Экспертиза белков, связанных с ДНК находятся в стадии становления в клетках млекопитающих, используя BrdU-чип-Slot-Западная Техника

Резюме

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

Аннотация

Гистондезацетилаз 1 и 2 (HDAC1,2) локализуются в местах репликации ДНК. В предыдущем исследовании, используя селективный ингибитор и генетическую систему нокдаун, мы показали новые функции для HDAC1,2 в репликации прогрессии вилкой и зарождающейся обслуживания хроматина в клетках млекопитающих. Кроме того, мы использовали технику BrdU-чип-Slot-Западный, который сочетает хроматина иммунопреципитацию (чип) в бром-дезоксиуридина (BrdU), меченным ДНК с игрового блоттинга и Западной анализирует количественно измерить белки или модификацию гистонов, связанные с зарождающейся ДНК.

Активно делящиеся клетки обрабатывали селективного ингибитора HDAC1,2 или трансфицировали киРНК против Hdac1 и HDAC2, а затем вновь синтезированный ДНК метили с аналог тимидина бромдезоксиуридина (BrdU). BrdU маркировки было сделано в момент времени, когда не было никакого значительного клеточного цикла или апоптоз из-за потери функций HDAC1,2. После лabeling клеток с BrdU, иммунопреципитация хроматина (чип) ацетилирования гистонов марок или хроматина Remodeler была выполнена со специфическими антителами. BrdU-меченых ДНК вход и иммунопреципитировали (или ChIPed) ДНК затем наносили на мембрану с использованием метода слот-блоттинга и обездвижен с помощью УФ. Количество ДНК возникающей в каждом слоте затем количественно оценивали с помощью Вестерн-анализа с анти-BrdU антителами. Эффект потери HDAC1,2 функций на уровне вновь синтезированных ДНК-ассоциированных ацетилирование гистонов знаков и хроматина Remodeler Затем определяли путем нормализации сигнала BrdU-чипе, полученный из обработанных образцов на контрольных образцах.

Введение

Неисправный репарации ДНК и / или репликация ДНК являются основной причиной нестабильности генома, которые могут вызвать гибель клеток. Один без ремонта двойной брейк прядь достаточно, чтобы вызвать гибель клеток ^1. Хроматина организация временно изменены во время репликации как и ремонт ^2,3, и неспособность поддерживать эпигенетической информации во время этих процессов приведет к угрозе целостности генома. Потеря HDAC3 или функции HDAC1,2 препятствует S-фазе прогрессирования, репликацию ДНК и ремонт, ведущий к генотоксичного стресса (повреждение ДНК) и гибели клеток ^4-9. Таким образом, это практично использовать стратегию ингибиторы HDAC селективные нарушить репликации, ремонт и хроматин в раковых клетках и вызывают повреждение ДНК, что в свою очередь может остановить рост и индукции гибели клеток избирательно в быстро растущих раковых клеток.

Во время репликации ДНК, хроматин быстро разобрали, а затем собраны следующие дублирования ДНК. Недавно SYnthesized гистона Н4 ацетилированный в K5 и K12 остатков (H4K5K12ac) и после осаждения на хроматина, они быстро деацетилируется по гистондезацетилаз (HDACs) ^10,11. Отказ клеток для поддержания целостности зарождающегося хроматина гистона дезацетилирования может привести к краху вилкой, которая в свою очередь может привести к повреждению ДНК и гибели клеток. Мы недавно показали, что селективное ингибирование HDAC1,2 увеличивает ацетилирование гистонов (H4K5ac, H4K12ac и H4K16ac) и ингибирует SMARCA5 хроматина Remodeler деятельность на зарождающейся хроматина, которая коррелирует с уменьшением прогрессирования вилкой репликации, увеличение вилки крах и увеличение репликации стресс-индуцированной повреждение ДНК ⁶ , Таким образом, обработка ингибитором HDAC может изменить зарождающийся структуру хроматина, чтобы вызвать повреждение ДНК и смерть очень быстро в раковых клетках, так как эти клетки цикла быстро и многократно проходить через S-фазе. Поэтому важно, чтобы понять, как функционируют HDACs регулировать ацетилирование гистонов и белка биндинг поддерживать репликацию ДНК в клетках млекопитающих.

Для количественного измерения количества ацетилирования гистонов и SMARCA5 хроматина Remodeler, связанной с зарождающейся ДНК во время репликации ДНК, мы разработали модифицированный чип анализ называется BrdU-чип-слот-западный технику. После иммунопреципитации хроматина (чип) желаемого белка или модификации гистонов, количество возникающей ДНК (обозначенный с помощью аналог тимидина, BrdU) в образце чип может быть обнаружен с помощью Вестерн-анализа с BrdU-меченых ДНК-чип переносили на мембрану с использованием щелевой Клякса аппарат. Используя эту технику, мы показали, что H4K16ac (отметка участвует в хроматина упаковки) и член ISWI семьи SMARCA5 (SWI / SNF, связанных с матрицей-ассоциированной актина-зависимой регулятором хроматина) хроматина перемодельер связаны с возникающей ДНК в S-фазе клеток ^6. Мы также обнаружили, что зарождающаяся H4K16ac знак деацетилируется по HDAC1,2 во время репликации ДНК ^6. H4K16ac ингибируетхроматина перемодельер деятельность члена семьи ISWI SMARCA5 ^12. Отсюда, используя технику BrdU-ЧИП-Slot-Западный, мы могли бы соединить функции для HDAC1,2 в регулировании ремоделирования хроматина во время репликации ДНК. Следовательно, методика BrdU-чип-слот-Вестерн-блот является мощным подход для количественного измерения динамики ассоциации и диссоциации белков или их пост-трансляционных модификаций, которые связаны с нарождающейся ДНК.

протокол

1. иммунопреципитации хроматина (чип) после BrdU маркировки

1. Культура клеток NIH3T3 в присутствии либо ДМСО или HDAC1,2-селективных ингибиторов, как описано ранее ^6.
2. После лечения с селективных ингибиторов ДМСО или HDAC1,2, добавить BrdU в клетки в стерильной капот культуры ткани. Инкубируют 2 х 10 ⁶ клеток NIH3T3 засевали в 10 мл среды с NIH3T3 20 мкМ конечной концентрации бромдезоксиуридина (BrdU) в течение 60 мин в стерильный 37 ° C инкубаторе тканевых культур.
3. CrossLink внутриклеточными белками с ДНК путем добавления формальдегида непосредственно в культуральную среду в конечной концентрации 1%. Инкубируют 2 х 10 ⁶ клеток NIH3T3 с формальдегидом при комнатной температуре в течение 10 мин в шейкере.
4. Гасят сшивание путем добавления глицина до конечной концентрации 125 мМ. Инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин в шейкере.
5. Удалить СМИ и сбора клеток в PBS в 15 мл центрифужную пробирку. Спин челLs 956 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Промыть осадок клеток в два раза охлажденным на льду PBS. Удалить PBS из трубки. Хранить сшитый осадок клеток без PBS (супернатант) при температуре -80 ° С до использования.
6. Подготовка лизат из сшитого осадок клеток путем добавления 500 мкл FA140 буфера (50 мМ HEPES KOH, рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1% Тритон-Х-100 и 0,1% дезоксихолат натрия) дополнить ингибитором протеазы коктейль.
7. На сдвиг хроматина обработкой ультразвуком образцов в пять раз на 35% мощности, а также с 15 сек импульсом 0,9 сек и 0,1 на сек выключения настройки. Держите труб на льду после каждого раунда ультразвуком, чтобы избежать нагрева образцов.
   1. Проверьте сдвиг в геле ДНК как эффективности сдвига будет меняться между различными sonicators. Чтобы проверить ультразвуком, обратный поперечных связей путем добавления NaCl до концентрации 0,16 М в и выполните шаги 1.17.1. - 1,22. Выполнить элюировали 10 мкл ДНК на 1,5% агарозном геле, чтобы проверить, является ли сдвигового усилия составляетмежду 300 - 700 пар оснований со средней интенсивностью при 500 п.н..
8. После обработки ультразвуком образцов центрифуги в течение 10 мин при 17,949 мкг при 4 ° С и супернатант передачи в новую пробирку.
   1. Выполните оценку белка с помощью коммерческого анализа белка комплект в соответствии с протоколом производителя. Используйте равное количество лизата для чип контроля и экспериментальных образцов. Как правило, используют 1 мг общего лизата в реакции чипе.
9. Подготовка 50% суспензии белковых А-агарозы с использованием буфера, содержащего FA140 ингибитор протеазы коктейль. Добавить 1/10 объема ингибитором протеазы коктейль. Рассчитать объем бусин, необходимых в зависимости от количества образцов в целом.
   1. Вымойте белок А-агарозы бусины с FA140 буфера в два раза, чтобы удалить буфер для хранения и добавляют равный объем буфера для FA140 с шариками, чтобы сделать 50% суспензии.
   2. Чтобы удалить белки, которые неспецифически св зываютс с шариками, добавить 50 мкл 50% суспензии белка в-агарозы и вcubate образцов при 4 ° С при постоянном вращении конечного над-конца в гриль смесителе в течение 30 мин.
10. Спин образцов при 956 х г при 4 ° С в течение минуты. Собирают супернатант и выполнения иммунопреципитации путем добавления или 8 мкл H4K16ac антитело или 5 мкл (5 мкг) 1 мг / мл антитела к SMARCA5 супернатанта. Выдержите при 4 ° CO / N с постоянным конец поверх конца вращения в гриль смесителя.
11. Сохранить 1/10 экстракта для управления «вход» и установить его в качестве в сторону при -20 ° С. Входной должна быть обратной сшитого вместе с образцами IP.
12. Использование равное количество кролика IgG (5 мкл 1 мг / мл) в качестве отрицательного контрольного образца иммунопреципитации.
13. На следующий день, добавить 50 мкл 50% белка A-агарозы суспензии экстракта и инкубируют в течение 1 ч при 4 ° С с вращением.
14. Гранул агарозном бисером центрифугированием при 956 мкг в течение 2 мин при 4 ° С, осторожно удалите супернатант и ваш бисер со следующими буферами последовательно. В буферных препаратов, добавить ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
    1. Промыть низким содержанием соли иммунного комплекса промывочного буфера (FA140; конечной концентрации 50 мМ HEPES KOH рН 7,5, 140 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1% Тритон-Х-100 и 0,1% дезоксихолат натрия) для 5 мин при 4 ° С с конечным над концевой вращения.
    2. Промыть высоким содержанием соли иммунного комплекса промывочного буфера (FA500; конечной концентрации 50 мМ HEPES KOH рН 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА (рН 8,0), 1% Тритон-Х-100 и 0,1% дезоксихолат натрия) для 5 мин при 4 ° С с конечным над концевой вращения.
    3. Промыть LiCl иммунного комплекса промывочного буфера (конечная концентрация 10 мМ Трис-Cl рН 8,0, 250 мМ LiCl, 0,5% NP40 и 0,5% дезоксихолат натрия) в течение 5 мин при 4 ° С с конечным над концевой вращения.
15. После промывок, как описано выше, добавляют 200 мкл раствора элюции (конечная концентрация 1% SDS и 100 мМ бикарбоната натрия) и incubatе при комнатной температуре в течение 15 мин с терминальной над концевой вращения при комнатной температуре.
16. Спин образцов при 956 х г при комнатной температуре и передачи элюата в новую пробирку 1,5 мл. Повторите шаг 1,15 с дополнительным 200 мкл раствора для элюирования.
17. К 400 мкл элюата, добавить NaCl до концентрации 0,16 М в и хорошо перемешать.
    1. Кроме того, добавление 400 мкл раствора элюции 10 мкл вход, который был установлен в сторону (шаг 1,11) и добавить NaCl до концентрации 0,16 М в обратном поперечных чтобы входные выборки, а также. Обратный сшивания образцы путем инкубации в 65 ° С на водяной бане в течение 5 ч.
18. Добавить 1 мл 100% этанола в обратном сшитого элюата. Все хорошо перемешать и инкубировать при температуре -80 ° С в течение 2 - 3 часов или при -20 ° CO / N. Спин образцов при 17,949 х г в течение 15 мин и отбросить этанола.
19. Добавить 800 мкл 70% этанола мыть гранул. Спин в 17,949 мкг в течение 15 мин при 4 ° С и отбросить этанола. Кратко спина, чтобы удалить остатки этанола. Воздух-высушить образцы при 37 ° С в течение 10 мин для удаления остатков этанола.
20. Растворите ДНК в 90 мкл РНКазы и ДНКазы воду и добавить 2 мкл 10 мг / мл РНКазы при 0,2 мг / мл конечной концентрации. Инкубируют при 37 ° С на водяной бане в течение 30 мин.
21. Добавьте 10 мкл 10х буфера протеиназы К (100 мМ Трис-Cl рН 8,0, 50 мМ ЭДТА, рН 8,0, 5% SDS). Все хорошо перемешать и добавить 1 мкл протеиназы К. Инкубировать при 42 ° С в течение 1 ч.
22. Очищают ввода и ДНК-чип с использованием коммерческого набора для очистки ПЦР в соответствии с протоколом производителя и элюирования ДНК в 50 мкл воды. Магазин ДНК при -20 ° С до дальнейшего использования.

2. Слот-блот анализ ДНК-чип

1. Измерение выхода входа и ДНК-чип, элюированной в 50 мкл воды, как описано в шаге 1,22 с использованием спектрофотометра при 280 нм в соответствии с протоколом производителя.
2. Возьмем равные объемы (50 мкл) ввода или иммунопреципитации ДНК, которые в пределах линейного диапазона детектирования.
   1. Например, если входнойВыход ДНК 1,5 нг / мкл, а затем взять 30 мкл (или 45 нг полной ДНК) и сделать громкость на 50 мкл с водой. Для фактора чип, взять всю 50 мкл элюата со стадии 2.1, и перейдите к шагу 2.3.
3. Денатурация при 50 мкл ввод или иммунопреципитации ДНК добавлением 2,5 объема 0,4 N NaOH, быстро вихря и центрифуги для 956 мкг в течение 10 сек, и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Нейтрализовать денатурированной ДНК добавлением 175 мкл 1 М Трис-HCl, рН 6,8, вихрь, центрифуги для 956 мкг в течение 10 сек и поместить образцы на льду.
5. Приготовьте серийное разведение ввода и иммунопреципитации ДНК для слота блоттинга, как описано ниже.
   1. Последующие шаги 2.3 - 2.4, чтобы получить общий объем пробы 350 мкл (то есть, 50 мкл Входное / ДНК-чип, 125 мкл 0,4 Н NaOH, 175 мкл 1 М Трис-HCl, рН 6,8).
      Примечание: Для экземпляра указано выше, 45 нг ДНК ввода будет в конечном итоге 0,129 нг / мкл.
   2. Для ввода ДНК, маркировать три трубкис, как 100, 50 и 25 и добавление 100 мкл, 50 мкл и 25 мкл денатурированного и нейтрализовали образца ДНК. Сделать окончательный объем до 100 мкл с нуклеазы без воды. Для ДНК-чип, этикетки три трубы, как 200, 100 и 50 и 200 мкл, 100 мкл и 50 мкл денатурированного и нейтрализованного образца ДНК. Сделать окончательный объем до 200 мкл с нуклеазы свободной воды.
6. Сокращение мембрану с размером слот-блот в аппарате. Предварительно смочите мембрану и истребив учением бывшее документы в 20х SSC до и перед добавлением ДНК. Соберите их в слот-блот устройства в соответствии с протоколом производителя.
7. Внесите ДНК из стадии 2.5.2 в соответствующие слоты. Применить вакуум медленно тянуть ДНК на мембране дзета-зонда. Остановка вакуум после всех образцов прошли через устройство.
   1. Разборка устройства и сразу же иммобилизации ДНК на мембране с помощью УФ-сшивающий агент. Имейте сторону ДНК в УФ сшивателя и использовать АСtocrosslink установки в сшивающего агента. Следуйте протокол производителя.
8. Обнаружение BrdU на слот-блоттинга, выполняя Вестерн-блоттинга.
   1. Блок мембрану с 5% обезжиренным сухим молоком в PBS, содержащем 0,1% Твин-20 (PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител к мембране.
   2. Добавить первичного анти-BrdU антитела (1: 500 разведение), разбавленного в 1% обезжиренным сухим молоком в PBST и инкубируют блот с первичным антителом в течение 3 ч при комнатной температуре на шейкере. Промыть PBST мембраны с три раза после инкубации первичных антител.
   3. Добавить HRP-конъюгированного анти-мыши вторичные антитела к блот (1: 5000 разведение) и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Вымойте мембраны с PBST три раза после вторичной инкубации антитела.
      Примечание: С помощью достаточного объема антител, чтобы полностью покрыть мембрану во инкубации первичных и вторичных антител.
9. Подготовьте смесь ECL и добавить его в пятно переменного токась с протоколом производителя. Инкубируйте мембраны с ECL смеси в течение 5 мин при комнатной температуре.
   1. Поместите мембрану в рентгеновской кассеты, подвергать мембрану к рентгеновской пленке и развивать кляксу, используя протокол производителя.
   2. Количественно сигнал, полученный для ввода и ДНК ChIPed после сканирования пятна с помощью изображения J программного обеспечения в соответствии с протоколом производителя. Для количественного определения используют сигнал, который в пределах линейного диапазона детектирования того, чтобы обеспечить точность измерений.

Результаты

Чтобы определить специфику HDAC1,2-селективных ингибиторов, были использованы Hdac1,2 ^{FL / FL} и ^FL Hdac3 ^{/ FL} клеток саркомы. Аденовирус, содержащий рекомбиназу Cre (AD-CRE) был использован для удаления Hdac1,2 и Hdac3 в этих клетках. После объявления-Cr...

Обсуждение

Протокол, описанный в этой рукописи является относительно быстрым способом, чтобы продемонстрировать наличие белков или их посттрансляционно модифицированных форм на новореплицированные или возникающей ДНК. Кроме того, этот метод позволяет возможность измерять ассоциации-диссоциа...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators