BrdUでのChIP-スロット西洋技術を用いて哺乳動物細胞中で新生DNAに結合したタンパク質の検討

要約

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.

要約

ヒストンデアセチラーゼ1と2（HDAC1,2）は、DNA複製の部位に局在化します。以前の研究では、選択的阻害剤や遺伝子ノックダウンシステムを使用して、我々は複製フォークの進行および哺乳動物細胞における発生期のクロマチン維持にHDAC1,2のための新規な機能を示しました。さらに、当社は、スロットブロットでブロモデオキシウリジン（BrdUの）標識DNAのクロマチン免疫沈降（チップ）を組み合わせた、西洋を定量的に発生期のDNAに関連するタンパク質やヒストン修飾を測定するために分析したBrdU・チップ・スロット西洋技術を使用していました。

活発に分裂する細胞がHDAC1,2選択的阻害剤で処理されたか、HDAC1とHDAC2に対するsiRNAをトランスフェクトし、その後、新たに合成されたDNAはチミジンアナログブロモデオキシウリジン（BrdUの）で標識したました。有意な細胞周期停止またはHDAC1,2機能の喪失によるアポトーシスが存在しない場合は、BrdU標識の時点で行いました。続いリットルBrdUで細胞をabeling、ヒストンアセチル化マークまたはクロマチンremodelerのクロマチン免疫沈降（チップ）は、特異的抗体を用いて行きました。 BrdUで標識された入力DNA及び免疫沈降（またはChIPed）次に、DNAをスロットブロット法を用いて膜上にスポットし、UVを使用して固定化しました。各スロット内の新生DNAの量を定量的に抗BrdU抗体を用いてウエスタン分析を用いて評価しました。新たに合成されたDNAに関連するヒストンのアセチル化とクロマチンマークremodelerのレベルにHDAC1,2機能の損失の影響は、その後、対照サンプルに処理されたサンプルから得られたBrdUチップ信号を正規化することによって決定しました。

概要

欠陥のあるDNA修復および/またはDNAの複製は、細胞死を引き起こすことができ、ゲノムの不安定性の主要な原因です。単一の未修復の二本鎖切断は、細胞死の^{1を引き起こす}のに十分です。クロマチン組織は一過性複製および修復^2,3の両方中に変更され、これらのプロセスの間にエピジェネティックな情報を維持するために失敗は整合性をゲノムに対する脅威になります。 HDAC3またはHDAC1,2機能の喪失は、遺伝毒性ストレス（DNA損傷）および細胞死をもたらす^4-9 S期の進行、DNA複製および修復を妨げます。したがって、癌細胞において複製、修復およびクロマチンを崩壊し、順番に成長を止めることができ、急速に成長する癌細胞において選択的に細胞死を誘導するDNA損傷を引き起こすために選択的HDAC阻害剤を使用する実用的な戦略です。

DNA複製時には、クロマチンは急速に分解され、その後のDNA複製次再組み立て。新しくSYnthesizedヒストンH4がクロマチン上にK5とK12残基（H4K5K12ac）、以下の堆積でアセチル化され、それらは急速にヒストン脱アセチル化酵素^{（HDAC）10,11}によって脱アセチル化されています。ヒストン脱アセチル化により新生クロマチンの完全性を維持するために、細胞の障害は、次に、DNA損傷および細胞死をもたらすことができ、フォークの崩壊をもたらすことができます。我々は最近、HDAC1,2の選択的阻害が増加し、ヒストンアセチル化（H4K5ac、H4K12acとH4K16ac）と減少した複製フォークの進行と相関する初期のクロマチン、上SMARCA5クロマチンremodeler活性を阻害することが示されたフォークの崩壊を増加させ、複製ストレスによって誘導されるDNA損傷^6を増加します。したがって、HDAC阻害剤治療は、急速に、これらの細胞サイクルとして、癌細胞中で非常に迅速にDNA損傷および死を誘発し、S期を通して何度も通過する新生クロマチン構造を変化させることができます。これは、HDACはヒストンアセチル化とタンパク質ビンディを規制するように機能する方法を理解することが重要ですNGは、哺乳動物細胞におけるDNAの複製を維持します。

定量的にDNA複製時に発生期のDNAに関連するヒストンアセチル化とSMARCA5クロマチンremodelerの量を測定するために、我々は、変更されたChIPアッセイを考案したBrdU・チップ・スロット西洋技術と呼ばれます。所望のタンパク質またはヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（チップ）以下、チップサンプルにおける（チミジンアナログのBrdUを用いて標識）新生DNAの量は、スロットを使用して膜上に移したBrdU標識のChIP DNAのウェスタン分析を用いて検出することができますブロット装置。この技術を用いて、我々はH4K16ac（クロマチンパッケージングに関与マーク）とISWIファミリーメンバーSMARCA5（クロマチンのSWI / SNF関連マトリックス関連アクチン依存調節因子）クロマチンremodelerは、S期細胞における発生期のDNAと関連していることが示されました^6。我々はまた、新生H4K16acマークがDNA複製⁶中HDAC1,2によって脱アセチル化されることがわかりました。 H4K16acの阻害ISWIファミリーメンバーSMARCA5 ¹²のクロマチンremodeler活動。したがって、BrdUを-CHIP-スロット西洋の技術を用いて、我々は、DNA複製の際にクロマチンリモデリングの調節にHDAC1,2ための機能を接続することもできます。したがって、BrdUでのChIP-スロットウエスタンブロット法は、定量的に発生期のDNAに結合しているタンパク質またはそれらの翻訳後修飾の会合および解離のダイナミクスを測定するための強力なアプローチです。

プロトコル

1.クロマチン免疫沈降（チップ）は、次のBrdU標識

1. DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤のいずれかの存在下で培養NIH3T3細胞は、先に説明したように^6。
2. DMSOまたはHDAC1,2選択的阻害剤で処理した後、滅菌組織培養フード中の細胞にBrdUを追加します。無菌の37℃の組織培養インキュベーター中で60分間ブロモデオキシウリジン20μMの最終濃度（のBrdU）を10ミリリットルNIH3T3培地にプレーティングし、2×10 ⁶のNIH3T3細胞をインキュベートします。
3. 1％の最終濃度で培養培地に直接ホルムアルデヒドを添加することによりDNAの架橋は、細胞内タンパク質。シェーカー上で室温で10分間ホルムアルデヒドと2×10 ⁶ NIH3T3細胞をインキュベートします。
4. 125mMの最終濃度のグリシンを添加することによって架橋をクエンチしました。シェーカー上で室温で5分間インキュベートします。
5. メディアを取り出し、15 ml遠心チューブにPBSで細胞を集めます。スピンCEL4℃で5分間、956×gでのls。氷冷PBSで2回細胞ペレットを洗浄します。チューブからPBSを削除します。使用するまで-80℃でPBS（上清）なしの架橋された細胞ペレットを保管してください。
6. 500μlのFA140緩衝液を添加することにより架橋細胞ペレットから溶解物を調製し（50 HEPES KOHのmMのpHは7.5、NaClを140 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）に、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウム）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。
7. サンプルを35％の電力で、15秒のパルスで5回、0.9秒、0.1秒オフの設定を超音波処理することによってクロマチンをせん断。サンプルの加熱を避けるために、超音波処理のすべてのラウンド後、氷上でチューブを保管してください。
   1. 断片化の効率が異なる超音波処理間で変化するようなDNAのゲル上でせん断を確認してください。超音波処理を確認するには、0.16 Mの濃度に塩化ナトリウムを加えることによって、架橋を逆転し、手順1.17.1を実行します。 - 1.22。ランは、剪断があるかどうかを確認するために、1.5％アガロースゲル上に10μlのDNAを溶出しました500塩基対での平均強度との塩基対700から300の間。
8. 4℃、17949×gで10分間、超音波処理、遠心分離サンプルに従い、上清を新しいチューブに移します。
   1. 製造業者のプロトコルに従って市販のタンパク質アッセイキットを用いてタンパク質の推定を行います。対照及び実験サンプルのチップ用の溶解物の同量を使用してください。一般的に、チップの反応あたりの総溶解液1mgを使用しています。
9. プロテアーゼ阻害剤カクテルを含むFA140緩衝液を用いてプロテインAアガロースの50％スラリーを調製。プロテアーゼ阻害剤カクテルの1/10量を追加します。総サンプル数に基づいて、必要とされるビーズの量を計算します。
   1. 二回保存バッファーを除去し、50％のスラリーを作るためにビーズにFA140バッファに等しい容量を追加するFA140緩衝液でプロテインAアガロースビーズを洗浄します。
   2. 、非特異的にビーズに結合するタンパク質を除去するプロテインAアガロースの50％スラリーと50μLを追加します30分間のロティサリーミキサーに一定の転倒回転させながら4℃でサンプルをcubate。
10. 分間、4℃で956×gでサンプルをスピン。上清を収集し、上清に1 mg / mlのSMARCA5抗体8μlのH4K16ac抗体または5μL（5μgの）のいずれかを追加することにより、免疫沈降を行います。ロティサリーミキサーに一定の転倒回転で4度のCO / Nでインキュベートします。
11. 「入力」制御のための抽出物の1/10を保存し、-20℃のような横に置いておきます。入力は、逆IPサンプルと一緒に架橋される必要があります。
12. 陰性対照免疫沈降サンプルとしてウサギIgG（1 mg / mlの5μlの）の同量を使用してください。
13. 次の日に、抽出物を50％のプロテインAアガローススラリー50μlのを追加し、回転させながら4℃で1時間インキュベートします。
14. 4℃で2分間、956×gの遠心分離によってアガロースビーズをペレット化、慎重に上清とWAを削除順次以下の緩衝液でビーズをshに。バッファの準備では、使用直前にプロテアーゼ阻害剤を追加します。
    1. 低塩免疫複合体洗浄緩衝液で洗浄し（FA140、pH7.5のHEPES KOHの最終濃度50mM、NaClを140 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）で、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウムの）のためにエンド - オーバー - エンド回転で4℃で5分間。
    2. 高塩免疫複合体洗浄緩衝液で洗浄し（FA500、pH7.5のHEPES KOHの最終濃度50mM、NaClを500 mMの、1mMのEDTA（pH8.0）で、1％トリトンX-100および0.1％デオキシコール酸ナトリウムの）のためにエンド - オーバー - エンド回転で4℃で5分間。
    3. LiClの免疫複合体の洗浄バッファー転倒回転させながら4℃で5分間（トリス-Cl pH8.0の、塩化リチウムの250 mMの、0.5％NP40および0.5％デオキシコール酸ナトリウムの最終濃度10mM）で洗浄します。
15. 上記のように回洗浄した後、200μlの溶出溶液（1％SDSおよび100 mMの重炭酸ナトリウムの最終濃度）とincubatを追加RTで転倒回転で15分間、室温での電子。
16. 室温で956×gでサンプルをスピンし、新しい1.5 mlチューブに溶出液を移します。追加の200μlの溶出溶液との手順を繰り返し1.15。
17. 溶出液の400μlに、0.16 Mの濃度になるように塩化ナトリウムを加え、よく混ぜます。
    1. また、取っておいた10μlの入力（ステップ1.11）に400μlの溶出溶液を追加し、同様に架橋入力サンプルを逆に0.16 Mの濃度に塩化ナトリウムを加えます。 5時間、65℃の水浴中でインキュベートすることによって、サンプルを架橋逆転。
18. 逆架橋溶出液に、100％エタノールを1mlを追加します。よく混ぜ、2のために-80℃でインキュベート - 3時間またはCO / N°-20で。 15分間17949×gでサンプルをスピンし、エタノールを捨てます。
19. ペレットを洗浄するために800μlの70％エタノールを追加します。 4℃で15分間、17949×gでスピンし、エタノールを捨てます。すべての残留エタノールを除去するために簡単にスピン。 1 37℃でサンプルを風乾し0分、残留エタノールを除去します。
20. 90μlのRNaseおよびDNaseを含まない水でDNAを溶解し、0.2 mg / mlの最終濃度で2μLの10mg / mlのRNaseを追加します。 30分間、水浴中で37℃でインキュベートします。
21. 10μlの10倍プロテイナーゼKバッファー（100mMのトリス-Cl pH8.0の、50mMのEDTA pH8.0の、5％SDS）を追加します。よく混ぜ、1時間42℃で1μlのプロテ​​イナーゼKインキュベートを追加します。
22. 製造業者のプロトコルに従って商業PCR精製キットを使用して入力し、チップDNAを精製し、50μlの水中にDNAを溶出します。さらに使用するまで-20℃で保存するDNA。

ChIPのDNAの2スロットブロット分析

1. 製造業者のプロトコルに従って、280nmで分光光度計を用いて、ステップ1.22で説明したように50μlの水中に溶出入力、チップDNAの収量を測定します。
2. 検出の直線範囲内にある入力の等容量（50​​μL）または免疫沈降したDNAを取ります。
   1. 例えば、入力の場合DNA収量は1.5 ngの/μlのは、その後（全DNA ngのまたは45）の30μlを取り、水で50μlにボリュームを作ることです。要因チップには、ステップ2.1からの全体の50μlの溶出液を取り、2.3に進みます。
3. 0.4 N NaOHを、短時間ボルテックスし、10秒間956 XGのための遠心分離機の2.5容量を追加することにより、50μlの入力または免疫沈降したDNAを変性させ、そして室温で30分間インキュベートします。
4. 10秒間956 XGのための1 Mトリス塩酸175μlの、pHが6.8、ボルテックス、遠心機を追加することにより、変性したDNAを中和し、氷上にサンプルを置きます。
5. 以下に説明するように、スロットブロットアッセイのために、入力の段階希釈し、免疫沈降したDNAを準備します。
   1. 350μL（ すなわち 、50μlの入力/チップ、DNA、125μlの0.4 N NaOHを、175μlの1 Mトリス塩酸、pHは6.8）の総サンプル体積を得るために2.4 -手順2.3に従ってください。
      注：上記の例では、入力されたDNAの45 ngが0.129 NG /μLになってしまうでしょう。
   2. インプットDNAの場合は、3チューブにラベルを付けますS 100、50、25と100μL、50μLと変性し、中和したDNAサンプルの25μlを添加するように。ヌクレアーゼフリー水を用いて100μlの最終容量にしてください。 ChIPのDNA、ラベルに200、100、50と200μlを添加するように3本のチューブ、100μlの、変性し、中和DNAサンプルを50μl。ヌクレアーゼを含まない水を用いて200μlの最終容量にします。
6. スロットブロット装置のサイズに膜をカットします。前の20倍のSSC中膜およびブロッティングペーパーをプリウェットとDNAを追加する前に。製造業者のプロトコルに従って、スロットブロット装置にそれらを組み立てます。
7. 適切なスロットにステップ2.5.2からのピペットのDNA。ゼータプローブ膜上にDNAを引っ張ってゆっくり真空を適用します。全てのサンプルが装置を通過した後、真空を停止します。
   1. 装置を分解し、直ちに紫外線架橋剤を用いて膜上にDNAを固定化します。 UVクロスリンカーでのDNA側を持って、AUを使用架橋剤に設定tocrosslink。製造業者のプロトコルに従ってください。
8. ウェスタンブロッティングを行うことにより、スロットブロット上のBrdUを検出します。
   1. PBS中脱脂粉乳5％が膜への抗体の非特異的結合を防ぐために、RTで1時間、0.1％のTween-20（PBST）を含有する膜をブロックします。
   2. PBST中脱脂粉乳1％に希釈し、シェーカー上で室温で3時間、一次抗体でブロットをインキュベート（1：500希釈）一次抗BrdU抗体を追加します。一次抗体のインキュベーション後PBSTで3回膜を洗ってください。
   3. ブロットをHRP結合抗マウス二次抗体を加える（1：5000希釈）と1時間室温でインキュベートします。二次抗体のインキュベーション後PBSTで3回膜を洗ってください。
      注：完全に一次および二次抗体のインキュベーション中に膜をカバーするために抗体の十分な量を使用してください。
9. ECLミ​​ックスを調製し、ブロット交流に追加製造業者のプロトコルによれ。 RTで5分間ECLミックスで膜をインキュベートします。
   1. 、X線カセットに膜を配置し、X線フィルムに膜を露出させ、製造業者のプロトコルを使用してブロットを開発。
   2. 製造業者のプロトコルに従ってイメージJソフトウェアを使用してブロットをスキャンした後、入力およびChIPedのDNAについて得られたシグナルを定量化します。定量化のために、測定の精度を確保するために、検出の直線範囲内にある信号を用います。

結果

HDAC1,2選択的阻害剤の特異性を決定するために、Hdac1,2 ^{FL / FLおよび} HDAC3 ^{FL / FL}線維肉腫細胞を用いました。アデノウイルス含有Creリコンビナーゼ（AD-のCre）は、これらの細胞においてHdac1,2とHDAC3を削除するために使用されました。 Hdac1,2 ^{FL / FL}の広告-Creを感染後 細胞は、H4K5acでロバストな増加が?...

ディスカッション

この原稿に記載されているプロトコルは、新たに複製または新生DNA上のタンパク質またはそれらの翻訳後修飾された形態の存在を実証するために、比較的迅速な方法です。さらに、この技術は、タンパク質又は新生DNAとその改変体の会合、解離速度を測定するために1つを可能にします。この技術は、エレガントiPOND技術¹³に相補的です。 iPOND技術では、新たに合成されたDNAは、エチル...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-BrdU (westerns)	BD Biosciences	B555627
Anti-SMARCA5	Abcam	ab3749
Anti-H4K16ac	Active Motif	39167
Zeta-Probe GT Membrane	Bio-Rad	162-0197
Formaldehyde	Fisher	BP531-500
Protein A agarose	Millipore	16-156
Rnase A	Qiagen	19101
Proteinase K	Sigma	P4850
PCR Purification Kit	Qiagen	28106
Glycine	Sigma	G7403
Protease inhibitor cocktail	Roche	11836170001
BrdU	Sigma	B9285
Rabbit IgG	Millipore	12-370
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma	S-3014
Triton-X-100	Sigma	93443
NP40	USB Corporation	19628
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
Sodium bicarbonate	Sigma	S-4019
Ethanol	Decon Laboratories	04-355-222
DEPC-treated water	Sigma	95284
Tris	Fisher	BP-152-5
EDTA	Invitrogen	15575-020
SDS	Ambion	AM9820
Sodium hydroxide	Mallinckrodt GenAR	MAL7772-06
20X SSC	Life Technologies	15557-036
Non-fat dry milk	Lab Scientific Inc	M0841
ECL	Thermo Fisher	80196
X-ray film	Genesee Sci	30-101
Developer	Konica Minolta	SRX-101A
UV Crosslinker	Stratagene	XLE-1000
Sonicator	Branson Sonifier  Digital Ultrasonic Cell Disruptor	Model: 450
Centrifuge	Eppendorf	Model: 5810R
Water bath	Fisher Scientific Isotemp	Model: 2322
NanoDrop 1000 spectrophotometer	ThermoScientific	Model: 1000
Slot Blot apparatus	Schleicher and Schuell Minifold II	44-27570
Tissue Culture Incubator	Thermo Scientific	Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators