Estudar a Organização supramolecular de fotossintéticas membranas dentro de tecidos foliares Freeze-fraturados por Cryo-Microscopia Eletrônica de Varredura

Resumo

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Resumo

microscopia eletrônica de crio-varredura (MEV) das amostras fraturou-congelamento permite investigação de estruturas biológicas em condições nativas próximas. Aqui, descrevemos uma técnica para estudar a organização supramolecular de fotossintéticos membranas (tilacói) dentro de amostras de folhas. Isto é conseguido através de congelamento de alta pressão de tecidos foliares, congelar-fractura, o revestimento de camada dupla e, finalmente, imagiologia Cryo-SEM. A utilização do método de revestimento de camada dupla permite que a aquisição de ampliação elevada (>) 100,000X imagens com danos feixe mínima para as amostras congeladas-hidratado, bem como efeitos de carregamento mínimo. Utilizando os procedimentos descritos investigamos as alterações na distribuição supramolecular de complexos fotossistema e proteína antena luz-colheita que ocorrem durante a desidratação da planta ressurreição Craterostigma pumilum, in situ.

Introdução

fotossíntese aeróbica, originários de cianobactérias antiga, foi herdada por algas e as plantas terrestres por eventos endosymbiotic que levaram ao desenvolvimento da organela cloroplasto. Em todos os fototróficas oxigênicos modernos, fotossintética de transporte de elétrons ea geração de força motriz protónica e poder redutor são realizadas dentro de vesículas saco-como achatadas denominadas membranas 'tilacói'. Estas membranas abrigar os complexos de proteínas que realizam as reações luz-driven de fotossíntese e fornecem um meio para a transdução de energia. Os tilacóides de plantas e (alguns) algas são diferenciados em dois domínios morfológicas distintas: regiões da membrana firmemente apresso chamados «grana» e membranas não empilhados que interligam a grana, chamados 'estroma lamelas ^«1. Foram realizados vários estudos de fractura por congelação de plantas e tilacóides de algas, começando no início de 1970. Quando fraturou-congelantes, membranasdividido ao longo do seu núcleo hidrofóbico ^2, gerando uma face exoplasmic (EF) e uma cara de protoplasma (PF), dependendo do compartimento celular onde as fronteiras meia-membrana, como originalmente inventado por Branton et ai. ., em 1975 ³ Plant and thylakoids algas têm quatro diferentes faces da fratura: FE, EFU, PFs e UFP, com 's' e que denotam e regiões 'U' 'empilhados' 'unstacked' de membrana, respectivamente. Os complexos de proteína da membrana, que não são divididos ou partidos, têm a tendência de permanecer tanto com a E ou P lado da membrana. As observações iniciais de que as diferentes faces de fratura dos tilacóides contêm partículas de diferentes tamanhos e densidades de ^4, e as numerosas investigações que se seguiram, levou à identificação e correlação entre as partículas observadas e os complexos de proteína de membrana que realizam as reações luz ^5-13 (ver também analisa ^14,15).

freexperimentos Eze-fratura de tilacóides são normalmente realizados em preparações de cloroplastos ou tilacóides isolados (mas veja ^16,17), correndo o risco de qualquer alteração na organização estrutural e / ou supramolecular que podem ocorrer durante o processo de isolamento. Seguindo fractura, réplicas são preparados por evaporação de platina / carbono (Pt / C), seguida por uma camada espessa de carbono (C), e, finalmente, a digestão do material biológico ^18. Réplicas são visualizados por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A técnica de congelamento e fratura-replica tradicional continua a servir como uma importante ferramenta para o estudo da organização supramolecular das membranas fotossintéticas e sua adaptação a diferentes, por exemplo., Luz, condições ^19-23.

