali cause di instabilità genomica, che può innescare la morte cellulare. Un singolo non riparato doppia interruzione filo è sufficiente a causare la morte delle cellule ^1. Organizzazione della cromatina è transitoriamente alterata sia in fase di replica e riparare ^2,3, e l'incapacità di mantenere le informazioni epigenetiche nel corso di questi processi si tradurrà in una minaccia per l'integrità del genoma. Perdita di HDAC3 o della funzione HDAC1,2 impedisce progressione fase S, la replicazione e riparazione del DNA che porta a stress genotossico (danni al DNA) e la morte delle cellule ^4-9. Si tratta quindi di una strategia pratica per usare inibitori HDAC selettivi di interrompere la replica, la riparazione e la cromatina in cellule tumorali e causare danni al DNA, che a sua volta può fermare la crescita e induce la morte cellulare selettivamente nelle cellule tumorali in rapida crescita.

Durante la replicazione del DNA, cromatina è rapidamente smontato e poi rimontato seguendo duplicazione del DNA. Recentemente synthesized istone H4 è acetilato a K5 e residui K12 (H4K5K12ac) e segue la deposizione sulla cromatina, sono rapidamente deacetilata da istone deacetilasi (HDAC) ^10,11. Fallimento di cellule per mantenere l'integrità della cromatina nascente da istoni deacetilazione può portare al collasso della forcella, che a sua volta può causare danni al DNA e la morte cellulare. Abbiamo recentemente dimostrato che l'inibizione selettiva di HDAC1,2 aumenta l'acetilazione degli istoni (H4K5ac, H4K12ac e H4K16ac) e inibisce l'attività SMARCA5 cromatina remodeler sulla cromatina nascente, che correla con una ridotta progressione forca di replicazione, aumentato crollo forchetta e aumentato la replica da stress danno al DNA ⁶ . Così, HDAC inibitore trattamento possono alterare la struttura della cromatina nascente per innescare danni al DNA e la morte molto rapidamente nelle cellule tumorali, in quanto questi ciclo cellule in rapida e passare più volte attraverso la fase S. E 'quindi importante capire come funzionano HDAC regolare acetilazione degli istoni e proteine ​​binding per mantenere la replicazione del DNA nelle cellule di mammifero.

Per misurare quantitativamente la quantità di acetilazione degli istoni e SMARCA5 remodeler cromatina associata con il DNA nascente durante la replicazione del DNA, abbiamo ideato un saggio ChIP modificato chiamato la tecnica di BrdU-Chip-Slot-occidentale. Dopo immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) di una proteina o istone modifica desiderata, la quantità di DNA nascente (all'etichetta analogico timidina, BrdU) nel campione chip può essere rilevato mediante analisi Western di DNA chip BrdU marcato trasferite su una membrana utilizzando un Slot Apparecchio Blot. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato che H4K16ac (un marchio coinvolta nella confezione cromatina) e il membro della famiglia ISWI SMARCA5 (regolatore actina-dipendente matrice associata SWI / SNF-correlata della cromatina) remodeler cromatina sono associati con il DNA nascente in cellule in fase S. ^6. Abbiamo anche trovato che il marchio nascente H4K16ac è deacetilata da HDAC1,2 durante la replicazione del DNA ^6. Inibisce H4K16acattività remodeler cromatina del familiare ISWI SMARCA5 ^12. Quindi, utilizzando la tecnica BrdU-CHIP-Slot-occidentale, potremmo collegare le funzioni per HDAC1,2 nel regolare il rimodellamento della cromatina durante la replicazione del DNA. Quindi, la tecnica BrdU-Chip-Slot-Western Blot è un approccio efficace per misurare quantitativamente l'associazione e dissociazione dinamica delle proteine ​​o loro modificazioni post-traslazionali che sono tenuti al DNA nascente.

