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Resumen

El objetivo de este estudio es identificar las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos por delinear una técnica fiable inmunohistoquímico mediante la activación celular de c-fos para medir los cambios simultáneos en las vías de la dopamina y sitios de terminal después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas.

Resumen

Este estudio utiliza la activación celular de c-fos para evaluar los efectos de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en las vías de la dopamina del cerebro (DA) en ratas. La ingesta de azúcares y grasas están mediadas por sus atracciones innatas, así como las preferencias aprendidas. dopamina en el cerebro, especialmente meso-límbico y proyecciones meso-cortical desde el área tegmental ventral (ATV), ha sido implicado en estas dos respuestas sin letras y aprendido. El concepto de las redes cerebrales distribuidas, en la que varios sitios y sistemas emisor / péptidos interaccionan, se ha propuesto para mediar en la ingesta de alimentos sabrosos, pero no hay evidencia limitada que demuestra empíricamente este tipo de acciones. Por lo tanto, el consumo de azúcar provoca inmunorreactividad DA de liberación y aumenta c-fos-como (FLI) de las zonas individuales de proyección VTA DA incluyendo el núcleo accumbens (NAC), la amígdala (AMY) y la corteza prefrontal medial (mPFC), así como el cuerpo estriado dorsal. Además, la administración central de antagonistas de los receptores DA selectivos en estos sitioss diferencialmente reducir la adquisición y expresión de las preferencias de sabor acondicionado provocados por azúcares o grasas. Un método por el cual, para determinar si estos sitios interactuaron como una red cerebral distribuida en respuesta a la ingesta de azúcar o grasa sería simultánea evaluar si el VTA y sus principales zonas de proyección mesotelencefálica DA (prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo y la cubierta de la NAC, basolateral y centro-cortico-medial AMY), así como el cuerpo estriado dorsal mostraría coordinado y la activación FLI simultánea después de la ingesta oral, no condicionado de aceite de maíz (3,5%), glucosa (8%), fructosa (8%) y sacarina (0,2 %) soluciones. Este enfoque es un exitoso primer paso para identificar la viabilidad de utilizar la activación celular c-fos simultáneamente a través de los sitios relevantes del cerebro para estudiar el aprendizaje relacionado con la recompensa en la ingestión de alimentos palatable en roedores.

Introducción

Dopamina en el cerebro (DA) se ha implicado en respuestas centrales a la ingesta de azúcares de sabor agradable a través propuesto hedónica de 1,2, esfuerzo-relacionadas 3 y el hábito de base 4,5 mecanismos de acción. La vía DA primaria implicados en estos efectos se origina en el área tegmental ventral (ATV), y proyectos a la accumbens (NAC) núcleo y la cubierta, la amígdala basolateral y centro-cortico-medial (AMY), núcleo y el prelimbic y medial infralímbica corteza prefrontal (córtex prefrontal medial) (ver comentarios 6,7). El VTA ha sido implicada en la ingesta de sacarosa 8,9, y la liberación de DA es observado después de la ingesta de azúcar en el NAC 10-15, AMY 16,17 y mPFC 18-20. El consumo de grasas también estimula la liberación de DA NAC 21, y otro DA-rica zona de proyección con el cuerpo estriado dorsal (caudado-putamen) también se ha asociado con la alimentación mediada por DA 22,23. Kelley 24-27 propuso que estos proyectos múltipleszonas de iones de este sistema mediada por DA formaron una red cerebral distribuido integrado e interactivo a través de amplias e íntimas interconexiones 28-34.

Además de la capacidad de los antagonistas de los receptores DA D1 y D2 para reducir la ingesta de azúcares y grasas 35-37 38-40, la señalización de DA también se ha implicado en la mediación de la capacidad de los azúcares y las grasas para producir las preferencias de sabor acondicionado (PPC) 41- 46. La microinyección de un antagonista de los receptores D1 DA en el NAC, AMY o mPFC 47-49 eliminan adquisición de PPC provocada por la glucosa intragástrico. Mientras que microinyecciones de antagonistas de los receptores DA ya sea D1 o D2 en el córtex prefrontal medial elimina la adquisición de la fructosa-PPC 50, la adquisición y expresión de la fructosa-PPC están diferencialmente bloqueados por los antagonistas de DA en el NAC y AMY 51,52.

La técnica 53,54 c-fos se ha empleado para investigar activatio neuraln inducida por la ingesta de palatable y la activación neural. El término "activación de c-fos" se utiliza en todo el manuscrito, y se define operacionalmente por el aumento de la transcripción de c-Fos durante la despolarización neuronal. La ingesta de sacarosa aumentó fos-como inmunoreactividad (FLI) en el núcleo central AMY, el VTA, así como la cáscara, pero no del núcleo, de la NAC 55-57. Mientras que la ingesta de sacarosa en ratas sham-alimentación aumentado significativamente FLI en el AMY y la NAC, pero no el VTA 58, intragástrica de sacarosa o glucosa infusiones aumentaron significativamente FLI en el NAC y núcleos centrales y basolateral de la AMY 59,60. Además repetida de sacarosa para el acceso Chow programada aumentó FLI en el córtex prefrontal medial, así como la cáscara NAC y el núcleo 61. Un paradigma de reducción de marcha concentración de sacarosa reveló que los mayores incrementos FLI se produjeron en el AMY basolateral y NAC, pero no el VTA 62. Después del acondicionamiento, la extinción de rewa naturales relacionadas con el azúcarcomportamientos rd aumentaron FLI en el AMY basolateral y la NAC 63. Por otra parte, el emparejamiento de la disponibilidad de azúcar a un tono resultó en el tono, posteriormente, aumentar los niveles de FLI en el AMY basolateral 64. Ingesta alta en grasas también aumentó FLI en el NAC y mPFC sitios 65-67.

La mayoría de los estudios anteriormente citados examinaron los efectos de azúcar y grasa en la activación de c-fos en sitios individuales que no proporcionan información sobre la identificación de las redes cerebrales relacionadas con la recompensa distribuidos 24-27. Además, muchos de los estudios tampoco delinear las contribuciones relativas de las sub-áreas de la NAC (núcleo y la cubierta), AMY (basolateral y cortico-medial central) y el córtex prefrontal medial (prelimbic y infralímbica) que potencialmente podrían ser examinado por el ventaja de excelente, la resolución de una sola célula espacial en c-Fos mapeo 68. Nuestro laboratorio 69 utilizado recientemente la activación de c-fos y alteraciones medidos simultáneamente en la vía VTA DA y su prozonas Jection (NAC, Amy y mPFC) después de la novela de la ingestión de grasas y azúcares en ratas. El presente estudio describe los pasos procedimentales y metodológicos para analizar simultáneamente si la exposición aguda a seis soluciones diferentes (el aceite de maíz, glucosa, fructosa, sacarina, agua y un control de la emulsión de grasa) se diferencialmente activar FLI en sub-áreas de la NAC, AMY, mPFC así como el cuerpo estriado dorsal. Esta detección simultánea de diferencias permite la confirmación de efectos significativos en FLI en cada sitio y determinación en cuanto a si los cambios en un sitio particular, correlacionados con los cambios en los sitios relacionados, proporcionando de ese modo soporte para una red cerebral distribuido 24-27. Estos procedimientos probados si el VTA, el prelimbic y infralímbica córtex prefrontal medial, el núcleo y la cubierta de la NAC y el AMY basolateral y centro-cortico-medial), así como el cuerpo estriado dorsal exhibiría coordinada y activación FLI simultánea después de la ingesta oral, no condicionado de glucosa (8%), fructosa (8%), aceite de maíz (3,5%) y las soluciones de sacarina (0,2%).

Protocolo

Estos protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional que certifique que todas las materias y los procedimientos están de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Los sujetos

  1. Compra y / o raza ratas Sprague-Dawley (260 - 300 g,).
  2. Casa ratas individualmente en jaulas de malla de alambre. Su mantenimiento y su ciclo de 12:12 horas de luz / oscuridad con comida para ratas y agua disponible ad libitum.
  3. Asignar los tamaños de muestra apropiados (por ejemplo, n ≈ 6-8) aleatoriamente en grupos.

2. Aparatos y aceptación de las pruebas Procedimientos

  1. Utilice tubos de centrífuga calibrados con tapones de goma y un tubo de metal para sorber ángulo de 45 ° para proporcionar una medición precisa (± 0,1 ml) de las soluciones presentadas. Asegurarlas a las jaulas por un resorte metálico tenso para permitir la visibilidad de las calibraciones.
  2. Restringir las raciones de alimentos (~15 / g / día) de las ratas para reducir el peso a 85% de su peso corporal original para aumentar la motivación para consumir las soluciones. Nota: La reducción de peso debe tener entre 3 - 5 días.
  3. Proporcionar soluciones pre-formación (10 ml) de 0,2% sacarina durante cuatro días durante una sesión de 1 hora para maximizar la probabilidad de que las ratas tomarán muestras de las soluciones de ensayo posteriores con una latencia corta (menos de 1 min).
  4. Confirmar flujo a través del tubo de centrífuga derramando unas gotas.
  5. Pesar tubos antes y después de cada sesión de medición para obtener la ingesta.
  6. Realizar una prueba de admisión en el quinto día en los subgrupos que recibieron una de las seis soluciones (10 ml, 1 hr): a) agua, b) novela sabor (0,05% de aroma de cereza) 0,2% sacarina, c) 8% de fructosa, d) 8 % de glucosa, e) 3,5% de aceite de maíz en suspensión en 0,3% de goma de xantano, y f) 0,3% de goma de xantano.
  7. Asegúrese de que las soluciones nutritivas son isocalórico; Por lo tanto, la concentración de aceite de maíz 3,5% es isocalóricas a las soluciones de azúcar 8%.
  8. garantizar THen ratas soluciones de muestra con una latencia corta (menos de 1 min). Si no se cumple este requisito, entonces descartar el objeto del estudio.

3. Preparación del tejido

  1. Anestesiar a cada animal mediante una inyección intraperitoneal de pentobarbital 90 min después de la exposición inicial a cada solución de ensayo. Confirman que los animales estén correctamente anestesiados por lo que demuestra que el animal ya no es sensible a los reflejos tales como la retirada de pellizco pie, parpadeando tras la presión de la córnea directa o sacudir la cabeza a la estimulación del pabellón auricular profunda.
  2. Perfundir cada animal transcardially como se describió anteriormente 69.
    1. Anestesiar las ratas con una sobredosis de pentobarbital sódico (65 mg / kg), retire la caja torácica y exponer el pecho para el libre acceso al corazón 69.
    2. Coloque la aguja en el ápice de la válvula del corazón izquierdo, y cortar la vena cava. Administrar solución de tampón fosfato (PBS, ~ 180 ml) seguido de un co fijador tamponada con fosfatontaining 4% de paraformaldehído (~ 180 ml).
    3. Asegúrese de que el animal es en realidad ser perfundido correctamente examinando si el líquido está dejando otras cavidades, como la nariz, la boca y áreas genitales. Nota: la fijación adecuada con paraformaldehído estará acompañado por movimientos musculares grandes. Si esto no ocurre, vuelva a ajustar la aguja hasta que se produzca esta reacción.
  3. Retire el cerebro del cráneo rápidamente cortando la piel y la piel lejos del cráneo. Utilice unas pinzas para romper y retirar el hueso del cerebro se mueve de atrás hacia delante. El trabajo inicialmente en el área debajo y detrás del cerebelo, asegurando que la gubia es entre el hueso y la piamadre meníngea. Una vez que la parte superior y los lados del cráneo se eliminan, utilizar una pequeña espátula para levantar el cerebro de la base, y cortar los nervios craneales con unas tijeras pequeñas. Tenga cuidado de no dañar el cerebro al intentar retirar el hueso.
  4. Fijar los cerebros en una solución de paraformaldehído al 4% durante la noche a 4 ° C.Coloque los cerebros en una solución de sacarosa al 30% / 70% de PBS a temperatura ambiente hasta que se asientan en la parte inferior del recipiente.
  5. Bloquear el cerebro
    1. Retire la parte rostral del cerebro corte caudal transversalmente al bulbo olfatorio.
    2. Retire la parte caudal del cerebro cortar transversalmente a nivel del cerebelo y la protuberancia.
  6. Monte el cerebro coronal con la parte caudal fijo a la etapa de un micrótomo de deslizamiento, y cortaron secciones coronales (40 micras) a través del córtex prefrontal medial (2,86-2,20 mm rostral al bregma), el núcleo y la cáscara NAC y el cuerpo estriado dorsal (+ 1,76-1,60 mm rostral al bregma), el AMY (-2,12 a -2,92 mm caudal a bregma), y el VTA (-5,20 a -5,60 mm caudal a bregma). Use un atlas del cerebro de rata 70 para recibir orientación.
  7. Recoger las secciones que flotan libremente en los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos lleno de PBS para el análisis inmunohistoquímico eventual 71. Use Parafilm para sellar la 24 nosll placa para asegurarse de que el sistema de cartilla no se evapora en el contenedor y secar el cerebro. Almacenar el tejido cerebral en 4 ° C.

4. Procedimientos c-fos (Adaptado de 71)

  1. Tratar a cada sección con 5 ml de 5% suero de cabra normal y 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 1 hr.
  2. Incubar las secciones tratadas con anticuerpos primarios (conejo anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C durante 36 horas en pocillos que contenían 1 ml de PBS.
  3. secciones de enjuague 3 veces con PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  4. Incubar con anticuerpos secundarios (de cabra anti-conejo biotinilado; 1: 200) a TA durante 2 h en pocillos que contenían 1 ml de PBS.
  5. Enjuague cada sección 3x en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  6. Incubar las secciones enjuagaron durante 2 h en una mezcla avidina-peroxidasa de rábano picante disponible en el mercado que viene en un kit compuesto de avidina DH (100 l) y peroxidasa de rábano picante biotinilada H (100 l) en 5 ml de PBS.
  7. Vuelva a enjuagar las secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  8. Reaccionar las secciones con 0,05% de diaminobencidina (DAB) en presencia de 0,0015% H 2 O 2 5 - 10 min, dependiendo de la reactividad del tejido en los pocillos que contenían 5 ml de la solución de DAB.
  9. Haga doble etiqueta las secciones de VTA. Incubar con un anticuerpo tirosina hidroxilasa (TH) (conejo anti-rata TH, 1: 2000) en PBS (5 ml) durante la noche a 4 ° C.
  10. Enjuague secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  11. Incubar con anticuerpos secundarios (de cabra biotinilado anti-conejo; 1: 200) en PBS (5 ml) a temperatura ambiente durante 2 hr.
  12. Enjuague secciones 3 veces en PBS (5 ml) durante 10 min cada uno.
  13. Visualizar los anticuerpos mediante el uso de un complejo anticuerpo-peroxidasa secundaria. Reaccionar con una combinación de 0,05% DAB y una solución de sulfato de níquel 0,3%, el 5 - 10 min, dependiendo de la reacción del tejido en los pocillos que contenían 5 ml de la solución de DAB / NiCl.
  14. Asegúrese de que la solución DAB es de color verde claro de color lechoso de ellas reacción con el sulfato de níquel 0,3%. Si la solución es demasiado verde, a continuación, la reacción será demasiado oscuro.
  15. Montar todas las secciones en portaobjetos recubiertos de gelatina. dejarlos secar durante la noche y, a continuación, los cubres con unas pocas gotas de una solución de tolueno-base (TBS).
  16. Código desliza de modo que la condición experimental es desconocido para los observadores.

5. Determinación de c-fos Inmunorreactiva Counts

  1. Asignar pares de observadores imparciales para contar las neuronas Fos-positivas en estas regiones de interés (ROI): prelimbic córtex prefrontal medial, infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, NAC cáscara, núcleos AMY basolateral, AMY centro-cortico-medial, estriado dorsal, y VTA. Delinear si c-Fos inmunoreactividad estuvo presente en TH TH + y células en el VTA. La figura 1 proporciona una imagen de pantalla capturada de la NAC del microscopio.

figure-protocol-8922
Figura 1. Sección Representante del núcleo accumbens (NAC) Viendo Regiones de interés delineadas por la red mediante el cual se hizo el recuento de c-fos. La cáscara NAC se encuentra medial y ventral al núcleo NAC. El núcleo NAC rodea la comisura anterior (anterior Comm.). La extensión ventral del ventrículo lateral (lateral Vent.) Es visible. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Analizar al menos tres rebanadas representativos por sitio común a todos los animales en todas las condiciones de prueba.
  2. Utilizar software y un microscopio óptico para analizar toda la región para cada ROI mediante el trazado de un esquema (Figura 1).
    1. Para un determinado lugar, abrir la aplicación y haga clic en el menú desplegable de adquisición y haga clic en "Imagen en directo". Llevar el retorno de la inversión en el foco y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia. A continuación, tras de la región del cerebro elegido utilizando la red como una guía. Una vez que se ha completado la traza, contar las células (pasos 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Haga doble clic en el icono del software. Ir a la barra de menús, haga clic en "Adquisición" y luego "Imagen en directo". Llevar el retorno de la inversión en el foco y haga clic en la pantalla para establecer un punto de referencia.
      2. Ir a la barra de herramientas de red y haga clic en "Mostrar cuadrícula" y "etiquetas" Uso de la rejilla. Delinear el retorno de la inversión con una traza predeterminada.
      3. Contar todas las células en cada área ROI, seleccione un "+" en la barra lateral izquierda para mantener el recuento de células c-fos. Haga clic en cada celda por separado para registrar los cargos. Considere una célula positiva para c-fos cuando un círculo rojo oscuro definido se observó (Figura 1).
    2. Repita este procedimiento para cada sitio.
    3. Registro de cuenta en un cuaderno de laboratorio y en el equipo para futuros análisis. Ir a la barra de menús, haga clic en "Archivo", "Guardar archivo de datos" para guardar la localización y recuentos.
  3. Asegúrese de que la confiabilidad entre calificadores (usando correlación de cuentas) de los dos evaluadores no informados para cada sección en cada ROI siempre supera 0,8.

6. Estadísticas

  1. Evaluar la ingesta de sacarina de línea de base durante los primeros cuatro días usando un análisis de medidas repetidas de 1 vía de la varianza (ANOVA) comparar la ingesta de sacarina de los Días 1, 2, 3 y 4 69.
  2. Comparación de la ingesta de sacarina (día 4) con tomas de prueba (día 5) de los seis grupos que utilizan un bloque al azar ANOVA de 2 vías 69.
  3. Utilizar comparaciones de Tukey (p <0.05) para determinar los efectos significativos individuales 69.
  4. Determinar la confiabilidad entre calificadores, y luego usar el recuento de un observador común.
  5. Los recuentos de c-fos promedio para los tres rebanadas representativos para cada sitio 69.
    1. Realizar un ANOVA de 1 vía de la activación de c-fos inducida por la ingesta de las seis soluciones de (aceite de 3,5% de maíz, 8% de glucosa, 8% de fructosa, 0,2% de sacarina con sabor, xaNthan control de goma y agua) para el perilímbica mPFC 69.
    2. análisis paralelos de la repetición de los seis grupos de infralímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, cáscara NAC, basolateral AMY, AMY centro-cortico-medial, VTA y el cuerpo estriado dorsal. Utilizar comparaciones de Tukey (p <0,05) para revelar efectos significativos individuales 69.
  6. Comparación de la ingesta de aceite de maíz con tanto ingestión de agua y de su agente de suspensión, goma xantana. Comparación de la ingesta de fructosa y glucosa con tanto la ingesta de agua y el consumo del edulcorante no nutritivo, sacarina.
  7. Establecer si se observaron relaciones significativas entre la ingesta de soluciones y la activación de c-fos en cada uno de los sitios usando correlaciones r Bonferroni (p <0,05).
    1. Sistemáticamente comparar los recuentos de c-fos en el perilímbica y la corteza prefrontal infralímbica para cada animal en el grupo de aceite de maíz 3,5%.
    2. Repetir análisis sistemáticamente paralelas de cada par de los seis sitios (VTA, el cuerpo estriado dorsal, infralimbic córtex prefrontal medial, perilímbica córtex prefrontal medial, núcleo NAC, cáscara NAC, basolateral AMY, centro-cortico-medial AMY) para el aceite de maíz 3,5%.
    3. Repetir análisis sistemáticamente paralelas de estos seis sitios para los otros cinco condiciones de admisión experimentales (8% de glucosa, 8% de fructosa, 0,2% de sacarina con sabor, de control de la goma de xantano y agua).
  8. Aprovechar el hecho de que los mismos animales dentro de una condición solución se evaluaron en todos los sitios mediante la determinación de las relaciones significativas entre la activación de c-fos en todas las soluciones y dentro de cada solución utilizando Bonferroni r correlaciones (p <0,05).

Resultados

Todos los resultados representativos se describen a continuación se han publicado previamente 69, y se re-presentado aquí para apoyar a "prueba de concepto" en la indicación de la eficacia de la técnica.

ingesta de solución
No se observaron diferencias significativas en la ingesta de sacarina de línea de base durante los primeros cuatro días para todos los animales (F (3,108)...

Discusión

El objetivo del estudio fue determinar si la fuente (VTA) y los objetivos de proyección del cerebro anterior (NAC, Amy, córtex prefrontal medial) de DA neuronas relacionadas con la recompensa se activan simultáneamente después de la novela de la ingestión de grasa y azúcar en ratas mediante la técnica celular de c-fos . El presente estudio es una descripción detallada de los protocolos de un estudio publicado previamente 69. Se planteó la hipótesis de que el VTA, sus principales zonas de proyección...

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Gracias a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson y Theologia Karagiorgis por su arduo trabajo en este proyecto.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Sprague-Dawley ratsCharles River LaboratoriesCD-1
Wire Mesh CagesLab Products, Seaford, DE30-Cage rack
Rat ChowPMI Nutrition International5001
Taut Metal SpringLab Products, Seaford, DEn/a
Rat Weighing ScaleFisher Scientific Companyn/a
Nalgene Centrifuge TubesLab Products, Seaford, DE10-0501
Rubber StopperLab Products, Seaford, DEn/a
Metal SippersLab Products, Seaford, DEn/a
SaccharinSigma Chemical Co82385-42-0
Kool-Aid, CherryKool-AidCommerical
Kool-Aid, GrapeKool-AidCommercial
FructoseSigma Chemical CoF0127
GlucoseSigma Chemical CoG8270
Corn OilMazzolaCommerical
Xanthan GumSigma Chemical Co11138-66-2
Sliding MicrotomeMicrom Internationaln/a
Neurolucida CameraMBF BioscienceSoftware application
Gelatin-coated SlidesFisher Scientific Company12-550-343
Cover glassFisher Scientific Company12-545-M
Golden Nylon BrushesLoew-Cornell 2037
Natural Hair Sable Loew-Cornell 2022
24 Well PlatesFisher Scientific3527
6 Well PlatesFisher Scientific3506
1 L Pyrex bottlesFisher Scientific1395-1L
Tissue insert (tissue strainer)Fisher Scientific7200214
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE10 for 1-10μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE100 for 20-100μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE200 for 50-200μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μlWorld Precision Instruments500192
Universal Tips 5-200 μlWorld Precision Instruments500194
Universal Tips 500-5,000 μlWorld Precision Instruments500198
Blade Vibroslice 100World Precision InstrumentsBLADE
DPX Mounting Medium Electron Microscopy 13510
15 ml centrifuge tubesBiologix Research Co.10-0501
Slide BoxesBiologix Research Co.41-6100
Orbital Shaker Madell Corporation  ZD-9556
weigh boats Fisher Scientific02-202-100
5 ml disposable pipettesFisher Scientific13-711-5AM
Stereo Investigator SoftwareMicro Bright FieldSoftware application
NameCompanyCatalog numberComments
Reagents
Paraformaldehyde GranularFisher Scientific19210
NaClFisher ScientificS271-1
Sodium Phophate MonobasicFisher ScientificS468-500
Sodium Phosphate DiphasicFisher ScientificBP332-500
Hydrogen Peroxide Fisher ScientificH324-500
SafeClear II Fisher Scientific23-044-192
Methanol Fisher ScientificA412-1
Normal Goat SerumVectorS-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L)VectorBA-1000
ABC Kit Peroxidase StandardVectorPK-4000
Anti-cFos (Ab-5) RabbitEMD chem/Cal BiochemPC38
Triton X 100SigmaAldrichX-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride SigmaAldrichD5905
Sodium HydroxideSigmaAldrich5881
Primary TH anti bodyEMD MilliporeAB152
EuthosolVirbac AH

Referencias

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