Em nosso estudo recente da planta de ressurreição homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum ^24, que teve como objetivo investigar as mudanças na organização supramolecular omembranas de f tilacói, bem como na organização celular em geral, durante a desidratação e reidratação. A singularidade da espécie ressuscitados homoiochlorophyllous é que eles são capazes de sobreviver em condições de dessecação nos seus tecidos vegetativos (folhas), mantendo a sua aparelho fotossintético. Uma vez que a água está disponível, essas plantas se recuperar e retomar a atividade fotossintética dentro de horas a poucos dias ^25. Para este estudo, EM crio-varredura (MEV) de imagem de amostras de folhas fraturou-congelamento foi combinado com a alta pressão de zero por amostra crio-imobilização. Estes procedimentos fornecem um meio de visualizar amostras biológicas frozen-hidratado em um estado perto de seu estado nativo ^26. Um dos principais benefícios é que as amostras são examinadas logo após congelação-fractura e revestimento sem etapas sucessivas. Isto é particularmente relevante para a investigação de plantas em diferentes teores de água relativo (RWC), como seu estado de hidratação é mantido durante a preparação. Comosempre, uma desvantagem crítica é que as amostras congeladas-hidratado podem sofrer danos durante o feixe de imagem, especialmente quando digitalizada a elevadas ampliações, necessários para a medição exacta da dimensão dos complexos fotossintéticos. Para superar este problema, um método chamado de "revestimento de camada dupla" (DLC) ^27,28 combinados foram utilizados com as condições específicas de imagens crio-SEM. Estes resultaram em amostras que são significativamente menos sensível-beam e permitiu a elucidação de informações valiosas sobre a organização supramolecular proteína fotossintética e outros constituintes celulares da planta ressurreição C. pumilum em grandes ampliações in situ.

Protocolo

1. Cryo-fixação da folha de tecidos através do congelamento de alta pressão

Nota: Esta seção descreve como realizar o congelamento de alta pressão de tecidos foliares para uma experiência de congelação-fractura. Para considerações relacionadas com amostras de plantas ver ^29. Isto pode ser adaptada para outros tipos de tecidos ou amostras com algumas modificações.

1. Usando o canto de uma lâmina de barbear, riscar o fundo da cavidade de 0,1 mM de um plaquetas de alumínio de 0,1 / 0,2 mm (Figura 1). Prepare pelo menos uma dúzia de plaquetas (6 amostras). Tome cuidado para não criar marcas de faca na circunferência do disco.
   1. Depois de coçar, lavar discos em etanol absoluto, deixe-os secar e se manter em um prato limpo.
2. Prepara-se o congelamento máquina de alta pressão de acordo com as instruções do fabricante. Encher a câmara de álcool da máquina de congelação de alta pressão com isopropanol.
3. Prepare uma infiltratio assistida por vácuo caseiroN dispositivo para substituir o gás encontrada no tecido das folhas com o líquido.
   1. Firmemente ligar uma ponta de pipeta de 200 uL para a extremidade de uma seringa de 10 ml. Cortar ~ 1 cm da ponta. Fazer um furo na tampa de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para encaixar firmemente a ponta de corte. Vácuo pode ser criado no interior do tubo, puxando o êmbolo da seringa.
4. Corte um pequeno pedaço de folha da planta utilizando uma lâmina de barbear com uma pinça e colocar a folha interior de um tubo de microcentrífuga de meio-cheio com 1-hexadeceno. Infiltrar nos espaços intercelulares da folha com o líquido, puxando suavemente o êmbolo para criar vácuo, segure por cerca de 30 segundos e, em seguida, solte lentamente o êmbolo.
5. Remova o pedaço de folha a partir do tubo, usando uma pinça. Apare a folha com uma lâmina de barbear no caso, é mais espessa do que 0,2 mm e cortar um pequeno pedaço que se encaixam em uma das plaquetas.
6. Coloque uma plaqueta limpo com o lado arranhada no suporte da máquina de congelação e, em seguida, colocar o pedaço cortado de leAF no plaquetas. Preencher o espaço restante em torno da folha com 1-hexadeceno. Feche o sanduíche utilizando outro plaquetas, com os riscos que enfrentam a folha.
7. Feche e aperte o titular e inseri-lo na câmara da máquina. Em seguida, pressione o botão 'Jet' para congelar (~ 2.100 bares para 300-500 ms), e rapidamente transferir o titular em nitrogênio líquido. Remova cuidadosamente o sanduíche congelado do suporte usando uma pinça pré-refrigerado, tomando cuidado para não fraturar o sanduíche.
   Nota: Fechado sanduíches de gelados pode ser congelada imediatamente fracturado ou mantidos em azoto líquido para posterior utilização. Use roupas de proteção e óculos de segurança ao manusear nitrogênio líquido.

2. Freeze-fratura e dupla camada de revestimento ^27,28

1. Prepara-se o aparelho fractura de congelação para uso, incluindo ambas as armas para a evaporação de platina / carbono (Pt / C) e de carbono, de acordo com as instruções do fabricante. Coloque a arma de Pt / C a 45 graus umND a arma de carbono a 90 graus.
   1. Pré-programa um sistema de revestimento de uma camada de 2 nm de Pt / C (taxa de revestimento 0,02-0,04 nm / seg) e uma camada de 6 nm de carbono (em ~ 0,1 nm / seg).
      1. Entre na configuração na tela da máquina de congelação-fractura. Selecione um número de usuário, onde o esquema de revestimento será salvo.
      2. Escolha Pt / C para 'Camada 1'. Seleccionar um período de tempo, por ex., 5 min (a exceder o tempo necessário necessário para completar o revestimento). Use as setas para cima-para baixo para definir uma espessura de 2 nm.
      3. Pressione o botão "camada" para passar para a camada 2. Repita o passo 2.1.1.2, mas selecione carbono e definir uma espessura de 6 nm.
   2. Testar e ajustar a operação do injetor.
      1. Seleccione 'Camada 1'. Escolha a arma Pt / C, premindo o botão 'GUN1' e pressione o botão 'ON' na unidade da máquina de congelação-fractura controle de evaporação. Monitorar a taxa de evaporação e ajustá-lo usando os botões de tensão e de emissões untIL atingindo uma taxa de 0,02-0,04 nm / seg. Pressione 'OFF' para desligar a arma Pt / C.
      2. Seleccione "Layer 2". Repita 2.1.2.1, mas selecione 'gun2' e ajustar para uma taxa de evaporação de ~ 0,1 nm / seg.
2. Resfriar o estágio do sistema de fracturas congelamento de -140 C ou -160 C (para as folhas hidratadas ou desidratados, respectivamente). Fixe o serviço de transporte crio vácuo para a máquina e encher sua câmara com nitrogênio líquido. A pressão na câmara de congelação-fractura arrefecida é geralmente entre 1 - 8 x 10 ^-7 mbar.
3. Inserir um suporte de amostra de fractura de congelação (apropriado para as plaquetas de 3 mm) para a estação de carregamento. Inundar a câmara de carga com nitrogênio líquido.
4. Coloque dois sanduíches congelados para o um titular por um usando uma pinça grau de alta precisão. Aperte o primeiro sanduíche no suporte e, em seguida, virar o suporte sobre para verificar se ele se encaixa firmemente no lugar. Repita o procedimento para o segundo sanduíche.
5. Detach o serviço de transporte refrigerado a partir da máquina fratura freeze e conectá-lo à estação de carregamento. Abra a válvula de shuttle, introduzir o braço de retracção no suporte e travá-lo no lugar. Re-introduzir o braço com o titular para o traslado e fechar a válvula de transporte usando o botão de estação de carregamento. Fixe o transporte para a máquina de congelação-fractura e introduzir o titular para a câmara com o braço retrátil. Separe o traslado do máquina.
6. Alinhe a faca microtome congelamento fratura a uma altura tal que ele irá bater fora do topo plaquetas dos sanduíches.
7. Com a faca micrótomo, quebrar rapidamente os sanduíches, e logo em seguida levantá-lo para evitar a contaminação das amostras por apego detritos para a faca, e gire o obturador refrigerado acima do plano recém-exposta para proteger as amostras de possível contaminação por moléculas de água em a Câmara.
8. Revestir as amostras com platina e carbono.
   1. Enter 'Camada 1' na screen. Ligue a pistola Pt / C, premindo o botão 'GUN1' seguido pelo botão 'ON'. Examine a taxa de evaporação e uma vez que atinge 0,02-0,04 nm / seg, expor simultaneamente as amostras e pressione o botão 'Medida' para monitorar a espessura da camada depositada.
      Nota: Gun desliga-se automaticamente quando a espessura atingiu o valor pré-selecionado.
   2. Cobrir as amostras com o obturador, quando de Pt / C a evaporação é completada.
   3. Pressione o botão 'Camada' para mover para "Layer 2". Repita os passos 2.8.1 e 2.8.2, com a excepção de selecção 'gun2' (para o carbono) e uma taxa de evaporação de ~ 0,1 nm / seg.
9. Aquecer o estágio do sistema de fracturas congelamento de -120 C.

3. Cryo-Microscopia Eletrônica de Varredura

1. Prepare o microscópio eletrônico de varredura para o trabalho crio.
   1. Selecione Estágio / Stage Inicializar a partir do menu principal e confirmar.
   2. Selecione Ferramentas / Goto Painel, e abrir o painel 'Airlock ", selecionando-o da lista. Clique no botão 'Válvula Câmara Fechar coluna' a. Ventilar a câmara microscópio, clicando no botão de ventilação sob a aba 'vácuo'.
   3. Selecione Ferramentas / Painel de Goto, e abrir o painel 'Lista Stage Pontos'. Seleccione a posição de troca crio para mover o palco para as coordenadas adequadas para aceitar o suporte da amostra. Nota: A "posição de troca de crio 'está configurado para estar em alinhamento com a posição da unidade de transferência de vácuo.
   4. Abra a câmara de espécime com um par limpo de luvas e inserir o estágio crio para o palco principal do microscópio. Feche a câmara e clique no botão da bomba sob o 'guia Vacuum'.
   5. Resfriar o microscópio para -120 C. Encha o microscópio Dewar com nitrogênio líquido. Ative a função de calor na unidade de controle de transferência de crio a -120 c uma vez a temperatura da fase cai abaixo de -120 C.
2. Attach o traslado de transferência de crio ao microscópio e transferir o suporte de amostra utilizando o braço de retracção para a fase de microscópio crio (como no passo 2.5). Separe o traslado do microscópio.
3. Clique no botão 'Válvula câmara aberta coluna' no Painel de Airlock.
4. Mova cuidadosamente o suporte da amostra perto da lente objetiva (trabalho à distância 1 - 2 mm) usando o joystick. Selecione uma abertura de 10 mm na Tab 'aberturas'. Clique duas vezes no campo de EHT, na secção 'Gun'. Digite 10 (kV) para o destino EHT e clique em OK. Clique na guia EHT inferior e selecione 'EHT On'.
5. Selecione 'InLens' a partir da lista drop-down Detectores, na secção 'Detectores'. Otimizar as condições de imagem (foco, brilho e contraste, alinhamento do feixe, astigmatismo), conforme apropriado.
6. Clique no separador 'Scanning'. Escolha uma varredura rápida ( 'Velocidade de digitalização = 1', o que corresponde a um tempo de permanência de 100 nanossegundos por pixel) para minimizar os danos feixe, e«resolução Store 'de 1.024 x 768 pixels. Escolha 'Linha Média "na lista drop-down' Redução de ruído '. Ajuste o valor de N para 20 - 30 linhas de pesquisa. Mova a amostra usando a função "Centre Point '(pressionando control-tab no teclado) para procurar regiões com células e cloroplastos fraturados (Figuras 2A e 2B).
7. Adquirir imagens de cloroplastos fraturados em ampliações baixas (50 - 70 KX) (Figura 2C e 2D). Use a função 'Centro de Recurso' (pressionando Control-Shift-Tab no teclado) para aumentar o zoom em rostos interessantes cloroplasto fratura e adquirir imagens em ampliações elevadas (100-200 kX, Figuras 3 e 4). Use os mesmos parâmetros como no passo 3.6 para aquisição de imagem, mas alterar o valor médio de linha para N> 100 para redução de ruído ^30.
   1. Pressione Congelar na unidade de controlo microscópio principal ou no separador "Digitalização" para parar a digitalização e salvara imagem pressionando o botão 'Salvar TIFF'.

Análise 4. Imagem

Nota: Esta seção descreve um procedimento curto para a segmentação de partículas de membrana a partir de imagens de fractura por congelação SEM usando o pacote de código aberto Fiji ^31. Resultados semelhantes podem ser obtidos com outros software de análise de imagem.

1. Abrir imagem com Fiji, arrastando arquivo de imagem na janela principal do programa. Converter a imagem em 8-bit, selecionando Imagem / Tipo / 8-bit. Selecionar Imagem / Ajustar / Brilho / Contraste e ajustar conforme necessário (Figura 5A).
2. Usando a ferramenta de linha reta, desenhar uma linha do tamanho da barra de escala imagem incorporada. Selecione Analisar Escala / Set. Insira as informações de escala adequada (distância conhecida e Unidade de comprimento) e clique em OK. Salvar esta imagem em escala ajustado.
3. Selecione Processo / Filtros / Gaussian Blur (1,5 nm raio) e clique em OK (Figura 5B).
4. Selecionar Imagem / Ajustar / Auto Threshold Local (usando o método Niblack) e clique em OK (Figura 5C).
5. Selecione Editar / Inverter e depois do processo / binário / Bacias Hidrográficas (Figura 5D).
6. Desenhar uma borda em torno da região de interesse (ROI) com a ferramenta Freehand Selection. Adicione a selecção para o gestor de ROI, selecionando Editar / Seleção / Adicionar a Manager ou clicando em 'T'.
7. Selecione Editar / Limpar Outside (Figura 5E).
8. Selecione Analisar / Definir Medidas, escolha os parâmetros apropriados (por exemplo, na área, ajuste da elipse).
9. Selecione Analisar / Analisar partículas. Inserir um intervalo adequado para o tamanho das partículas e marcar "Mostrar resultados", "Adicionar à Manager 'e, se necessário, o" Excluir nas bordas "opção e clique em OK. O resultado é mostrado na Figura 5F.
10. Abra o arquivo digitalizado escalado salvo (passo 4.2). Selecione 'Mostrar Tudo' e desmarque 'Labels' no Gerenciador de ROI. Reveja a partic selecionadasles colocado sobre a imagem original e adicionar ou remover seleções usando a 'Adicionar' ou 'Excluir' botões do Gestor de ROI manualmente. Corrigir quaisquer seleções necessárias usando a ferramenta Freehand Selection eo botão 'Update' do Gerenciador de ROI (Figuras 5G e 5H).
11. Analisar os dados utilizando as medidas obtidas. Na janela de resultados, clique em Resultados / Resuma para obter, por exemplo, a área média e média Maior e eixos menores das partículas listadas no Gerenciador de ROI. Clique em Resultados / Distribuição, selecione um parâmetro (como Area) e clique em OK para exibir um histograma para este parâmetro.

Resultados

A Figura 1 mostra imagens crio-SEM de plaquetas contendo de alta pressão congelados, congelar-fraturados Craterostigma pedaços de folhas pumilum. Em algumas amostras, grandes regiões de células fragmentadas são obtidos (Figura 1A). Em outros, a peça de folha permanece firmemente ligado ao disco superior e é batido para fora junto com ele (Figura 1B). No entanto, mesmo no segundo caso, algum tecido foliar pode per...

Discussão

A técnica descrita neste artigo permite a investigação de membranas fraturou-congelamento dentro do contexto de alta pressão tecidos vegetais congelados bem preservados por microscopia eletrônica de crio-digitalização. A principal vantagem da utilização destes procedimentos é que a preparação da amostra é puramente físico; há etapas que envolvem produtos químicos ou desidratação são necessárias. Assim, ele permite estudar estruturas biológicas em um estado quase original ^26,32. O benefíc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol abs	Bio-Lab	052505
Isopropanol	Bio-Lab	162605
1-hexadecene	Sigma-Aldrich	H7009
0.1/0.2 Platelets	Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland	241	Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers	Electron Microscopy Sciences	72706-01	Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine	Bal-Tec	HPM 010	High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system	Leica Microsystems	EM BAF 060
Cryo preparation loading stage	Leica Microsystems	16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing	Leica Microsystems	16LZ04746VN	Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle	Leica Microsystems	EM VCT 100
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 055
Cryo SEM stage	Leica Microsystems	16770299905
Image acquisiton software	SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software	Fiji/Image J, National Institute of Health	http://fiji.sc/Fiji