Protocollo

1. immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in seguito BrdU etichettatura

1. Culture cellule NIH3T3 in presenza sia di DMSO o inibitori selettivi HDAC1,2 come descritto in precedenza ^6.
2. Dopo il trattamento con inibitori selettivi DMSO o HDAC1,2, aggiungere BrdU alle celle in una cappa coltura tissutale sterile. Incubare 2 x 10 ⁶ cellule NIH3T3 placcati in 10 ml mezzi NIH3T3 con una concentrazione finale di 20 mM di bromodeossiuridina (BrdU) per 60 min in una sterile 37 ° C coltura tissutale incubatore.
3. Crosslink proteine ​​intracellulari DNA aggiungendo formaldeide direttamente al mezzo di coltura ad una concentrazione finale di 1%. Incubare 2 x 10 ^{6 cellule} NIH3T3 con formaldeide a temperatura ambiente per 10 min su un agitatore.
4. Quench la reticolazione mediante l'aggiunta di glicina ad una concentrazione finale di 125 mM. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti su un agitatore.
5. Togliere la carta e raccogliere le cellule in PBS in una provetta da centrifuga da 15 ml. Spin cells a 956 xg per 5 minuti a 4 ° C. Lavare il pellet di cellule due volte con PBS freddo. Rimuovere PBS dal tubo. Conservare il pellet reticolato cellulare senza PBS (surnatante) a -80 ° C fino al momento dell'uso.
6. Preparare il lisato dal pellet cellulare reticolato aggiungendo tampone FA140 500 microlitri (50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% sodio desossicolato) integrato con inibitore della proteasi cocktail.
7. Taglio la cromatina dalle sonicazione dei campioni cinque volte al potere il 35% e con un impulso di 15 secondi, 0,9 secondi acceso e 0,1 secondi spento impostazione. Tenere le provette in ghiaccio dopo ogni turno di ultrasuoni per evitare il riscaldamento dei campioni.
   1. Controllare il taglio su un gel DNA come l'efficienza di taglio varierà tra i diversi sonicatori. Per controllare sonicazione, invertire reticolazione con l'aggiunta di NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e eseguire i passaggi 1.17.1. - 1.22. Esegui eluita 10 microlitri DNA su un gel di agarosio 1,5% per verificare se il taglio ètra 300-700 bp con una intensità media a 500 bp.
8. Dopo sonicazione, centrifugare i campioni per 10 min a 17.949 xga 4 ° C e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
   1. Eseguire la stima delle proteine ​​utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​commerciale secondo il protocollo del produttore. Utilizzare la stessa quantità di lisato per il chip di controllo e campioni sperimentali. In generale, utilizzare 1 mg di lisato totale per reazione chip.
9. Preparare 50% sospensione di proteina A-agarosio utilizzando tampone FA140 contenente inibitori delle proteasi cocktail. Aggiungere 1/10 volume del cocktail inibitore della proteasi. Calcolare il volume di perline necessari in base al numero di campioni in totale.
   1. Lavare perline Proteina A-agarosio con tampone FA140 due volte per rimuovere il tampone di conservazione e aggiungere un volume uguale di tampone FA140 ai talloni per fare 50% slurry.
   2. Per rimuovere le proteine ​​che non si legano specificamente ai talloni, aggiungere 50 ml di 50% sospensione di Proteina A-agarosio e incubate i campioni a 4 ° C con rotazione costante end-over-end in un mixer rosticceria per 30 min.
10. Spin i campioni a 956 xg a 4 ° C per un minuto. Raccogliere il surnatante ed eseguire immunoprecipitazione tramite l'aggiunta di 8 microlitri H4K16ac anticorpo o 5 ml (5 mg) di 1 mg / ml di anticorpo SMARCA5 il surnatante. Incubare a 4 ° CO / N con rotazione end-over-end costante in un mixer rosticceria.
11. Salva 1/10 ° di un estratto per il controllo 'input' e impostarlo come parte a -20 ° C. L'ingresso deve essere inverso reticolato con i campioni IP.
12. Utilizzare la stessa quantità di IgG di coniglio (5 ml di 1 mg / ml) come campione di controllo negativo immunoprecipitazione.
13. Il giorno seguente, aggiungere 50 ml di 50% proteina A-agarosio slurry all'estratto e incubare per 1 ora a 4 ° C con rotazione.
14. Pellet agarosio per centrifugazione a 956 xg per 2 minuti a 4 ° C, rimuovere con attenzione il surnatante e wash le perline con i seguenti buffer in sequenza. Nelle preparazioni tampone, aggiungere inibitori della proteasi a destra prima dell'uso.
    1. Lavare con sale basso Immune Complex tampone di lavaggio (FA140; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 140 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end.
    2. Lavare con Salt Immune Complex tampone di lavaggio ad alta (FA500; concentrazione finale di 50 mM di HEPES KOH pH 7.5, 500 mM di NaCl, 1 mM di EDTA (pH 8,0), 1% Triton-X-100 e 0,1% desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end.
    3. Lavare con LiCl Immune Complex tampone di lavaggio (concentrazione finale di 10 mM di Tris-Cl pH 8,0, 250 mM di LiCl, 0,5% e 0,5% NP40 desossicolato di sodio) per 5 minuti a 4 ° C con rotazione end-over-end.
15. Dopo lavaggi come descritto sopra, aggiungere 200 microlitri soluzione di eluizione (concentrazione finale di 1% SDS e 100 mM sodio bicarbonato) e incubate a temperatura ambiente per 15 min con rotazione end-over-end a RT.
16. Spin i campioni a 956 xg a RT e trasferire l'eluato in una nuova provetta da 1,5 ml. Ripetere il passaggio 1.15 con l'aggiunta di soluzione di eluizione 200 l.
17. Per 400 ml di eluato, aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M e mescolare bene.
    1. Inoltre, aggiungere la soluzione di eluizione 400 microlitri di 10 microlitri di ingresso che è stato allocato (passo 1.11) e aggiungere NaCl ad una concentrazione di 0,16 M di invertire campioni di ingresso reticolazione pure. Invertire reticolare i campioni incubando a 65 ° C bagnomaria per 5 ore.
18. Aggiungere 1 ml di 100% EtOH al eluato reverse-reticolato. Mescolare bene e incubare a -80 ° C per 2-3 ore oppure a -20 ° CO / N. Spin i campioni a 17.949 xg per 15 minuti e scartare l'etanolo.
19. Aggiungere 800 ml 70% di etanolo per lavare il pellet. Spin a 17.949 xg per 15 min a 4 ° C e scartare etanolo. Spin brevemente per rimuovere qualsiasi residuo di etanolo. Asciugare i campioni a 37 ° C per 10 min per rimuovere l'etanolo residuo.
20. Sciogliere in 90 microlitri DNA RNasi e DNasi acqua libera e aggiungere 2 microlitri 10 mg / ml RNasi a 0,2 mg / ml concentrazione finale. Incubare a 37 ° C a bagnomaria per 30 minuti.
21. Aggiungere 10 ml 10x Proteinase K Buffer (100 mM Tris-Cl pH 8.0, 50 mM EDTA pH 8.0, 5% SDS). Mescolare bene e aggiungere 1 ml proteinasi K. Incubare a 42 ° C per 1 ora.
22. Purificare ingresso e ChIP DNA usando commerciale kit di purificazione PCR secondo il protocollo del produttore ed eluire il DNA in 50 microlitri acqua. Conservare DNA a -20 ° C fino all'utilizzo.

2. Slot blot analisi del DNA ChIP

1. Misurare la resa di ingresso e di DNA ChIP eluito in 50 microlitri acqua come descritto al punto 1.22 utilizzando uno spettrofotometro a 280 nm secondo il protocollo del produttore.
2. Prendere volumi uguali (50 microlitri) di ingresso o di DNA immunoprecipitato che si trovano all'interno della gamma lineare di rilevamento.
   1. Ad esempio, se l'ingressoResa del DNA è di 1,5 ng / ml, poi prendere 30 ml (o 45 ng di DNA totale) e fare volume di 50 ml con acqua. Per fattore ChIP, prendere l'intero 50 microlitri eluato dal punto 2.1 e passare al punto 2.3.
3. Denaturare 50 microlitri di ingresso o DNA immunoprecipitato aggiungendo 2,5 volumi di 0,4 N NaOH, vortex brevemente e centrifugare per 956 xg per 10 sec, e incubare a temperatura ambiente per 30 min.
4. Neutralizzare il DNA denaturato con l'aggiunta di 175 ml di 1 M Tris-HCl, pH 6,8, vortex, centrifugare per 956 g per 10 secondi e posizionare i campioni sul ghiaccio.
5. Preparare una diluizione seriale di ingresso e di DNA immunoprecipitato per la Slot Blot test come descritto di seguito.
   1. Seguire i passaggi 2,3-2,4 per ottenere un volume totale di 350 microlitri del campione (ad esempio, 50 ml di ingresso / DNA ChIP, 125 ml 0,4 N NaOH, 175 ml 1 M Tris-HCl, pH 6,8).
      Nota: Per l'istanza indicato in precedenza, 45 ng di DNA ingresso finirà per essere 0,129 ng / ml.
   2. Per il DNA di ingresso, etichettare tre tubos come 100, 50 e 25 e aggiungere 100 ml, 50 ml e 25 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Rendere il volume finale a 100 ml con acqua priva di nucleasi. Per DNA chip, label tre tubi da 200, 100 e 50 e aggiungere 200 microlitri, 100 microlitri e 50 ml di campione di DNA denaturato e neutralizzato. Fai volume finale a 200 ml con acqua priva di nucleasi.
6. Tagliare la membrana alla dimensione dell'apparato Slot Blot. Pre-bagnare la membrana e carta assorbente in 20x SSC prima e prima di aggiungere DNA. Assemblarle nell'apparato macchia slot secondo il protocollo del produttore.
7. DNA pipetta dal punto 2.5.2 in apposite cave. Applicare il vuoto lentamente per tirare il DNA sulla membrana zeta-sonda. Arrestare vuoto dopo tutti i campioni sono passati attraverso l'apparecchio.
   1. Smontare l'apparato e immobilizzare immediatamente il DNA sulla membrana utilizzando un reticolante UV. Avere il lato del DNA nella reticolante UV e utilizzare il autocrosslink impostazione nel reticolante. Seguire il protocollo del produttore.
8. Rileva BrdU sulla macchia slot eseguendo western blotting.
   1. Bloccare la membrana con 5% di latte secco non grasso in PBS contenente 0,1% Tween-20 (PBST) per 1 ora a RT per prevenire il legame non specifico degli anticorpi alla membrana.
   2. Aggiungere anticorpo primario anti-BrdU (diluizione 1: 500) diluito nel latte secco non grasso 1% in PBST e incubare il blot con l'anticorpo primario per 3 ore a temperatura ambiente su un agitatore. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l'incubazione anticorpo primario.
   3. Aggiungere anticorpo secondario anti-topo HRP-coniugato alla macchia (1: 5.000 diluizione) e incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Lavare la membrana con PBST tre volte dopo l'incubazione anticorpo secondario.
      NOTA: utilizzare un volume sufficiente di anticorpi per coprire completamente la membrana durante l'incubazione anticorpi primari e secondari.
9. Preparare la miscela ECL e aggiungerlo alla ac macchiacondo protocollo del produttore. Incubare la membrana con mix ECL per 5 minuti a RT.
   1. Posizionare la membrana in una cassetta a raggi X, esporre la membrana alla pellicola a raggi X e sviluppare il blot usando il protocollo del produttore.
   2. Quantificare il segnale ottenuto per l'ingresso e il DNA chip dopo la scansione le macchie utilizzando il software Image J secondo il protocollo del produttore. Per la quantificazione, utilizzare il segnale che è all'interno del range lineare di rilevamento al fine di garantire la precisione della misurazione.

Risultati

Per determinare la specificità degli inibitori selettivi HDAC1,2, sono stati utilizzati Hdac1,2 ^{FL / FL} e HDAC3 ^{FL / FL} cellule fibrosarcoma. -Adenovirus contenenti Cre ricombinasi (Ad-Cre) è stato utilizzato per eliminare Hdac1,2 e HDAC3 in queste cellule. A seguito di infezione Ad-Cre di Hdac1,2 ^{FL / FL} cellule, è stato osservato un robusto incremento della H4K5ac. Il trattamento dell...

Discussione

Il protocollo descritto in questo manoscritto è un metodo relativamente veloce per dimostrare la presenza di proteine ​​o loro forme post-traduzionali modificati sul DNA appena replicato o nascente. Inoltre, questa tecnica permette uno per misurare la cinetica di associazione-dissociazione di una proteina o la sua forma modificata con il DNA nascente. Questa tecnica è complementare alla elegante tecnologia iPOND ^13. Nella tecnologia iPOND, il DNA di nuova sintesi è etichettato con deossiuridina etile (...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators