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Resumo

O objetivo deste estudo é identificar redes cerebrais distribuídos relacionadas com a recompensa por delinear uma técnica de imuno confiável usando a ativação de c-fos celular para medir as mudanças simultâneas nos caminhos da dopamina e locais de terminal após a novela ingestão de gordura e açúcar em ratos.

Resumo

Este estudo usa a ativação c-fos celular para avaliar os efeitos do romance ingestão de gordura e açúcar em dopamina no cérebro (DA) vias em ratos. Ingestão de açúcares e gorduras são mediadas por suas atrações inatas, bem como as preferências aprendidas. dopamina do cérebro, especialmente meso-límbico e projecções a partir de meso-cortical a área tegmental ventral (VTA), tem sido implicada em ambas estas respostas ignorantes e aprendidas. O conceito de redes cerebrais distribuídos, em que vários sites e sistemas emissor / peptídeos interagem, foi proposta para mediar a ingestão de alimentos saborosos, mas não há evidência limitada demonstrando empiricamente tais ações. Assim, a ingestão de açúcar provoca imunorreatividade DA libertação e aumenta c-fos-like (FLI) a partir de zonas de projeção VTA DA individuais, incluindo o núcleo accumbens (NAC), amígdala (AMY) e medial córtex pré-frontal (mPFC), bem como o striatum dorsal. Além disso, administração central dos antagonistas selectivos do receptor de DA para estes locals diferencialmente reduzir aquisição e expressão de preferências de sabor condicionado desencadeados pela açúcares ou gorduras. Uma abordagem que permitam determinar se esses locais interagiram como uma rede do cérebro distribuídos em resposta ao açúcar ou gordura ingerida seria simultânea avaliar se o VTA e seus principais zonas de projeção mesotelencephalic DA (prelimbic e infralimbic mPFC, núcleo e concha do NAC basolateral e-centro-córtico medial AMY), bem como o corpo estriado dorsal exibiria coordenado e activação FLI simultânea após a ingestão oral, não condicionado de óleo de milho (3,5%), glucose (8%), frutose (8%) e a sacarina (0,2 soluções%). Esta abordagem é um primeiro passo bem sucedido em identificar a viabilidade do uso de ativação c-fos celular simultaneamente em todos os locais do cérebro relevantes para estudar a aprendizagem relacionadas com a recompensa na ingesta de alimentos em roedores.

Introdução

Cérebro de dopamina (DA) tem sido implicado em respostas centrais para ingestão de açúcares palatáveis ​​através proposta hedônica 1,2, 3 e hábito à base de 4,5 mecanismos de ação relacionados com o esforço. A via DA primária implicados nesses efeitos origina na área tegmental ventral (VTA) e projetos ao accumbens (NAC) de núcleo e concha, a amígdala basolateral e centro-córtico-medial (AMY), núcleo eo prelimbic e medial infralimbic córtex pré-frontal (mPFC) (ver comentários 6,7). O VTA tem sido implicado na ingestão de sacarose 8,9, e liberação DA é observada após a ingestão de açúcar no NAC 10-15, AMY 16,17 e mPFC 18-20. Ingestão de gordura também estimula DA NAC liberar 21, e outra zona de projeção DA-rico para o striatum dorsal (caudado-putâmen) foi também associada a DA-mediada alimentar 22,23. Kelley 24-27 propôs que estes múltiplos projetoszonas de íon deste sistema DA-mediada formaram uma rede cerebral distribuída integrada e interativa através de extensas e íntimas interconexões 28-34.

Para além da capacidade dos antagonistas dos receptores DA D1 e D2 para reduzir a ingestão de açúcares e gorduras 35-37 38-40, sinalização DA também tem sido implicado na mediação da capacidade dos açúcares e gorduras para produzir as preferências de sabor condicionado (PCP) 41- 46. Microinjeções de um antagonista dos receptores DA D1 para o NAC, AMY ou mPFC 47-49 eliminar aquisição da PCP suscitou por intragástrico glicose. Considerando microinjeções de antagonistas do receptor quer DA D1 ou D2 na mPFC elimina aquisição de frutose-PCP 50, a aquisição e expressão de frutose-PCP são diferencialmente bloqueado por antagonistas de DA no NAC e AMY 51,52.

A técnica 53,54 c-fos foi empregue para investigar activatio neuralN induzida pela ingestão de paladar agradável e de activação neuronal. O termo "activação de c-fos" será usada em todo o manuscrito, e é operacionalmente definido por um aumento da transcrição de c-fos durante a despolarização neuronal. Ingestão de sacarose aumentou Expressão de Fos (ILF) no núcleo AMY central, o VTA, bem como a casca, mas não do núcleo, do NAC 55-57. Enquanto a ingestão de sacarose em ratos que se alimentam de sham aumentou significativamente FLI na AMY eo NAC, mas não o VTA 58, intragástrica de sacarose ou glicose infusões aumentou significativamente FLI no NAC e núcleos centrais e basolateral da AMY 59,60. Adição repetida de sacarose para acesso Chow programada aumentada FLI na CPFm, bem como a casca de NAC e o núcleo 61. Um paradigma de redução de marcha concentração de sacarose revelou que os maiores aumentos FLI ocorreu no AMY basolateral e NAC, mas não o VTA 62. Seguindo condicionado, extinção de rewa naturais relacionados com o açúcarcomportamentos rd aumentou FLI na AMY basolateral eo NAC 63. Além disso, o emparelhamento disponibilidade de açúcar a um tom resultou no aumento dos níveis de tom subsequentemente FLI na AMY basolateral 64. Ingestão de alto teor de gordura também aumentou FLI no NAC e mPFC locais 65-67.

A maioria dos estudos citados anteriormente açúcar e gordura efeitos examinada na ativação c-fos em locais únicos que não fornecem informações sobre a identificação de redes cerebrais distribuídos relacionadas com a recompensa 24-27. Além disso, muitos dos estudos também não delinear as contribuições relativas de sub-áreas do NAC (núcleo e casca), AMY (basolateral e-córtico-medial central) e mPFC (prelimbic e infralimbic) que poderiam ser examinados pelo vantagem de excelente resolução espacial, de uma única célula no mapeamento c-Fos 68. 69 O nosso laboratório usado recentemente activação de c-fos e alterações ao mesmo tempo medidos na via VTA DA e a sua prózonas de injeção (NAC, Amy e mPFC) após novela ingestão de gorduras e açúcares em ratos. O presente estudo descreve as etapas processuais e metodológicas para analisar simultaneamente se a exposição aguda a seis soluções diferentes (óleo de milho, glicose, frutose, sacarina, água e um controle de emulsão de gordura) seria diferencialmente ativar FLI em sub-áreas do NAC, AMY, CPFm, bem como o corpo estriado dorsal. Esta detecção simultânea de diferenças permitida a confirmação de efeitos significativos sobre FLI em cada local e determinação sobre se as mudanças em um determinado site correlacionadas com alterações de sites relacionados, proporcionando assim um apoio para uma rede do cérebro distribuídos 24-27. Estes procedimentos testados se o VTA, o prelimbic e infralimbic CPFm, o núcleo e a casca da NAC, e o AMY basolateral e centro-cortico-medial), bem como o corpo estriado dorsal exibiria coordenado e activação FLI simultânea depois, a ingestão não condicionada por via oral de glucose (8%), frutose (8%), óleo de milho (3,5%) e soluções de sacarina (0,2%).

Protocolo

Estes protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal certificando que todos os assuntos e procedimentos estão em conformidade com o National Institutes of Health Guide para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Temas

  1. Compra e / ou do sexo masculino da raça Sprague-Dawley (260-300 g).
  2. ratos Casa individualmente em gaiolas de malha de arame. Mantê-los numa 12:12 h ciclo claro / escuro com ração e água disponíveis ad libitum.
  3. Atribuir os tamanhos das amostras apropriadas (por exemplo, N ≈ 6-8) aleatoriamente em grupos.

2. Equipamentos e ingestão de procedimentos de teste

  1. Utilize tubos de centrífuga calibrado com rolhas de borracha e um tubo de metal Sipper ângulo de 45 ° para proporcionar uma medição precisa (± 0,1 ml) das soluções apresentadas. Fixá-los à gaiolas de alojamento por uma mola de metal esticada para permitir a visibilidade das calibrações.
  2. Restringir rações alimentares (~15 / g / dia) dos ratos para reduzir o peso para 85% do seu peso corporal original para aumentar a motivação para consumir as soluções. Nota: A redução de peso deve demorar entre 3-5 dias.
  3. Fornecer soluções de pré-formação (10 ml) de 0,2% sacarina durante quatro dias através de uma sessão de 1 hora para maximizar a probabilidade de que os ratos irão provar as soluções de ensaio subsequentes com latência curta (menos de 1 min).
  4. Confirmam o caudal através do tubo de centrífuga por derramar algumas gotas.
  5. Pesar os tubos antes e depois de cada sessão para obter uma medição de admissão.
  6. Executar um teste de ingestão no quinto dia em subgrupos receberam uma das seis soluções (10 ml, 1 h): a) água, b) romance aromatizado (0,05% aroma de cereja) 0,2% de sacarina, c) 8% de frutose, d), 8 % de glucose, e) o óleo de milho 3,5% suspenso em goma de xantano 0,3%, e f) 0,3% de goma de xantano.
  7. Certifique-se de que as soluções nutritivas são isocalóricas; Assim, a concentração de óleo de milho 3,5% é isocalórica para as soluções de açúcar 8%.
  8. Certifique-them soluções de amostra ratos com latência curta (menos de 1 min). Se este requisito não for cumprido, em seguida, descartar o assunto do estudo.

3. Preparação do Tecido

  1. Anestesiar cada animal através de uma injecção intraperitoneal de pentobarbital de 90 minutos após a exposição inicial a cada solução de ensaio. Confirmar que os animais estão devidamente anestesiados pela demonstração de que o animal não é mais sensível a esses reflexos como a retirada de beliscar pé, piscando na sequência de pressões da córnea, direta ou balançando a cabeça ao estímulo pavilhão auricular profunda.
  2. Perfundir cada animal transcardialmente como descrito anteriormente 69.
    1. Anestesiar ratos com uma overdose de pentobarbital sódico (65 mg / kg), retire a caixa torácica e expor o peito para o acesso livre para o coração 69.
    2. Coloque a agulha no ápex da válvula do coração esquerdo, e cortar a veia cava. Administrar solução tampão de fosfato (PBS, ~ 180 mL), seguido por um fixador co tamponado com fosfatontaining paraformaldeído a 4% (~ 180 mL).
    3. Certifique-se de que o animal realmente está sendo perfundido corretamente examinando se o líquido está deixando outras cavidades, como o nariz, boca e áreas genitais. Nota: a fixação adequada com paraformaldeído será acompanhado por grandes movimentos musculares. Se isso não ocorrer, volte a ajustar a agulha até que ocorra essa reação.
  3. Remover o cérebro do crânio rapidamente cortando pêlo e da pele longe do crânio. Use fórceps para quebrar e remover o osso do cérebro que se deslocam de trás para a frente. Trabalho inicialmente na área abaixo e por trás do cerebelo, assegurando que o rongeur é entre o osso e pia-máter meníngea. Uma vez que a parte superior e os lados do crânio é removido, usar uma pequena espátula para levantar o cérebro a partir da base, e cortar nervos cranianos com pequenas tesouras. Tenha cuidado para não danificar o cérebro durante a tentativa de remover o osso.
  4. Fixar os cérebros em uma solução de paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 ° C.Colocar os cérebros numa solução de PBS sacarose a 30% / 70% à temperatura ambiente até que eles se depositam no fundo do recipiente.
  5. Bloquear o cérebro
    1. Remova a parte rostral do cérebro corte caudal transversalmente ao bulbo olfativo.
    2. Remover a parte caudal do cérebro cortando transversalmente ao nível do cerebelo e da ponte.
  6. Monte o cérebro coronal com a parte caudal fixo para o palco de um micrótomo deslizante, e corte cortes coronais (40 mm) através do mPFC (2,86-2,20 mm rostral à bregma), o núcleo NAC e shell e dorsal striatum (+ 1,76-1,60 mm rostral à bregma), o AMY (-2,12 - -2,92 mm caudal ao bregma), e o VTA (-5,20 - -5,60 mm caudal ao bregma). Use um rato atlas do cérebro de 70 para orientação.
  7. Recolhe secções de flutuação livre em poços individuais de uma placa de 24 poços com PBS durante 71 eventual análise imuno-histoquímica. Use Parafilm para selar a 24 nósplaca ll para se certificar de que a PBS não evaporar no recipiente e secar o cérebro. Armazenar o tecido cerebral em 4 ° C.

4. Procedimentos de c-fos (Adaptado de 71)

  1. Tratar cada secção com 5 ml de 5% de Soro normal de cabra e 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 1 h.
  2. Incubar as secções tratados com os anticorpos primários (anticorpo de coelho anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C durante 36 horas em poços contendo 1 mL de PBS.
  3. Lavar as secções 3x com PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  4. Incubar com anticorpos secundários (anticorpos de cabra anti-coelho biotinilado; 1: 200) à TA durante 2 horas em poços contendo 1 mL de PBS.
  5. Lavar 3x cada secção em PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  6. Incubar as secções enxaguado durante 2 horas numa mistura de avidina-peroxidase de rábano disponíveis comercialmente que vem num kit composto por Avadin DH (100 ul) e biotinilada peroxidase H (100 uL) em 5 ml de PBS.
  7. Re-lavar as seções 3x na PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  8. Reagir as secções com 0,05% de diaminobenzidina (DAB) na presença de 0,0015% de H 2 O 2 durante 5 - 10 minutos, dependendo da reactividade do tecido em poços contendo 5 ml de solução de DAB.
  9. Duplo-label as seções VTA. Incubar-los com um anticorpo da tirosina hidroxilase (TH) (coelho anti-rato TH, 1: 2000) em PBS (5 ml) durante a noite a 4 ° C.
  10. Enxaguar secções 3x em PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  11. Incubar com anticorpos secundários (anti-coelho de cabra biotinilado; 1: 200) em PBS (5 ml) à temperatura ambiente durante 2 h.
  12. Enxaguar secções 3x em PBS (5 ml) durante 10 min cada.
  13. Visualizar os anticorpos por meio de um complexo anticorpo-peroxidase secundário. Reagir com uma combinação de 0,05% de DAB e uma solução de sulfato de níquel de 0,3%, para 5 - 10 min, dependendo da reacção do tecido em poços contendo 5 ml da solução DAB / NiCl.
  14. Certifique-se de que a solução DAB é verde claro de cor leitosa a partir deles reacção com o sulfato de níquel de 0,3%. Se a solução for demasiado verde, então a reacção será muito escura.
  15. Montar todas as secções em lâminas revestidas com gelatina. Deixe-os secar durante a noite, e depois cobri-derrapante com algumas gotas de uma solução baseada em tolueno (TBS).
  16. Código desliza de modo que a condição experimental é desconhecida para os observadores.

5. Determinação do c-fos imunorreactiva Counts

  1. Atribuir pares de observadores imparciais contar neurônios Fos-positivos nessas regiões de interesse (ROI): prelimbic mPFC, infralimbic mPFC, núcleo NAC, NAC escudo, núcleos AMY basolateral, AMY-centro-córtico medial, striatum dorsal, e VTA. Delinear se c-Fos imunorreatividade estava presente em TH + e TH células da VTA. A Figura 1 fornece uma imagem capturada de tela do NAC do microscópio.

figure-protocol-8364
Figura 1. Seção Representante do núcleo accumbens (NAC) Exibindo Regiões de Interesse delineado pela grade pelo qual Counts c-fos são feitas. O shell NAC é encontrado medial e ventralmente ao núcleo NAC. O núcleo NAC circunda a comissura anterior (Anterior Comm.). A extensão ventral do ventrículo lateral (lateral ventilação.) É visível. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Analisar, pelo menos, três fatias representativas por sítio comum a todos os animais em todas as condições de teste.
  2. Use um software e um microscópio óptico para analisar toda a região para cada ROI, traçando um esboço (Figura 1).
    1. Para um determinado site, abra o aplicativo e clique no menu drop-down aquisição e clique em "Imagem Live". Trazer o ROI em foco e clique na tela para estabelecer um ponto de referência. Então trace a região escolhida do cérebro usando a grade como um guia. Uma vez que o rastreamento é concluído, contagem de células (passos 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Clique duas vezes no ícone do software. Vá para a barra de menu, clique em "Aquisição" e depois "Imagem Live". Trazer o ROI em foco e clique na tela para estabelecer um ponto de referência.
      2. Vá para a barra de ferramentas de rede e clique em "Display Grid" e "rótulos Use grade". Delinear o ROI com um traço predeterminado.
      3. Contagem de todas as células em cada área ROI, selecione um "+" na barra lateral esquerda para manter a contagem de células c-fos. Clique em cada célula individualmente para registrar a contagem. Considere-se uma célula positiva para o c-fos, quando um circulo vermelho escuro definido é observado (Figura 1).
    2. Repita esse processo para cada site.
    3. Gravar conta em um caderno de laboratório e no computador para análise futura. Vá para a barra de menu, clique em "Arquivo", "Salvar arquivo de dados" para salvar a detecção e contagem.
  3. Certifique-se de que a confiabilidade entre avaliadores (utilizando a correlação de contagem) dos dois avaliadores desinformados para cada seção em cada ROI sempre superior a 0,8.

6. Estatísticas

  1. Avaliar a ingestão de sacarina de linha de base durante os primeiros quatro dias usando um com medidas repetidas análise 1 de variância (ANOVA), comparando as entradas de sacarina dos Dias 1, 2, 3 e 4 69.
  2. Compare ingestão de sacarina (Dia 4) com entradas de teste (dia 5) dos seis grupos que utilizam a-blocos casualizados, 2-way ANOVA 69.
  3. Use comparações de Tukey (P <0,05) para determinar os efeitos significativos individuais 69.
  4. Determinar a confiabilidade entre avaliadores, e depois usar a contagem de um observador comum.
  5. Contagens médias c-fos para as três fatias representativas para cada local 69.
    1. Executar uma 1-way ANOVA de activação de c-fos induzida por ingestão das seis soluções (3,5% de óleo de milho, 8% de glucose, 8% de frutose, 0,2% de sacarina aromatizada, xacontrole Nthan goma e água) para a perilímbica mPFC 69.
    2. análises paralelas repetição dos seis grupos para infralimbic mPFC, núcleo NAC, shell NAC, basolateral AMY, AMY-centro-córtico medial, VTA e striatum dorsal. Use comparações de Tukey (P <0,05) para revelar efeitos significativos individuais 69.
  6. Compare ingestão de óleo de milho com a ingestão de água e ingestão de seu agente de suspensão, goma xantana. Comparar frutose e glicose com entradas tanto a ingestão de água e da ingestão do edulcorante não nutritivo, a sacarina.
  7. Estabelecer se relações significativas entre a ingestão de soluções e ativação de c-fos em cada um dos locais foram observadas utilizando correlações r Bonferroni (p <0,05).
    1. Sistematicamente comparar as contagens de c-fos na perilímbica e no córtex pré-frontal infralimbic para cada animal no grupo óleo de milho 3,5%.
    2. Repetir análises sistematicamente paralelas de cada par dos seis locais (VTA, striatum dorsal, infralimbic mPFC, perilímbica mPFC, NAC core, shell NAC, basolateral AMY,-centro-córtico medial AMY) para o óleo de milho 3,5%.
    3. Repetir análises sistematicamente paralelas destes seis locais para as outras cinco condições experimentais de admissão (8% de glucose, 8% de frutose, 0,2% de sacarina aromatizado, de controlo de goma de xantano e água).
  8. Tirar proveito do facto de que os mesmos animais dentro de uma condição da solução, foram avaliados em todos os locais, determinando as relações significativas entre a activação de c-fos através de soluções e dentro de cada solução utilizando Bonferroni r correlações (p <0,05).

Resultados

Todos os resultados representativos descritos abaixo foram publicados anteriormente 69, e são re-apresentado aqui para apoiar "prova de conceito" na indicação da eficácia da técnica.

solução Intakes
diferenças significativas na ingestão de sacarina de base foram observados durante os primeiros quatro dias para todos os animais (F (3,108) = 57,27, p <0,001) com entradas (...

Discussão

O objetivo do estudo foi determinar se a fonte (VTA) e as metas de projeção do cérebro anterior (NAC, Amy, mPFC) de Da neurônios relacionados com a recompensa foram ativados simultaneamente após a novela ingestão de gordura e açúcar em ratos utilizando a técnica de c-fos celular . O presente estudo é uma descrição detalhada dos protocolos de um estudo publicado anteriormente 69. Postula-se que o VTA, suas principais zonas de projeção para o prelimbic e infralimbic mPFC, o núcleo ea casca do NAC...

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Graças a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson e Theologia Karagiorgis pelo seu trabalho árduo neste projeto.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Sprague-Dawley ratsCharles River LaboratoriesCD-1
Wire Mesh CagesLab Products, Seaford, DE30-Cage rack
Rat ChowPMI Nutrition International5001
Taut Metal SpringLab Products, Seaford, DEn/a
Rat Weighing ScaleFisher Scientific Companyn/a
Nalgene Centrifuge TubesLab Products, Seaford, DE10-0501
Rubber StopperLab Products, Seaford, DEn/a
Metal SippersLab Products, Seaford, DEn/a
SaccharinSigma Chemical Co82385-42-0
Kool-Aid, CherryKool-AidCommerical
Kool-Aid, GrapeKool-AidCommercial
FructoseSigma Chemical CoF0127
GlucoseSigma Chemical CoG8270
Corn OilMazzolaCommerical
Xanthan GumSigma Chemical Co11138-66-2
Sliding MicrotomeMicrom Internationaln/a
Neurolucida CameraMBF BioscienceSoftware application
Gelatin-coated SlidesFisher Scientific Company12-550-343
Cover glassFisher Scientific Company12-545-M
Golden Nylon BrushesLoew-Cornell 2037
Natural Hair Sable Loew-Cornell 2022
24 Well PlatesFisher Scientific3527
6 Well PlatesFisher Scientific3506
1 L Pyrex bottlesFisher Scientific1395-1L
Tissue insert (tissue strainer)Fisher Scientific7200214
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE10 for 1-10μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE100 for 20-100μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE200 for 50-200μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μlWorld Precision Instruments500192
Universal Tips 5-200 μlWorld Precision Instruments500194
Universal Tips 500-5,000 μlWorld Precision Instruments500198
Blade Vibroslice 100World Precision InstrumentsBLADE
DPX Mounting Medium Electron Microscopy 13510
15 ml centrifuge tubesBiologix Research Co.10-0501
Slide BoxesBiologix Research Co.41-6100
Orbital Shaker Madell Corporation  ZD-9556
weigh boats Fisher Scientific02-202-100
5 ml disposable pipettesFisher Scientific13-711-5AM
Stereo Investigator SoftwareMicro Bright FieldSoftware application
NameCompanyCatalog numberComments
Reagents
Paraformaldehyde GranularFisher Scientific19210
NaClFisher ScientificS271-1
Sodium Phophate MonobasicFisher ScientificS468-500
Sodium Phosphate DiphasicFisher ScientificBP332-500
Hydrogen Peroxide Fisher ScientificH324-500
SafeClear II Fisher Scientific23-044-192
Methanol Fisher ScientificA412-1
Normal Goat SerumVectorS-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L)VectorBA-1000
ABC Kit Peroxidase StandardVectorPK-4000
Anti-cFos (Ab-5) RabbitEMD chem/Cal BiochemPC38
Triton X 100SigmaAldrichX-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride SigmaAldrichD5905
Sodium HydroxideSigmaAldrich5881
Primary TH anti bodyEMD MilliporeAB152
EuthosolVirbac AH

Referências

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