JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo di questo studio è quello di individuare le reti del cervello distribuite ricompensa legati delineando una tecnica immunoistologiche affidabile utilizzando attivazione cellulare c-fos per misurare le variazioni simultanee nei percorsi della dopamina e siti terminale dopo romanzo ingestione di grassi e zuccheri nei ratti.

Abstract

Questo studio utilizza l'attivazione cellulare c-fos per valutare gli effetti del romanzo ingestione di grassi e zucchero sul cervello della dopamina (DA) percorsi nei ratti. L'assunzione di zuccheri e grassi sono mediati dai loro attrazioni innate nonché le preferenze imparato. Cervello dopamina, soprattutto meso-limbico e proiezioni meso-corticale dalla zona ventrale tegmentale (VTA), è stato implicato in entrambe queste risposte ignoranti e apprese. Il concetto di reti del cervello distribuite, in cui diversi siti e sistemi di trasmettitore / peptidi interagiscono, è stato proposto di mediare l'assunzione di cibo appetibile, ma non vi sono prove limitate empiricamente che dimostrano tali azioni. Così, l'assunzione di zucchero suscita immunoreattività DA rilascio e aumenta c-fos-like (FLI) da singole zone di proiezione VTA DA tra cui nucleo accumbens (NAC), amigdala (Amy) e corteccia prefrontale mediale (mPFC), così come lo striato dorsale. Inoltre, l'amministrazione centrale di selettivi antagonisti dei recettori DA in questi sitos differenziale ridurre l'acquisizione e l'espressione delle preferenze sapore condizionati indotte da zuccheri o grassi. Un approccio con il quale per determinare se questi siti hanno interagito come una rete cerebrale distribuita in risposta allo zucchero o di assunzione di grassi sarebbe quello di simultanea valutare se il VTA e le sue principali zone di proiezione mesotelencephalic DA (prelimbic e infralimbica mPFC, core e shell del NAc, basolaterale e centro-cortico-mediale AMY) nonché striato dorsale visualizzerebbe coordinato ed attivazione FLI simultanea dopo orale, assunzione incondizionata di olio di mais (3,5%), glucosio (8%), fruttosio (8%) e la saccarina (0,2 %) soluzioni. Questo approccio è un primo passo di successo per identificare la possibilità di utilizzare attivazione cellulare c-fos simultaneamente attraverso importanti siti del cervello per studiare l'apprendimento ricompensa legati a ingestione di cibo appetibile nei roditori.

Introduzione

Cervello dopamina (DA) è stato implicato nelle risposte centrali per l'assunzione di zuccheri appetibili attraverso proposto edonistico 1,2, sforzo legate 3 e l'abitudine a base di 4,5 meccanismi di azione. Il percorso principale DA implicati in questi effetti ha origine nella zona ventrale tegmentale (VTA), e progetti al accumbens (NAC) core e shell, l'amigdala basolaterale e centrale-cortico-mediale (AMY), nucleo e la prelimbic e mediale infralimbica corteccia prefrontale (mPFC) (vedi recensioni 6,7). Il VTA è stato implicato in assunzione di saccarosio 8,9, e il rilascio di DA è osservato dopo l'assunzione di zucchero nel NAC 10-15, AMY 16,17 e mPFC 18-20. L'assunzione di grassi stimola anche DA NAC rilasciare 21, e un altro DA-ricca zona di proiezione di striato dorsale (caudato-putamen) è stato anche associato con l'alimentazione DA-mediata 22,23. Kelley 24-27 proposto che questi progetti multiplazone di ioni di questo sistema DA-mediata formano una rete distribuita del cervello integrato e interattivo attraverso ampie e intime interconnessioni 28-34.

Oltre alla capacità di DA D1 e D2 antagonisti dei recettori per ridurre l'assunzione di zuccheri e grassi 35-37 38-40, DA segnalazione è stata anche coinvolta nel mediare la capacità di zuccheri e grassi per produrre preferenze di gusto condizionata (PCP) 41- 46. Microiniezioni di un antagonista del recettore DA D1 nel NAC, AMY o mPFC 47-49 eliminare acquisizione di CFP suscitato dal glucosio intragastrico. Mentre microiniezioni di entrambi DA D1 o D2 antagonisti dei recettori nel mPFC elimina acquisizione di fruttosio-CFP 50, l'acquisizione e l'espressione di fruttosio-PCP sono differenziale bloccati da antagonisti Da nel NAC e AMY 51,52.

Il c-fos tecnica 53,54 è stata impiegata per indagare activatio neuralen indotta da assunzione gradevole al palato e l'attivazione neurale. Il termine "attivazione di c-fos" verrà utilizzato in tutto il manoscritto, ed è operativamente definita da un aumento della trascrizione di c-Fos durante la depolarizzazione neuronale. Assunzione di saccarosio aumentato fos-come immunoreattività (Fli) nel nucleo AMY centrale, nucleo VTA, nonche la shell, ma non, della NAC 55-57. Mentre l'assunzione di saccarosio in ratti sham-alimentazione significativamente aumentato FLI nel AMY e NAC, ma non il VTA 58, intragastrici saccarosio o glucosio infusioni aumentato significativamente FLI nel NAC e nuclei centrali e basolaterale del AMY 59,60. Ripetuta aggiunta di saccarosio all'accesso chow di linea aumentata FLI nel mPFC nonché il guscio NAC e nucleo 61. Un saccarosio concentrazione scalata paradigma ha rivelato che i maggiori incrementi si sono verificati nel FLI AMY basolaterale e NAC, ma non il VTA 62. A seguito di condizionamento, l'estinzione di zucchero legate rewa naturalecomportamenti rd aumentato FLI nel AMY basolaterale e il NAC 63. Inoltre, l'associazione disponibilità di zucchero a un tono provocato il tono successivamente aumentando i livelli di FLI nel AMY basolaterale 64. L'assunzione di alto contenuto di grassi è aumentato anche FLI in NAC e mPFC siti 65-67.

Zucchero e grassi effetti la maggior parte degli studi precedentemente citati esaminato sull'attivazione c-fos in singoli siti che non forniscono le informazioni relative all'identificazione delle reti cerebrali distribuite ricompensa legati 24-27. Inoltre, molti degli studi, inoltre, non ha delineare i contributi relativi sub-aree del NAC (core e shell), AMY (basolaterale e centro-cortico-mediale) e mPFC (prelimbic e infralimbica) che potrebbero potenzialmente essere esaminata dal vantaggio di eccellenti, risoluzione di una singola cellula spaziale c-Fos mappatura 68. Il nostro laboratorio ha recentemente usato 69 attivazione di c-fos e alterazioni misurate simultaneamente nella via VTA DA e la sua prozone di iniezione (NAC, Amy e mPFC) dopo romanzo ingestione di grassi e zuccheri nei ratti. Il presente studio descrive le fasi procedurali e metodologici per analizzare simultaneamente se l'esposizione acuta a sei diverse soluzioni (olio di mais, glucosio, fruttosio, saccarina, acqua e un controllo emulsione di grasso) sarebbe differenziale attivare FLI in sotto-aree del NAC, AMY, mPFC nonché striato dorsale. Questa rilevazione simultanea di differenze ha permesso la conferma degli effetti significativi sulla FLI in ciascun sito e decidere se sia i cambiamenti in un determinato sito correlato con cambiamenti di siti correlati, fornendo in tal modo il supporto per una rete cerebrale distribuita 24-27. Queste procedure collaudate se il VTA, il prelimbic e infralimbica mPFC, il nucleo e guscio della NAC, e la AMY basolaterale e centrale-cortico-mediale), così come striato dorsale visualizzerebbe coordinato e l'attivazione FLI simultanea dopo orale, l'assunzione incondizionato di glucosio (8%), fruttosio (8%), olio di mais (3,5%) e le soluzioni saccarina (0,2%).

Protocollo

Questi protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali attestante che tutti i soggetti e le procedure sono in conformità con il National Institutes of Health Guide per cura e l'uso di animali da laboratorio.

1. Soggetti

  1. Acquisto e / o razza maschile ratti Sprague-Dawley (260-300 g).
  2. ratti Casa singolarmente in gabbie di rete metallica. A mantenere su un / buio ciclo 12:12 ore di luce con ratto chow e acqua ad libitum.
  3. Assegnare le dimensioni del campione appropriate (ad esempio, n ≈ 6-8) in modo casuale in gruppi.

2. Le apparecchiature e procedure di test di aspirazione

  1. Utilizzare provette da centrifuga calibrate con tappi di gomma e un tubo metallico sipper angolo di 45 ° per fornire una misurazione precisa (± 0,1 ml) delle soluzioni presentate. fissarli alle gabbie a casa da una molla metallica tesa a consentire la visibilità delle calibrazioni.
  2. Limitare razioni di cibo (~15 / g / giorno) dei ratti per ridurre il peso al 85% del loro peso corporeo originale per aumentare la motivazione per consumare le soluzioni. Nota: La riduzione di peso dovrebbe prendere tra 3-5 giorni.
  3. Fornire soluzioni di pre-formazione (10 ml) di 0,2% saccarina per quattro giorni su una sessione di 1 ora per massimizzare la probabilità che i ratti potranno gustare le successive soluzioni di prova con una latenza breve (meno di 1 minuto).
  4. Confermare il flusso attraverso il tubo di centrifuga per versare qualche goccia.
  5. Pesare i tubi prima e dopo ogni sessione per ottenere la misura di aspirazione.
  6. Eseguire un test di aspirazione al quinto giorno sottogruppi trattati con uno dei sei soluzioni (10 ml, 1 hr): a) acqua, b) novel aromatizzato (0,05% sapore di ciliegia) 0,2% saccarina, c) 8% di fruttosio, d) 8 % di glucosio, e) 3,5% olio di mais sospesi in 0,3% di xanthan gum ed f) 0,3% di xanthan gum.
  7. Assicurarsi che le soluzioni nutritive sono isocalorica; pertanto, la concentrazione di mais olio 3,5% è isocalorica alle soluzioni zuccherine 8%.
  8. garantire °a ratti soluzioni campione con una latenza breve (meno di 1 minuto). Se questo requisito non è soddisfatto, poi scarta il soggetto dallo studio.

3. Preparazione del tessuto

  1. Anestetizzare ciascun animale un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital 90 min dopo l'esposizione iniziale a ciascuna soluzione di prova. Verificare che gli animali siano adeguatamente anestetizzati dimostrando che l'animale non è più sensibile a tali riflessi, come il ritiro a pizzico piedi, lampeggianti in seguito alle pressioni della cornea diretta o scuotendo la testa alla stimolazione pinna profondo.
  2. Profumato ogni animale transcardially come descritto in precedenza 69.
    1. Anestetizzare i topi con una dose eccessiva di sodio pentobarbital (65 mg / kg), rimuovere la gabbia toracica ed esporre il petto per il libero accesso al cuore 69.
    2. Inserire l'ago nel vertice della valvola cuore sinistro, e tagliare la vena cava. Somministrare soluzione tampone fosfato (PBS, ~ 180 ml) seguito da un co fissativo tampone fosfatontaining 4% paraformaldeide (~ 180 ml).
    3. Assicurarsi che l'animale effettivamente viene perfuso correttamente esaminando se il liquido lascia altre cavità, come il naso, la bocca, e zone genitali. Nota: la fissazione corretta con paraformaldeide sarà accompagnata da grandi movimenti muscolari. Se ciò non si verifica, regolare nuovamente l'ago finché si verifica questa reazione.
  3. Rimuovere il cervello dal cranio rapidamente tagliando pelliccia e la pelle dal cranio. Utilizzare rongeurs per rompere e rimuovere l'osso dal cervello in movimento da dietro in avanti. Il lavoro inizialmente nell'area sotto e dietro il cervelletto, assicurandosi che la rongeur è tra l'osso e meningeo pia madre. Una volta che i lati superiore e del cranio vengono rimossi, utilizzare una piccola spatola per sollevare il cervello dalla base, e tagliare nervi cranici con piccole forbici. Fare attenzione a non danneggiare il cervello durante il tentativo di rimuovere il tessuto osseo.
  4. Fissare il cervello in una soluzione di paraformaldeide al 4% notte a 4 ° C.Posizionare il cervello in saccarosio / 70% soluzione al 30% PBS a temperatura ambiente fino a che si depositano sul fondo del contenitore.
  5. Bloccare il cervello
    1. Rimuovere la parte rostrale del taglio caudale trasversalmente al bulbo olfattivo del cervello.
    2. Rimuovere la parte caudale del taglio trasversalmente a livello del cervelletto e il ponte cervello.
  6. Montare il cervello coronale con la parte caudale fissato allo stadio di un microtomo scorrevole, e tagliare sezioni coronali (40 micron) attraverso il mPFC (2,86-2,20 mm rostrale al bregma), il nucleo NAC e le coperture e dorsale striato (+ 1,76-1,60 mm rostrale al bregma), il AMY (-2.12 - -2.92 mm caudale al bregma), e il VTA (-5,20 - -5,60 mm caudale a bregma). Utilizzare un cervello di ratto atlante 70 per la guida.
  7. Raccogliere sezioni free-floating in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti riempiti con PBS per eventuali analisi immunoistochimica 71. Utilizzare Parafilm per sigillare il 24 ciPiastra ll per assicurarsi che il PBS non evapora nel contenitore e asciugare il cervello. Conservare il tessuto cerebrale a 4 ° C.

4. Procedure c-fos (Adattato da 71)

  1. Trattare ogni sezione con 5 ml di 5% Normal Goat Serum e 0,2% Triton X-100 in PBS per 1 ora.
  2. Incubare le sezioni trattate con anticorpi primari (coniglio anti-c-fos, 1: 5000) a 4 ° C per 36 ore in pozzetti contenenti 1 ml di PBS.
  3. sezioni Sciacquare 3x con PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  4. Incubare con anticorpi secondari (biotinilato di capra anti-coniglio; 1: 200) a temperatura ambiente per 2 ore in pozzetti contenenti 1 ml di PBS.
  5. Lavare 3x ciascuna sezione in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  6. Incubare sezioni risciacquati per 2 ore in una miscela perossidasi avidina-rafano disponibile in commercio che viene fornito in un kit composto da Avadin DH (100 microlitri) e biotinilato perossidasi di rafano H (100 ml) in 5 ml di PBS.
  7. Re-risciacquo sezioni 3x in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  8. React sezioni con 0,05% diaminobenzidina (DAB) in presenza di 0,0015% H 2 O 2 per 5 - 10 min, a seconda della reattività del tessuto in pozzetti contenenti 5 ml della soluzione DAB.
  9. Doppio-label sezioni VTA. li Incubare con anticorpo tirosina idrossilasi (TH) (coniglio anti-topo TH, 1: 2.000) in PBS (5 ml) notte a 4 ° C.
  10. Sciacquare le sezioni 3x in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  11. Incubare con anticorpi secondari (capra biotinilato anti-coniglio; 1: 200) in PBS (5 ml) a temperatura ambiente per 2 ore.
  12. Sciacquare le sezioni 3x in PBS (5 ml) per 10 minuti ciascuno.
  13. Visualizzare gli anticorpi utilizzando un complesso anticorpo-perossidasi secondario. Reagire con una combinazione di 0,05% DAB e una soluzione di nichel solfato 0,3%, per 5 - 10 minuti, a seconda della reazione del tessuto in pozzetti contenenti 5 ml di / soluzione NiCl DAB.
  14. Assicurarsi che la soluzione DAB è lattiginosa di colore verde chiaro da essoreazione s con il solfato di nichel 0,3%. Se la soluzione è troppo verde, allora la reazione sarà troppo scura.
  15. Montare tutte le sezioni su vetrini gelatina rivestite. Lasciateli asciugare durante la notte, e poi coprire antiscivolo con alcune gocce di una soluzione a base di toluene (TBS).
  16. Codice scorre in modo che la condizione sperimentale è sconosciuta agli osservatori.

5. Determinazione del c-fos immunoreattiva Conti

  1. Assegnare coppie di osservatori imparziali di contare i neuroni Fos-positivi in ​​queste regioni di interesse (ROI): prelimbic mPFC, infralimbica mPFC, nucleo NAC, NAC conchiglia, nuclei AMY basolaterale, AMY centro-cortico-mediale, dorsale striato, e VTA. Delineano se c-Fos immunoreattività era presente in TH + e th- cellule del VTA. Figura 1 fornisce un quadro acquisito dallo schermo del NAC dal microscopio.

figure-protocol-8574
Figura 1. Rappresentante sezione del nucleo accumbens (NAC) Visualizzazione Regioni di interesse delineati dalla griglia con cui Conti c-fos sono fatti. Il guscio NAC è trovato medialmente e ventralmente al nucleo NAC. Il nucleo NAC circonda la commessura anteriore (anteriore Comm.). L'estensione ventrale del ventricolo laterale (laterale Vent.) È visibile. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

  1. Analizzare almeno tre fette rappresentante per luogo comune a tutti gli animali in tutte le condizioni di prova.
  2. Utilizzare software e un microscopio ottico per analizzare l'intera regione per ogni ROI tracciando un contorno (Figura 1).
    1. Per un determinato sito, aprire l'applicazione e fare clic sul menu a discesa acquisizione e fare clic su "Live Immagine". Portare il ROI a fuoco e fare clic sullo schermo per stabilire un punto di riferimento. poi TRace la regione del cervello scelta usando la griglia come guida. Una volta che la traccia è stata completata, contare le celle (passi 5.3.1.1 - 5.3.1.3).
      1. Fare doppio clic sull'icona del software. Vai alla barra dei menu, cliccare su "Acquisizione" e poi "Immagine diretta". Portare il ROI a fuoco e fare clic sullo schermo per stabilire un punto di riferimento.
      2. Vai alla barra degli strumenti di rete e fare clic su "Visualizza griglia" e "etichette Usa griglia". Delineare il ROI con una traccia prestabilita.
      3. Contare tutte le cellule in ogni area del ROI, selezionare un "+" nella barra laterale di sinistra per tenere il conto delle cellule c-fos. Fare clic su ciascuna cella singolarmente per registrare i conteggi. Si consideri una cellula positiva per c-fos quando un cerchio rosso scuro definito è osservato (Figura 1).
    2. Ripetere questa procedura per ogni sito.
    3. Record risiedono in un quaderno di laboratorio e sul computer per analisi future. Vai alla barra dei menu, cliccare su "File", "Salva file di dati" per salvare il tracciato e conta.
  3. Assicurarsi che l'affidabilità inter-rater (utilizzando la correlazione di conteggi) dei due valutatori disinformati per ogni sezione in ogni ROI supera sempre 0.8.

6. Statistiche

  1. Valutare prese saccarina di base nel corso dei primi quattro giorni utilizzando un ripetute misure di analisi 1 della varianza (ANOVA) confrontando le prese saccarina di giorni 1, 2, 3 e 4 69.
  2. Confrontare l'assunzione di saccarina (4 ° giorno) con prese di prova (giorno 5) dei sei gruppi utilizzando un blocco randomizzato a 2 vie ANOVA 69.
  3. Utilizzare i confronti Tukey (p <0.05) per determinare i singoli effetti significativi 69.
  4. Determinare l'affidabilità inter-rater, e quindi utilizzare i conteggi di un osservatore comune.
  5. Conta media c-fos per i tre fette di rappresentanza per ogni sito 69.
    1. Eseguire 1 ANOVA dell'attivazione c-fos indotta da assunzione dei sei soluzioni (olio 3,5% di mais, 8% di glucosio, fruttosio 8%, 0,2% saccarina aromatizzato, xaControllo Nthan gomma e acqua) per la perilimbic mPFC 69.
    2. analisi parallele Ripetere dei sei gruppi per infralimbica mPFC, nucleo NAC, NAC guscio, basolaterale AMY, AMY centro-cortico-mediale, VTA e dorsale striato. Utilizzare i confronti Tukey (p <0.05) per rivelare i singoli effetti significativi 69.
  6. Confrontare l'assunzione di olio di mais sia con l'assunzione di acqua e l'assunzione di suo agente sospensioni, gomma xantano. Confronta fruttosio e glucosio prese sia con l'assunzione di acqua e l'assunzione del dolcificante non nutritivo, la saccarina.
  7. Stabilire se le relazioni significative tra le prese di soluzioni e l'attivazione di c-fos in ciascuno dei siti sono state osservate correlazioni con r Bonferroni (p <0.05).
    1. confrontare sistematicamente conta c-fos nella perilimbic e infralimbica corteccia pre-frontale per ogni animale nel gruppo olio di mais 3,5%.
    2. Ripetere le analisi sistematicamente paralleli di ogni coppia di sei siti (VTA, striato dorsale, infralimbic mPFC, perilimbic mPFC, nucleo NAC, NAC guscio, basolaterale AMY, centrale-cortico-mediale AMY) per l'olio di mais 3,5%.
    3. Ripetere le analisi sistematica parallele di questi sei siti per gli altri cinque condizioni di assunzione sperimentali (8% di glucosio, fruttosio 8%, 0,2% saccarina aromatizzato, di controllo gomma di xantano e acqua).
  8. Approfitta del fatto che gli stessi animali all'interno di una condizione di soluzione sono stati valutati in tutti i siti determinando relazioni significative tra l'attivazione di c-fos attraverso soluzioni e all'interno di ogni soluzione utilizzando Bonferroni r correlazioni (p <0.05).

Risultati

Tutti i risultati rappresentativi descritti di seguito sono stati pubblicati in precedenza 69, e sono nuovamente qui presentata a supporto della "prova di concetto" nell'indicare l'efficacia della tecnica.

Soluzione Prese
sono state osservate differenze significative negli apporti saccarina di base nel corso dei primi quattro giorni per tutti gli animali (F (3.108) = 57.27, ...

Discussione

L'obiettivo dello studio era quello di determinare se la fonte (VTA) e gli obiettivi di proiezione prosencefalo (NAC, Amy, mPFC) di DA neuroni ricompensa legati sono stati attivati ​​contemporaneamente dopo romanzo ingestione di grassi e zuccheri nei ratti con la tecnica del cellulare, c-fos . Il presente studio è una descrizione dettagliata dei protocolli di uno studio pubblicato in precedenza 69. E 'stato ipotizzato che il VTA, i suoi principali zone di proiezione al prelimbic e infralimbica mP...

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Grazie a Diana Icaza-Culaki, Cristal Sampson e Theologia Karagiorgis per il loro duro lavoro su questo progetto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Sprague-Dawley ratsCharles River LaboratoriesCD-1
Wire Mesh CagesLab Products, Seaford, DE30-Cage rack
Rat ChowPMI Nutrition International5001
Taut Metal SpringLab Products, Seaford, DEn/a
Rat Weighing ScaleFisher Scientific Companyn/a
Nalgene Centrifuge TubesLab Products, Seaford, DE10-0501
Rubber StopperLab Products, Seaford, DEn/a
Metal SippersLab Products, Seaford, DEn/a
SaccharinSigma Chemical Co82385-42-0
Kool-Aid, CherryKool-AidCommerical
Kool-Aid, GrapeKool-AidCommercial
FructoseSigma Chemical CoF0127
GlucoseSigma Chemical CoG8270
Corn OilMazzolaCommerical
Xanthan GumSigma Chemical Co11138-66-2
Sliding MicrotomeMicrom Internationaln/a
Neurolucida CameraMBF BioscienceSoftware application
Gelatin-coated SlidesFisher Scientific Company12-550-343
Cover glassFisher Scientific Company12-545-M
Golden Nylon BrushesLoew-Cornell 2037
Natural Hair Sable Loew-Cornell 2022
24 Well PlatesFisher Scientific3527
6 Well PlatesFisher Scientific3506
1 L Pyrex bottlesFisher Scientific1395-1L
Tissue insert (tissue strainer)Fisher Scientific7200214
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE10 for 1-10μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE100 for 20-100μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE200 for 50-200μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE1000 for 100-1000μl
Eagle pipettes World Precision InstrumentsE5000 for 1000-5000μl 
Universal Tips .1-10 μlWorld Precision Instruments500192
Universal Tips 5-200 μlWorld Precision Instruments500194
Universal Tips 500-5,000 μlWorld Precision Instruments500198
Blade Vibroslice 100World Precision InstrumentsBLADE
DPX Mounting Medium Electron Microscopy 13510
15 ml centrifuge tubesBiologix Research Co.10-0501
Slide BoxesBiologix Research Co.41-6100
Orbital Shaker Madell Corporation  ZD-9556
weigh boats Fisher Scientific02-202-100
5 ml disposable pipettesFisher Scientific13-711-5AM
Stereo Investigator SoftwareMicro Bright FieldSoftware application
NameCompanyCatalog numberComments
Reagents
Paraformaldehyde GranularFisher Scientific19210
NaClFisher ScientificS271-1
Sodium Phophate MonobasicFisher ScientificS468-500
Sodium Phosphate DiphasicFisher ScientificBP332-500
Hydrogen Peroxide Fisher ScientificH324-500
SafeClear II Fisher Scientific23-044-192
Methanol Fisher ScientificA412-1
Normal Goat SerumVectorS-1000
Biotinylated Anti-Rabbit IgG (H+L)VectorBA-1000
ABC Kit Peroxidase StandardVectorPK-4000
Anti-cFos (Ab-5) RabbitEMD chem/Cal BiochemPC38
Triton X 100SigmaAldrichX-100
3,3' diaminobenzidine tetra hydrochloride SigmaAldrichD5905
Sodium HydroxideSigmaAldrich5881
Primary TH anti bodyEMD MilliporeAB152
EuthosolVirbac AH

Riferimenti

  1. Koob, G. F. Neural mechanisms of drug reinforcement. Ann. N.Y. Acad. Sci. 654, 171-191 (1992).
  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
  4. Horvitz, J. C., Choi, W. Y., Morvan, C., Eyny, Y., Balsam, P. D. A "good parent" function of dopamine: transient modulation of learning and performance during early stages of training. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1104, 270-288 (2007).
  5. Wickens, J. R., Horvitz, J. C., Costa, R. M., Killcross, S. Dopaminergic mechanisms in actions and habits. J. Neurosci. 27, 8181-8183 (2007).
  6. Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
  7. Swanson, L. W. The projections of the ventral tegmental area and adjacent regions: a combined fluorescent retrograde tracer and immunofluorescence study in the rat. Brain Res. Bull. 9, 321-353 (1982).
  8. Cacciapaglia, F., Wrightman, R. M., Careli, R. M. Rapid dopamine signaling differentially modulates distinct microcircuits within the nucleus accumbens during sucrose-directed behavior. J. Neurosci. 31, 13860-13869 (2011).
  9. Martinez-Hernandez, J., Lanuza, E., Martinez-Garcia, F. Selective dopaminergic lesions of the ventral tegmental area impair preference for sucrose but not for male sex pheromones in female mice. Eur. J. Neurosci. 24, 885-893 (2006).
  10. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential influence of associative and nonassociative learning mechanisms on the responsiveness of prefrontal and accumbal dopamine transmission to food stimuli in rats fed ad libitum. J. Neurosci. 17, 851-861 (1997).
  11. Bassareo, V., Di Chiara, G. Differential responsiveness of dopamine transmission to food-stimuli in nucleus accumbens shell/core compartments. Neurosci. 89, 637-641 (1999).
  12. Cheng, J., Feenstra, M. G. Individual differences in dopamine efflux in nucleus accumbens shell and core during instrumental conditioning. Learn. Mem. 13, 168-177 (2006).
  13. Genn, R. F., Ahn, S., Phillips, A. G. Attenuated dopamine efflux in the rat nucleus accumbens during successive negative contrast. Behav. Neurosci. 118, 869-873 (2004).
  14. Hajnal, A., Norgren, R. Accumbens dopamine mechanisms in sucrose intake. Brain Res. 904, 76-84 (2001).
  15. Hajnal, A., Smith, G. P., Norgren, R. Oral sucrose stimulation increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. 286, R31-R37 (2003).
  16. Bassareo, V., Di Chiara, G. Modulation of feeding-induced activation of mesolimbic dopamine transmission by appetitive stimuli and its relation to motivational state. Eur. J. Neurosci. 11, 4389-4397 (1999).
  17. Hajnal, A., Lenard, L. Feeding-related dopamine in the amygdala of freely moving rats. Neuroreport. 8, 2817-2820 (1997).
  18. Bassareo, V., De Luca, M. A., Di Chiara, G. Differential expression of motivational stimulus properties by dopamine in nucleus accumbens shell versus core and prefrontal cortex. J. Neurosci. 22, 4709-4719 (2002).
  19. Feenstra, M., Botterblom, M. Rapid sampling of extracellular dopamine in the rat prefrontal cortex during food consumption, handling, and exposure to novelty. Brain Res. 742, 17-24 (1996).
  20. Hernandez, L., Hoebel, B. G. Feeding can enhance dopamine turnover in the prefrontal cortex. Brain Res. Bull. 25, 975-979 (1990).
  21. Liang, N. C., Hajnal, A., Norgren, R. Sham feeding corn oil increases accumbens dopamine in the rat. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291, R1236-R1239 (2006).
  22. Dunnett, S. B., Iversen, S. D. Regulatory impairments following selective kainic acid lesions of the neostriatum. Behav. Brain Res. 1, 497-506 (1980).
  23. Salamone, J. D., Zigmond, M. J., Stricker, E. M. Characterization of the impaired feeding behavior in rats given haloperidol or dopamine-depleting brain lesions. Neurosci. 39, 17-24 (1990).
  24. Kelley, A. E. Ventral striatal control of appetitive motivation: role in ingestive behavior and reward-related learning. Neurosci. Biobehav. Rev. 27, 765-776 (2004).
  25. Kelley, A. E. Memory and addiction: shared neural circuitry and molecular mechanisms. Neuron. 44, 161-179 (2004).
  26. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E. A proposed hypothalamic-thalamic-striatal axis for the integration of energy balance, arousal and food reward. J. Comp. Neurol. 493, 72-85 (2005).
  27. Kelley, A. E., Baldo, B. A., Pratt, W. E., Will, M. J. Corticostriatal-hypothalamic circuitry and food motivation: integration of energy, action and reward. Physiol. Behav. 86, 773-795 (2005).
  28. Berendse, H. W., Galis-de-Graaf, Y., Groenewegen, H. J. Topographical organization and relationship with ventral striatal compartments of prefrontal corticostriatal projections in the rat. J. Comp. Neurol. 316, 314-347 (1992).
  29. Brog, J. S., Salyapongse, A., Deutch, A. Y., Zahm, D. S. The patterns of afferent innervation of the core and shell in the "accumbens" part of rat ventral striatum: immunohistochemical detection of retrogradely transported fluoro-gold. J. Comp. Neurol. 338, 255-278 (1993).
  30. McDonald, A. J. Organization of amygdaloid projections to the prefrontal cortex and associated stritum in the rat. Neurosci. 44, 1-14 (1991).
  31. McGeorge, A. J., Faull, R. L. The organization of the projection from the cerebral cortex to the striatum in the rat. Neurosci. 29, 503-537 (1989).
  32. Sesack, S. R., Deutch, A. Y., Roth, R. H., Bunney, B. S. Topographical organization of the efferent projections of the medial prefrontal cortex in the rat: an anterograde tract-tracing study with Phaseolus vulgaris leucoagglutinin. J. Comp. Neurol. 290, 213-242 (1989).
  33. Wright, C. I., Beijer, A. V., Groenewegen, H. J. Basal amygdaloid complex afferents to the rat nucleus accumbens are compartmentally organized. J. Neurosci. 16, 1877-1893 (1996).
  34. Wright, C. I., Groenewegen, H. J. Patterns of convergence and segregation in the medial nucleus accumbens of the rat: relationships of prefrontal cortical, midline thalamic and basal amygdaloid afferents. J. Comp. Neurol. 361, 383-403 (1995).
  35. Geary, N., Smith, G. P. Pimozide decreases the positive reinforcing effect of sham fed sucrose in the rat. Pharmacol. Biochem. Behav. 22, 787-790 (1985).
  36. Muscat, R., Willner, P. Effects of selective dopamine receptor antagonists on sucrose consumption and preference. Psychopharmacol. 99, 98-102 (1989).
  37. Schneider, L. H., Gibbs, J., Smith, G. P. D-2 selective receptor antagonists suppress sucrose sham feeding in the rat. Brain Res. Bull. 17, 605-611 (1986).
  38. Baker, R. W., Osman, J., Bodnar, R. J. Differential actions of dopamine receptor antagonism in rats upon food intake elicited by mercaptoacetate or exposure to a palatable high-fat diet. Pharmacol. Biochem. Behav. 69, 201-208 (2001).
  39. Rao, R. E., Wojnicki, F. H., Coupland, J., Ghosh, S., Corwin, R. L. Baclofen, raclopride and naltrexone differentially reduce solid fat emulsion intake under limited access conditions. Pharmacol. Biochem. Behav. 89, 581-590 (2008).
  40. Weatherford, S. C., Smith, G. P., Melville, L. D. D-1 and D-2 receptor antagonists decrease corn oil sham feeding in rats. Physiol. Behav. 44, 569-572 (1988).
  41. Azzara, A. V., Bodnar, R. J., Delamater, A. R., Sclafani, A. D1 but not D2 dopamine receptor antagonism blocks the acquisition of a flavor preference conditioned by intragastric carbohydrate infusions. Pharmacol. Biochem. Behav. 68, 709-720 (2001).
  42. Baker, R. M., Shah, M. J., Sclafani, A., Bodnar, R. J. Dopamine D1 and D2 antagonists reduce the acquisition and expression of flavor-preferences conditioned by fructose in rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 75, 55-65 (2003).
  43. Dela Cruz, J. A., Coke, T., Icaza-Cukali, D., Khalifa, N., Bodnar, R. J. Roles of NMDA and dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of flavor preferences conditioned by oral glucose in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 114, 223-230 (2014).
  44. Dela Cruz, J. A., et al. Roles of dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fat-conditioned flavor preferences in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 97, 332-337 (2012).
  45. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Pharmacology of flavor preference conditioning in sham-feeding rats: effects of dopamine receptor antagonists. Pharmacol. Biochem. Behav. 65, 635-647 (2000).
  46. Yu, W. Z., Silva, R. M., Sclafani, A., Delamater, A. R., Bodnar, R. J. Role of D(1) and D(2) dopamine receptors in the acquisition and expression of flavor-preference conditioning in sham-feeding rats. Pharmacol. Biochem. Behav. 67 (1), 537-544 (2000).
  47. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Activation of dopamine D1-like receptors in nucleus accumbens is critical for the acquisition, but not the expression, of nutrient-conditioned flavor preferences in rats. Eur. J. Neurosci. 27, 1525-1533 (2008).
  48. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Dopamine D1-like receptor antagonism in amygdala impairs the acquisition of glucose-conditioned flavor preference in rats. Eur. J. Neurosci. 30, 289-298 (2009).
  49. Touzani, K., Bodnar, R. J., Sclafani, A. Acquisition of glucose-conditioned flavor preference requires the activation of dopamine D1-like receptors within the medial prefrontal cortex in rats. Neurobiol. Learn. Mem. 94, 214-219 (2010).
  50. Malkusz, D. C., et al. Dopamine signaling in the medial prefrontal cortex and amygdala is required for the acquisition of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 233, 500-507 (2012).
  51. Bernal, S. Y., et al. Role of dopamine D1 and D2 receptors in the nucleus accumbens shell on the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor-flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 190, 59-66 (2008).
  52. Bernal, S. Y., et al. Role of amygdala dopamine D1 and D2 receptors in the acquisition and expression of fructose-conditioned flavor preferences in rats. Behav. Brain Res. 205, 183-190 (2009).
  53. Dragunow, M., Faull, R. The use of c-fos as a metabolic marker in neuronal pathway tracing. J. Neurosci. Methods. 29, 261-265 (1989).
  54. VanElzakker, M., Fevurly, R. D., Breindel, T., Spencer, R. L. Environmental novelty is associated with a selective increase in Fos expression in the output elements of the hippocampal formation and the perirhinal cortex. Learn. Mem. 15, 899-908 (2008).
  55. Norgren, R., Hajnal, A., Mungarndee, S. S. Gustatory reward and the nucleus accumbens. Physiol. Behav. 89, 531-535 (2006).
  56. Park, T. H., Carr, K. D. Neuroanatomical patterns of fos-like immunoreactivity induced by a palatable meal and meal-paired environment in saline- and naltrexone-treated rats. Brain Res. 805, 169-180 (1998).
  57. Zhao, X. L., Yan, J. Q., Chen, K., Yang, X. J., Li, J. R., Zhang, Y. Glutaminergic neurons expressing c-Fos in the brainstem and amygdala participate in signal transmission and integration of sweet taste. Nan.Fang Yi.Ke.Da.Xue.Xue.Bao. 31, 1138-1142 (2011).
  58. Mungarndee, S. S., Lundy, R. F., Norgren, R. Expression of Fos during sham sucrose intake in rats with central gustatory lesions. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R751-R763 (2008).
  59. Otsubo, H., Kondoh, T., Shibata, M., Torii, K., Ueta, Y. Induction of Fos expression in the rat forebrain after intragastric administration of monosodium L-glutamate, glucose and NaCl. Neurosci. 196, 97-103 (2011).
  60. Yamamoto, T., Sako, N., Sakai, N., Iwafune, A. Gustatory and visceral inputs to the amygdala of the rat: conditioned taste aversion and induction of c-fos-like immunoreactivity. Neurosci. Lett. 226, 127-130 (1997).
  61. Mitra, A., Lenglos, C., Martin, J., Mbende, N., Gagne, A., Timofeeva, E. Sucrose modifies c-fos mRNA expression in the brain of rats maintained on feeding schedules. Neurosci. 192, 459-474 (2011).
  62. Pecoraro, N., Dallman, M. F. c-Fos after incentive shifts: expectancy, incredulity, and recovery. Behav. Neurosci. 119, 366-387 (2005).
  63. Hamlin, A. S., Blatchford, K. E., McNally, G. P. Renewal of an extinguished instrumental response: Neural correlates and the role of D1 dopamine receptors. Neurosci. 143, 25-38 (2006).
  64. Kerfoot, E. C., Agarwal, I., Lee, H. J., Holland, P. C. Control of appetitive and aversive taste-reactivity responses by an auditory conditioned stimulus in a devaluation task: A FOS and behavioral analysis. Learn. Mem. 14, 581-589 (2007).
  65. Zhang, M., Kelley, A. E. Enhanced intake of high-fat food following striatal mu-opioid stimulation: microinjection mapping and fos expression. Neurosci. 99, 267-277 (2000).
  66. Teegarden, S. L., Scott, A. N., Bale, T. L. Early life exposure to a high fat diet promotes long-term changes in dietary preferences and central reward signaling. Neurosci. 162, 924-932 (2009).
  67. Del Rio, D., et al. Involvement of the dorsomedial prefrontal cortex in high-fat food conditioning in adolescent mice. Behav. Brain Res. 283, 227-232 (2015).
  68. Knapska, E., Radwanska, K., Werka, T., Kaczmarek, L. Functional internal complexity of amygdala: focus on gene activity mapping after behavioral training and drugs of abuse. Physiol. Rev. 87, 1113-1173 (2007).
  69. Dela Cruz, J. A. D., et al. c-Fos induction in mesotelencephalic dopamine pathway projection targets and dorsal striatum following oral intake of sugars and fats in rats. Brain Res. Bull. 111, 9-19 (2015).
  70. Paxinos, G., Watson, C. . The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2006).
  71. Ranaldi, R., et al. The effects of VTA NMDA receptor antagonism on reward-related learning and associated c-fos expression in forebrain. Behav. Brain Res. 216, 424-432 (2011).

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

NeuroscienzeNumero 114neuroscienze comportamentaliimmunoreattivit C fosl assunzione di zuccheroassunzione di grassiricompensadi stimolare l appetitoamigdalala corteccia mediale prefrontalenucleo accumbenscaudato putamenventrale tegmentalerete distribuita del cervello

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati