El estudio de la Organización Supramolecular de membranas fotosintéticas dentro de los tejidos foliares fracturados-Freeze por Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

Resumen

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Resumen

microscopía electrónica de Cryo-barrido (SEM) de las muestras de congelación-fractura permite la investigación de estructuras biológicas en condiciones nativas cerca. A continuación, describimos una técnica para el estudio de la organización supramolecular de fotosintéticos membranas tilacoides () dentro de las muestras de hojas. Esto se consigue mediante la congelación de alta presión de tejidos de las hojas, congelación-fractura, recubrimiento de doble capa y, finalmente, formación de imágenes cryo-SEM. El uso del método de recubrimiento de doble capa permite la adquisición de gran aumento (> 100,000X) imágenes con daño haz mínimo para las muestras congeladas hidratado así como los efectos de carga mínimas. Utilizando los procedimientos descritos investigamos las alteraciones en la distribución del fotosistema supramolecular y proteínas antena captador de luz complejos que tienen lugar durante la deshidratación de la planta de la resurrección Craterostigma pumilum, in situ.

Introducción

fotosíntesis oxigénica, originarios de la antigua cianobacterias, fue heredado por las algas y las plantas de la tierra por los acontecimientos que llevaron a endosymbiotic desarrollo del cloroplasto. En todos los oxigénica fototrofas de hoy en día, el transporte de electrones fotosintética y la generación de la fuerza protón-motriz y el poder reductor se llevan a cabo dentro de las vesículas en forma de sacos aplanados denominadas membranas tilacoides ''. Estas membranas albergan los complejos de proteínas que llevan a cabo las reacciones impulsada por la luz de la fotosíntesis y proporcionan un medio para la transducción de energía. Las membranas de los tilacoides de plantas y (algunos) las algas se diferencian en dos dominios morfológicas distintas: las regiones de membrana fuertemente adpresas llamados «grana» y las membranas apiladas que interconectan la grana, llamados 'estroma laminillas ^«1. Se han realizado diversos estudios de congelación-fractura de la planta y membranas tilacoides de algas, a partir de la década de 1970. Cuando por congelación fracturado, membranasdividir a lo largo de su núcleo hidrofóbico ^2, generando una cara exoplasmic (EF) y una cara protoplasmática (PF), en función del compartimento celular que las fronteras de entramado de membrana, como acuñado originalmente por Branton et al. . en 1975 ³ Planta y tilacoides de algas tienen cuatro diferentes caras de fractura: los EF, EFU, SLP y la UFP, con 's' y que denotan y regiones de membrana '' 'no apiladas apilados' 'U', respectivamente. Los complejos de proteínas de membrana, que no se dividen o se rompe, tienen la tendencia a permanecer ya sea con el E o P lado de la membrana. Las observaciones iniciales de que las diferentes caras de fractura de los tilacoides contienen partículas de diferentes tamaños y densidades ^4, y las numerosas investigaciones que siguieron, condujeron a la identificación y correlación entre las partículas observadas y los complejos de proteínas de membrana que llevan a cabo las reacciones de luz ^5-13 (véase también revisa ^14,15).

Freexperimentos eze-fractura de membranas tilacoides se llevan a cabo normalmente en preparaciones de cloroplastos o membranas tilacoides aisladas (pero véase ^16,17), con el riesgo de cualquier alteración en la organización estructural y / o supramolecular que pueda ocurrir durante el procedimiento de aislamiento. Después de la fractura, las réplicas se preparan por evaporación de platino / carbono (Pt / C), a continuación, por una gruesa capa de carbono (C), y finalmente digestión del material biológico ^18. Réplicas se visualizan por microscopía electrónica de transmisión (TEM). La técnica tradicional de congelación-fractura-réplica continúa sirviendo como una herramienta importante para el estudio de la organización supramolecular de las membranas fotosintéticas y su adaptación a las diferentes, por ejemplo., La luz, las condiciones de ^19-23.

En nuestro reciente estudio de la planta de la resurrección homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum ^24, que tuvo como objetivo investigar los cambios en la organización supramolecular omembranas tilacoides f, así como en la organización celular en general, durante la deshidratación y la rehidratación. La singularidad de las especies de resurrección homoiochlorophyllous es que son capaces de sobrevivir a las condiciones de desecación en sus tejidos vegetativos (hojas), al tiempo que conserva su aparato fotosintético. Una vez que se dispone de agua, estas plantas recuperar y reanudar la actividad fotosintética en cuestión de horas a unos pocos días ^25. Para este estudio, EM crio-barrido (SEM) de imágenes de muestras de hojas de congelación-fractura se combinó con alta presión de congelación para la muestra crio-inmovilización. Estos procedimientos proporcionan un medio para visualizar muestras biológicas congelados-hidratados en un estado cercano a su estado natal ^26. Un beneficio principal es que las muestras se examinan directamente después de congelación-fractura y revestimiento sin pasos sucesivos. Esto es particularmente pertinente para la investigación de las plantas en diferentes contenidos de agua relativos (RWC), ya que su estado de hidratación se mantiene durante la preparación. Cómosiempre, una desventaja fundamental es que las muestras congeladas hidratado pueden sufrir de daño haz durante la exploración, especialmente cuando se escanea con grandes aumentos, necesarias para la medición precisa del tamaño de los complejos fotosintéticos. Para superar esto, un método llamado "recubrimiento de doble capa '(DLC) ^27,28 combinado con se utilizaron condiciones específicas de formación de imágenes cryo-SEM. Estos dieron lugar a muestras que son significativamente menos sensibles a la viga y se dejan para el esclarecimiento de información valiosa sobre la organización supramolecular proteína fotosintética y otros constituyentes celulares de la planta de la resurrección C. pumilum con grandes aumentos en situ.

Protocolo

1. Cryo-fijación de tejidos de hojas por medio de congelamiento de alta presión

Nota: En esta sección se describe cómo llevar a cabo la congelación de alta presión de los tejidos de las hojas para un experimento de congelación-fractura. Por consideraciones relacionadas con muestras de plantas ver ^29. Esto se puede adaptar para otros tipos de tejidos o muestras con alguna modificación.

1. El uso de la esquina de una hoja de afeitar, rayar la parte inferior de la cavidad de 0,1 mm de una plaqueta de aluminio 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Preparar al menos una docena de plaquetas (6 muestras). Tome la precaución de no crear marcas de cuchillo en la circunferencia del disco.
   1. Después de rascarse, lavar los discos en etanol absoluto, dejarlos secar y guardar en un plato limpio.
2. Preparar la máquina de congelación de alta presión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Llene la cámara de alcohol de la máquina de congelación de alta presión con isopropanol.
3. Preparar una infiltratio asistida por vacío caseron dispositivo para reemplazar el gas que se encuentra en el tejido de la hoja con el líquido.
   1. conectar firmemente una punta de pipeta 200 l al final de una jeringuilla de 10 ml. Cortar ~ 1 cm de la punta. Hacer un agujero en la tapa de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a encajar con firmeza la punta de corte. De vacío puede ser creado en el interior del tubo, tirando del émbolo de la jeringa.
4. Cortar un pequeño trozo de hoja de la planta utilizando una cuchilla de afeitar y con pinzas colocar la hoja en el interior de un tubo de microcentrífuga medio lleno con 1-hexadeceno. Infiltrarse en los espacios intercelulares de la hoja con el líquido tirando suavemente el émbolo para crear el vacío, mantenga durante unos 30 segundos, y luego liberar lentamente el émbolo.
5. Retire la pieza de la hoja del tubo con unas pinzas. Recorte la hoja con una hoja de afeitar en caso de que es más gruesa que 0,2 mm y cortar un pedazo pequeño que quepa en una plaqueta.
6. Colocar una plaqueta limpia con la cara arañada en el soporte de la máquina de congelación y luego colocar la pieza cortada de leaf en la plaqueta. Llenar el espacio restante que rodea la hoja con 1-hexadeceno. Cerrar el sándwich utilizando otro plaquetas, con los arañazos que se enfrenta la hoja.
7. Cierre y apriete el soporte y la inserta en la cámara de la máquina. A continuación, pulse el botón 'Jet' para congelar (~ 2.100 bares durante 300 - 500 ms), y transferir rápidamente el soporte en nitrógeno líquido. Retirar con cuidado el sándwich de helado del soporte con unas pinzas pre-enfriado, teniendo cuidado de no fracturar el sándwich.
   Nota: bocadillos congelados cerrado puede ser helada fracturada inmediatamente o guardado en nitrógeno líquido para su uso posterior. Use ropa protectora y gafas de protección al manejo de nitrógeno líquido.

2. Freeze-fractura y doble capa de revestimiento ^27,28

1. Preparar la máquina de fractura por congelación para su uso, incluyendo tanto los cañones para la evaporación de platino / carbono (Pt / C) y de carbono, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Coloque la pistola de Pt / C a 45 grados unand la pistola de carbono a 90 grados.
   1. Pre-programa de un sistema de protección de una capa de 2 nm de Pt / C (velocidad de revestimiento 0,02-0,04 nm / sec) y una capa de 6 nm de carbono (a ~ 0,1 nm / seg).
      1. Entrar en la configuración en la pantalla de la máquina de congelación-fractura. Seleccionar un número de usuario donde se guardará el sistema de protección.
      2. Elija Pt / C de 'capa 1'. Seleccione un marco de tiempo, por ejemplo., 5 min (para superar el tiempo necesario necesario para completar el recubrimiento). Utilice las flechas arriba-abajo para definir un espesor de 2 nm.
      3. Pulse el botón 'Capa' para mover a la Capa 2. Repita el paso 2.1.1.2, excepto que seleccione carbono y definir un espesor de 6 nm.
   2. Probar y ajustar el funcionamiento del arma.
      1. Seleccione 'capa 1'. Seleccione la pistola Pt / C pulsando el botón 'gun1' y presione el botón "ON" en la unidad de control de la evaporación de la máquina de congelación-fractura. Monitorear la tasa de evaporación y ajustarlo mediante los mandos de tensión y de emisión until alcanzando una tasa de 0,02 - 0,04 nm / seg. Presione "OFF" para apagar la pistola de Pt / C.
      2. Seleccione 'Capa 2'. Repita 2.1.2.1, excepto 'GUN2' para seleccionar y ajustar una velocidad de evaporación de ~ 0,1 nm / seg.
2. Se enfría la etapa de congelación del sistema de fracturas a -140 ºC o -160 ° C (para hojas hidratadas o deshidratadas, respectivamente). Una el servicio de traslado al crio de vacío a la máquina y llenar su cámara con nitrógeno líquido. La presión en la cámara de congelación-fractura enfriado es por lo general entre 1 - 8 x 10 ^-7 mbar.
3. Inserte un soporte de muestras congelación de fracturación (adecuado para las plaquetas de 3 mm) en la estación de carga. Inundar la cámara de la estación de carga con nitrógeno líquido.
4. Cargar dos bocadillos congelados sobre el titular de uno por uno con unas pinzas de grado alto de precisión. Apretar el primer sándwich en el soporte y luego darle la vuelta al titular a comprobar que se ajusta de forma segura en su lugar. Repita para el segundo sándwich.
5. reEtach el servicio de transporte refrigerado de la máquina de fractura por congelación y conectarlo a la estación de carga. Abra la válvula de doble efecto, introducir el brazo de retracción en el soporte y bloquearlo en su sitio. Reintroducir el brazo con el soporte en el servicio de transporte y cierre la válvula de doble efecto con el mando de la estación de carga. Una el servicio de transporte a la máquina de congelación-fractura e introducir el soporte en la cámara con el brazo de retracción. Separar el servicio de transporte de la máquina.
6. Alinear la cuchilla del micrótomo fractura de congelación a una altura tal que va a golpear de las plaquetas superiores de los sándwiches.
7. Con el cuchillo microtomo, se rompe con facilidad los sándwiches, e inmediatamente después levantarlo para evitar la contaminación de las muestras por el apego escombros para el cuchillo, y girar el obturador enfriado por encima del plano recién expuesta para proteger las muestras de la posible contaminación por moléculas de agua en la Cámara.
8. Cubrir las muestras con platino y carbono.
   1. Entre 'capa 1' en la screen. Encienda el arma Pt / C pulsando el botón 'gun1' seguido por el botón 'ON'. Examinar la tasa de evaporación y una vez que se alcanza de 0.02 - 0,04 nm / seg, al mismo tiempo exponer las muestras y pulse el botón "Medir" para controlar el espesor de la capa depositada.
      Nota: Pistola se apagará automáticamente cuando el espesor se ha alcanzado el valor preseleccionado.
   2. Cubrir las muestras con el obturador cuando se completa Pt / C evaporación.
   3. Pulse el botón 'Capa' para pasar a "capa 2 '. Repetir los pasos 2.8.1 y 2.8.2, con la excepción de la selección 'GUN2' (por carbono) y una velocidad de evaporación de ~ 0,1 nm / seg.
9. Se calienta la fase del sistema de fracturas congelación a -120 ° C.

3. Cryo-Microscopía Electrónica de Barrido

1. Preparar el microscopio electrónico de barrido para el trabajo crio.
   1. Seleccione la etapa / de la etapa de iniciación en el menú principal y confirme.
   2. Seleccione Herramientas / Goto Panel, y abra el panel "bolsa de aire", seleccionándolo de la lista. Haga clic en el botón "Cerrar Columna cámara de la válvula. Ventilar la cámara microscopio haciendo clic en el botón de Vent bajo la etiqueta de 'vacío'.
   3. Seleccione Herramientas / Panel de Goto, y abra el panel "Lista de Puntos de Stage. Seleccione la posición de intercambio de la crio para mover la etapa a las coordenadas apropiadas para aceptar el soporte de muestra. Nota: La posición de intercambio crio 'está programado para estar en alineación con la posición de la unidad de transferencia de vacío.
   4. Abrir la cámara de muestras con un par de guantes limpios e inserte la etapa crio en el escenario principal del microscopio. Cerrar la cámara y haga clic en el botón de la bomba bajo la pestaña de vacío '.
   5. Se enfría el microscopio para -120 ° C. Llenar el microscopio Dewar con nitrógeno líquido. Active la función de calor en la unidad de control de la crio-transferencia a -120 ° C una vez que la temperatura de la fase desciende por debajo de -120 ° C.
2. attACH del transbordador crio-traslado al microscopio y transferir el soporte de la muestra utilizando el brazo de retracción en la platina del microscopio crio (como en el paso 2.5). Separar el transporte desde el microscopio.
3. Haga clic en el botón 'Open Columna cámara de válvula' en el panel de bolsa de aire.
4. mover con cuidado el soporte de la muestra cerca de la lente objetivo (distancia de trabajo de 1 - 2 mm) utilizando el joystick. Seleccione una abertura de 10 micras en la pestaña '' Las aberturas. Haga doble clic en el campo EHT en la pestaña 'Gun'. Introduzca 10 (kV) para el objetivo EHT y haga clic en OK. Haga clic en la pestaña EHT inferior y seleccione 'EHT On'.
5. Seleccionar '' InLens de la lista desplegable de detectores en la pestaña 'Detectores'. Optimizar las condiciones de formación de imágenes (enfoque, brillo y contraste, alineación del balancín, astigmatismo), según proceda.
6. Haga clic en la pestaña 'escaneado'. Elija una exploración rápida ( "Velocidad de exploración = 1 ', que corresponde a un tiempo de permanencia de 100 nseg por píxel) para minimizar el daño del haz, yuna "resolución de la tienda 'de 1.024 x 768 píxeles. Seleccione 'Línea Promedio' en la lista desplegable 'Reducción de ruido'. Ajuste el valor de N a 20 - 30 líneas para la búsqueda. Mover la muestra usando la función 'Centre Point' (pulsando Control-Tab en el teclado) para buscar regiones con células fracturadas y cloroplastos (Figuras 2A y 2B).
7. Adquirir imágenes de los cloroplastos fracturados a bajos aumentos (50 - 70 KX) (Figura 2C y 2D). Utilice la función de 'Centro de funciones' (pulsando Control + Mayúsculas-Tab en el teclado) para hacer zoom en las caras de fractura interesantes cloroplasto y adquirir imágenes con grandes aumentos (100 - 200 kX, las Figuras 3 y 4). Utilizar los mismos parámetros que en el paso 3.6 para la adquisición de imágenes, pero cambiar el valor medio de la Línea N> 100 para la reducción de ruido ^30.
   1. Pulse Freeze en la unidad principal de control microscopio o en la pestaña 'escaneado' para detener el escaneo y guardarla imagen pulsando el botón "Guardar TIFF '.

Análisis 4. Imagen

Nota: En esta sección se describe un procedimiento corto para la segmentación de las partículas de membrana de congelación-fractura imágenes de SEM utilizando el paquete de código abierto Fiji ^31. Resultados similares pueden obtenerse con otro software de análisis de imágenes.

1. imagen abierta con Fiji arrastrando archivo de imagen en la ventana principal del programa. Convertir la imagen a 8 bits mediante la selección de la imagen / Tipo / 8 bits. Seleccionar Imagen / Ajustar / Brillo / Contraste y ajuste si es necesario (Figura 5A).
2. Con la herramienta Línea Recta, dibujar una línea del tamaño de la barra de escala de la imagen incrustada. Seleccione Analizar Escala / Set. Introduzca la información de escala apropiada (distancia conocida y la unidad de longitud) y haga clic en OK. Guardar esta imagen a escala ajustada.
3. Seleccione Proceso / Filtros / desenfoque gaussiano (1,5 NM de radio) y haga clic en OK (Figura 5B).
4. Seleccionar Imagen / Ajustar / AutUmbral o local (utilizando el método de Niblack) y haga clic en OK (Figura 5C).
5. Seleccione Editar / Invertir y luego Proceso / Binario / cuencas (Figura 5D).
6. Dibujar un borde alrededor de la región de interés (ROI) con la herramienta Selección a mano alzada. Añadir la selección al gestor de retorno de la inversión al seleccionar Editar / Selección / Añadir a Manager o haciendo clic en 'T'.
7. Seleccione Editar / Borrar el exterior (Figura 5E).
8. Seleccione Analizar / mediciones indicadas, elegir los parámetros adecuados (por ejemplo, superficie, en forma de elipse).
9. Seleccione Analizar / Analizar partículas. Introduzca un rango apropiado para el tamaño de las partículas y marcar "Mostrar resultados", "Añadir al Administrador 'y, de ser necesario, el' Excluir 'en los bordes opción y haga clic en OK. El resultado se muestra en la Figura 5F.
10. Abrir el archivo guardado fotografiado reducido (paso 4.2). Seleccione 'Mostrar todos' y anular la selección de "etiquetas" en el Administrador de retorno de la inversión. Revisar la partic seleccionadoles deposita sobre la imagen original y añadir o eliminar selecciones mediante el uso de la 'Añadir' o 'Eliminar' botones del Administrador de retorno de la inversión de forma manual. Corregir las selecciones necesarias mediante el uso de la herramienta Selección a mano alzada y el botón de "actualización" del Administrador de retorno de la inversión (figuras 5G y 5H).
11. Analizar los datos utilizando las mediciones obtenidas. En la ventana de resultados, haga clic en Resultados / Resumir para obtener, por ejemplo, el área media, y la media de Major y Minor ejes de las partículas que figuran en el Administrador de retorno de la inversión. Haga clic en Resultados / Distribución, seleccione un parámetro (por ejemplo, la zona) y haga clic en OK para ver un histograma para este parámetro.

Resultados

La Figura 1 muestra imágenes Cryo-SEM de plaquetas que contienen congelados, trozos de hojas pumilum Craterostigma fracturadas por congelación de alta presión. En algunas muestras, grandes regiones de células fracturadas se obtienen (Figura 1A). En otros, la pieza de la hoja se mantiene fuertemente unido al disco superior y está derribado junto con él (Figura 1B). Sin embargo, incluso en el segundo caso, una parte del teji...

Discusión

La técnica descrita en este documento permite la investigación de las membranas de congelación-fractura en el contexto de los tejidos vegetales congelados de alta presión bien conservados mediante microscopía electrónica de crio-escaneo. La principal ventaja de la utilización de estos procedimientos es que la preparación de la muestra es puramente físico; no hay pasos que involucran productos químicos o la deshidratación son necesarios. Por lo tanto, permite el estudio de las estructuras biológicas en un est...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol abs	Bio-Lab	052505
Isopropanol	Bio-Lab	162605
1-hexadecene	Sigma-Aldrich	H7009
0.1/0.2 Platelets	Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland	241	Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers	Electron Microscopy Sciences	72706-01	Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine	Bal-Tec	HPM 010	High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system	Leica Microsystems	EM BAF 060
Cryo preparation loading stage	Leica Microsystems	16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing	Leica Microsystems	16LZ04746VN	Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle	Leica Microsystems	EM VCT 100
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 055
Cryo SEM stage	Leica Microsystems	16770299905
Image acquisiton software	SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software	Fiji/Image J, National Institute of Health	http://fiji.sc/Fiji