L'étude de l'Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage

Résumé

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Résumé

microscopie électronique Cryo-balayage (MEB) d'échantillons de gel fracturé permet l'étude des structures biologiques à des conditions proches indigènes. Ici, nous décrivons une technique pour l'étude de l'organisation supramoléculaire de photosynthétiques membranes (thylakoïdes) dans les échantillons de feuilles. Ceci est obtenu par congélation à haute pression des tissus foliaires, congelez-fracturation, revêtement double couche et enfin cryo-SEM imagerie. L'utilisation du procédé de revêtement à double couche permet l'acquisition d'un fort grossissement (> 100,000X) images avec des dommages de faisceau minimal pour les échantillons congelés hydraté ainsi que les effets de charge minimum. En utilisant les procédures décrites , nous avons étudié les modifications dans la distribution supramoléculaire de photosystème et de la lumière-récolte protéines d'antenne complexes qui ont lieu pendant la déshydratation de la plante de la résurrection Craterostigma pumilum, in situ.

Introduction

photosynthèse Oxygenic, originaire de cyanobactérie ancienne, a été hérité par les algues et les plantes terrestres par les événements qui ont conduit à endosymbiotic développement de l'organite chloroplaste. Dans tous les phototrophs oxygénés modernes, le transport photosynthétique d'électrons et la génération de la force proton-motrice et de pouvoir réducteur sont effectuées dans des vésicules de sac-comme aplaties appelées membranes 'thylacoïdes'. Ces membranes abritent les complexes protéiques qui réalisent les réactions légères-driven de la photosynthèse et de fournir un support pour la transduction de l'énergie. Les membranes thylacoïdes de plantes et ( un peu) les algues sont différenciées en deux domaines morphologiques distincts: régions membranaires étroitement apprimés appelées «grana» et les membranes unstacked qui interconnectent le grana, appelés 'stroma lamelles' ^1. Diverses études de gel-fracture des plantes et des membranes thylacoïdes d'algues ont été menées, à partir du début des années 1970. Lorsque le gel fracturé, membranesdiviser le long de leur noyau hydrophobe ^2, générant une face exoplasmique (EF) et une face protoplasmique (PF), selon le compartiment cellulaire où les frontières demi-membrane, comme initialement inventé par Branton et al. . en 1975 ³ Plant and thylakoïdes algues ont quatre faces de rupture différentes: FE, EFU, PF et PFU, avec 's' et dénotant et régions membranaires 'u' 'empilées' 'dépilés', respectivement. Les complexes de protéines membranaires, qui ne sont pas fendus ou cassés, ont tendance à rester avec soit E ou P côté de la membrane. Les premières observations que les différentes faces de rupture des thylakoïdes contiennent des particules de différentes tailles et densités ^4, ainsi que les nombreuses enquêtes qui ont suivi, ont conduit à l' identification et la corrélation entre les particules observées et les complexes de protéines membranaires qui effectuent les réactions légères ^5-13 (avis voir aussi ^14,15).

Freexpériences eze-fracture de membranes thylacoïdes sont généralement réalisées sur des préparations de chloroplastes ou membranes thylakoïdes isolés (mais voir ^16,17), au risque de toute modification / organisation structurelle et ou supramoléculaire qui peuvent survenir au cours de la procédure d'isolement. À la suite de la rupture, les répliques sont préparées par évaporation du platine / carbone (Pt / C), puis par une épaisse couche de carbone (C), et enfin la digestion de la matière biologique ^18. Des répliques sont visualisés par microscopie électronique à transmission (MET). La technique traditionnelle cryofracturation-réplique continue à servir comme un outil important pour l' étude de l'organisation supramoléculaire des membranes photosynthétiques et leur adaptation à différents, par exemple., Lumière, conditions ^19-23.

Dans notre étude récente de la plante de la résurrection homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum ^24, nous avons cherché à étudier les changements dans l'organisation supramoléculaire omembranes f thylacoïdes, ainsi que dans l'organisation cellulaire globale, au cours de la déshydratation et la réhydratation. Le caractère unique des espèces de résurrection homoiochlorophyllous est qu'ils sont capables de survivre dans des conditions de dessication dans les tissus végétaux (feuilles), tout en conservant leur appareil photosynthétique. Une fois que l' eau est disponible, ces plantes récupérer et reprendre l' activité photosynthétique en quelques heures à quelques jours ^25. Pour cette étude, la cryo-ME à balayage (MEB) d'imagerie d'échantillons de feuilles fracturée par congélation a été combiné avec le gel à haute pression pour l'échantillon cryo-immobilisation. Ces procédures fournissent un moyen de visualiser des échantillons biologiques congelés-hydratés à un état ​​proche de leur état ​​natif ^26. Un avantage principal est que les échantillons sont examinés directement après cryofracture et le revêtement, sans étapes successives. Ceci est particulièrement pertinent à l'enquête sur les plantes à différentes teneurs en eau relative (RWC), que leur état d'hydratation est maintenue pendant la préparation. Commentde plus, un inconvénient important est que les échantillons congelés hydraté peuvent subir des dommages du faisceau lors de l'imagerie, en particulier lors d'une numérisation à fort grossissement, qui sont nécessaires pour une mesure précise de la taille des complexes photosynthétiques. Pour y remédier, une méthode appelée «revêtement double couche» (DLC) ^27,28 combiné à des conditions d'imagerie spécifiques cryo-SEM ont été utilisés. Ceux - ci ont donné lieu à des échantillons qui sont beaucoup moins sensibles à faisceau et ont permis l'élucidation de précieuses informations sur la protéine photosynthétique organisation supramoléculaire et d' autres constituants cellulaires de la plante de la résurrection C. pumilum à fort grossissement in situ.

Protocole

1. Cryo-fixation de feuilles Tissues par haute pression de congélation

Remarque: Cette section décrit comment effectuer la congélation à haute pression des tissus foliaires pour une expérience de fracture par congélation. Pour des raisons liées à des échantillons de plantes voir ^29. Ceci peut être adapté à d'autres types de tissus ou des échantillons avec quelques modifications.

1. En utilisant l'angle d'une lame de rasoir, gratter le fond de la cavité de 0,1 mm d'une plaquette d'aluminium de 0,1 / 0,2 mm (figure 1). Préparer au moins une douzaine de plaquettes (6 échantillons). Prenez garde de ne pas créer des marques de couteau sur le pourtour du disque.
   1. Après avoir gratté, laver les disques dans l'éthanol absolu, laissez-les sécher et conserver dans un plat propre.
2. Préparer la machine de congélation à haute pression selon les instructions du fabricant. Remplir la chambre d'alcool de la machine de congélation à haute pression avec de l'isopropanol.
3. Préparer un vide-assisté infiltratio fait maisonn dispositif pour remplacer le gaz trouvé dans le tissu de la feuille avec du liquide.
   1. Étroitement connecter une pointe de pipette 200 pi à l'extrémité d'une seringue de 10 ml. Coupez ~ 1 cm de la pointe. Faire un trou dans le bouchon d'un tube de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour adapter étroitement la pointe de coupe. Le vide peut être créé à l'intérieur du tube en tirant le piston de la seringue.
4. Coupez un petit morceau de feuille de la plante à l'aide d'une lame de rasoir et avec des pincettes placer la feuille dans un tube de microcentrifugeuse à moitié rempli avec 1-hexadécène. Infiltrer les espaces intercellulaires de la feuille avec le liquide en tirant doucement sur le piston pour créer le vide, maintenez pendant environ 30 secondes, puis relâchez lentement le piston.
5. Retirez la pièce du tube en utilisant des pinces de feuilles. Coupez la feuille avec une lame de rasoir dans le cas où il est plus épais que 0,2 mm et couper un petit morceau qui rentre dans une plaquette.
6. Placez une plaquette propre avec le côté rayé vers le haut dans le support de la machine de congélation, puis placez le morceau de le coupeaf dans la plaquette. Remplir l'espace restant autour de la feuille avec le 1-hexadécène. Refermer le sandwich en utilisant une autre plaquette, avec les rayures face à la feuille.
7. Fermez et serrez le support et l'insérer dans la chambre de la machine. Appuyez ensuite sur le bouton 'Jet' à geler (~ 2.100 bars pour 300-500 msec), et transférer rapidement le support dans l'azote liquide. Retirez délicatement le sandwich congelé du support en utilisant des pinces pré-refroidi, en prenant soin de ne pas rompre le sandwich.
   Remarque: sandwichs congelés peuvent être fermés gel fracturé immédiatement ou conservés dans l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. Utiliser des vêtements de protection et des lunettes lors de la manipulation de l'azote liquide.

2. Geler-fracture et double couche de revêtement ^27,28

1. Préparer la machine de rupture de gel destiné à être utilisé, y compris les pistolets pour l'évaporation du platine / carbone (Pt / C) et de carbone, selon les instructions du fabricant. Placez le pistolet Pt / C à 45 degrés une pistolet de carbone à 90 degrés.
   1. Pré-programme un système de revêtement d'une couche de 2 nm de Pt / C (taux de revêtement de 0,02 à 0,04 nm / sec) et une couche de 6 nm de carbone (à ~ 0,1 nm / sec).
      1. Entrez la configuration sur l'écran de la machine-gel de fracture. Sélectionnez un numéro d'utilisateur où le système de revêtement sera sauvé.
      2. Choisissez Pt / C pour 'la couche 1'. Sélectionnez un laps de temps, par exemple., 5 min (à dépasser le temps nécessaire requis pour compléter le revêtement). Utilisez les flèches haut-bas pour définir une épaisseur de 2 nm.
      3. Appuyez sur le bouton 'Layer' pour passer à la couche 2. Répétez l'étape 2.1.1.2, à l'exception de sélection du carbone et de définir une épaisseur de 6 nm.
   2. Testez et régler le fonctionnement des armes à feu.
      1. Sélectionnez 'Couche 1'. Sélectionnez le / C gun Pt en appuyant sur le bouton 'GUN1' et appuyez sur le bouton «ON» sur l'unité de la machine-gel de fracture contrôle de l'évaporation. Surveiller le taux d'évaporation et de l'ajuster en utilisant la tension et d'émission boutons until atteint un taux de de 0,02 à 0,04 nm / sec. Appuyez sur 'OFF' pour désactiver le pistolet Pt / C.
      2. Sélectionnez 'Layer 2'. Répétez 2.1.2.1, sauf sélectionnez 'GUN2' et ajuster pour un taux de ~ 0,1 nm / sec évaporation.
2. Refroidir le stade du système de fractures de gel à -140 ° C ou -160 ° C (pour les feuilles hydratées ou déshydratées, respectivement). Fixer la navette de transfert de cryo sous vide à la machine et remplir sa chambre avec de l'azote liquide. Pression dans la chambre cryofracturation refroidie est généralement comprise entre 1 - 8 x 10 ^-7 mbar.
3. Insérez un porte-échantillon de gel de fracturation (adapté pour 3 mm plaquettes) dans la station de chargement. Inonder la chambre de poste de chargement avec de l'azote liquide.
4. Chargez deux sandwichs surgelés sur la seule porte par un à l'aide des pinces de qualité de haute précision. Serrer le premier sandwich dans le support et puis retourner le support sur pour vérifier qu'il correspond bien en place. Répétez l'opération pour le deuxième sandwich.
5. réEtach la navette refroidie de la machine de rupture de gel et de le connecter à la station de chargement. Ouvrez la vanne de navette, introduire le bras de rétraction dans le support et le verrouiller en place. Re-introduire le bras avec le support dans la navette et fermer le robinet de la navette en utilisant le bouton de la station de chargement. Fixer la navette à la machine cryofracture et d'introduire le support dans la chambre avec le bras de rétraction. Détachez la navette de la machine.
6. Alignez le couteau de microtome gel de fracture à une hauteur telle qu'elle délogeant les meilleurs plaquettes des sandwiches.
7. Avec le couteau microtome, briser rapidement les sandwiches, puis immédiatement le relever pour éviter la contamination des échantillons par des débris accroché au couteau, et tourner le volet refroidi au-dessus du plan nouvellement exposée pour protéger les échantillons de la contamination possible par des molécules d'eau dans la chambre.
8. Enduire les échantillons avec le platine et le carbone.
   1. Entrez «couche 1» sur la screen. Allumez le / C gun Pt en appuyant sur le bouton «GUN1» suivie du bouton 'ON'. Examiner le taux d'évaporation et une fois qu'il atteint de 0,02 à 0,04 nm / sec, exposer simultanément les échantillons et appuyez sur le bouton 'Mesure' pour contrôler l'épaisseur de la couche déposée.
      Remarque: Gun sera éteint automatiquement lorsque l'épaisseur a atteint la valeur pré-sélectionnée.
   2. Couvrir les échantillons avec l'obturateur lorsque Pt / C évaporation est terminée.
   3. Appuyez sur le bouton 'Layer' pour passer à «couche 2». Répéter les étapes 2.8.1 et 2.8.2, à l'exception de la sélection "GUN2 '(pour le carbone) et un taux de ~ 0,1 nm / s évaporation.
9. Chauffer la phase du système de fractures de gel à -120 ° C.

3. Cryo-microscopie électronique à balayage

1. Préparer le microscope électronique à balayage pour les travaux de cryo.
   1. Sélectionnez Étape / Stage Initialisation dans le menu principal et validez.
   2. Sélectionnez Outils / Goto Panel, et ouvrez le panneau 'Airlock' en le sélectionnant dans la liste. Cliquez sur le bouton «Fermer Colonne Chambre Valve. Purger la chambre de microscope en cliquant sur le bouton de ventilation sous l'onglet «à vide».
   3. Sélectionnez Outils / Panneau de Goto, et ouvrez le panneau "Liste des points d'étape». Sélectionner la position de cryo-échange pour déplacer la scène aux coordonnées adéquates pour recevoir le support d'échantillon. Remarque: La position «cryo-échange» est réglé pour être en alignement avec la position de l'unité de transfert sous vide.
   4. Ouvrez la chambre de l'échantillon avec une paire de gants propres et insérez le cryo-étape sur la scène principale du microscope. Fermez la chambre et cliquez sur le bouton de la pompe sous l'onglet 'vide'.
   5. Refroidir le microscope à -120 ° C. Remplir le microscope Dewar d'azote liquide. Activez la fonction de la chaleur sur l'unité de commande cryo-transfert à -120 ° C lorsque la température de l'étape descend en dessous de -120 ° C.
2. attach la navette cryo-transfert au microscope et transférer le porte-échantillon à l'aide du bras rétractable dans l'étape microscope cryo (comme à l'étape 2.5). Détachez la navette du microscope.
3. Cliquez sur le bouton 'Ouvrir la colonne Chambre Valve »dans le panneau de Airlock.
4. Déplacez doucement le porte-échantillon proche de l'objectif (travail à distance 1 - 2 mm) à l'aide du joystick. Sélectionnez une ouverture de 10 pm dans l'onglet 'Apertures'. Double-cliquez sur le champ EHT dans l'onglet 'Gun'. Entrez 10 (kV) pour la cible EHT et cliquez sur OK. Cliquez sur l'onglet EHT bas et sélectionnez 'EHT On'.
5. Sélectionnez 'InLens' dans la liste déroulante Détecteurs dans l'onglet 'Détecteurs'. Optimiser les conditions d'imagerie (mise au point, la luminosité et le contraste, l'alignement du faisceau, astigmatisme), le cas échéant.
6. Cliquez sur l'onglet 'Numérisation'. Choisissez un balayage rapide ( 'Vitesse de numérisation = 1', correspondant à un temps de séjour de 100 nanosecondes par pixel) pour minimiser les dommages de faisceau, etune «résolution de magasin» de 1.024 x 768 pixels. Sélectionnez 'Ligne Avg' dans la liste déroulante 'Réduction du bruit ». Réglez la valeur de N à 20 - 30 lignes pour la recherche. Déplacer l'échantillon en utilisant la fonction 'Centre Point' (en appuyant sur ​​la languette de commande sur le clavier) pour rechercher des régions avec des cellules fracturées et les chloroplastes (Figures 2A et 2B).
7. Acquérir les images de chloroplastes fracturées à faible grossissement (50 - 70 kX) (Figure 2C et 2D). Utilisez la fonction «Centre d'entité '(en appuyant sur-shift-onglet de contrôle sur le clavier) pour zoomer sur les visages intéressants chloroplaste de fracture et d' acquérir des images à des grossissements élevés (100 - 200 kX, les figures 3 et 4). Utilisez les mêmes paramètres que dans l' étape 3.6 pour l' acquisition d'image, mais changer la valeur moyenne de ligne à N> 100 pour la réduction du bruit ^30.
   1. Appuyez sur Gel sur l'unité de commande de microscope principal ou dans l'onglet "Numérisation" pour arrêter le balayage et d'économiserl'image en appuyant sur le bouton "Enregistrer TIFF.

4. Analyse d'image

Remarque: Cette section décrit une procédure courte pour la segmentation des particules de membrane à partir d' images MEB cryofracturation utilisant le package open-source Fidji ^31. Des résultats similaires peuvent être obtenus avec d'autres logiciels d'analyse d'image.

1. Ouvrir l'image avec les Fidji en faisant glisser le fichier image dans la fenêtre principale du programme. Convertir l'image en 8 bits en sélectionnant l'image / Type / 8-bit. Sélectionner l' image / Réglage / Luminosité / Contraste et ajuster si nécessaire (figure 5A).
2. Utilisation de l'outil de ligne droite, tracer une ligne de la taille de la barre d'échelle d'image intégré. Sélectionnez Analyser / Echelle Set. Entrez les informations de bonne échelle (distance connue et Unité de longueur), puis cliquez sur OK. Envoyer cette image à l'échelle ajustée.
3. Sélectionnez Process / Filtres / Flou gaussien (1,5 rayon nm) et cliquez sur OK (figure 5B).
4. Sélectionner l'image / Ajuster / Auto Seuil local ( en utilisant la méthode Niblack) et cliquez sur OK (Figure 5C).
5. Sélectionnez Modifier / Inverser puis Process / binaire / bassin versant (Figure 5D).
6. Dessiner une bordure autour de la région d'intérêt (ROI) avec l'outil Sélection au lasso. Ajouter la sélection au gestionnaire de ROI en sélectionnant Modifier / Sélection / Ajouter au gérant ou en cliquant sur 'T'.
7. Sélectionnez Modifier / Effacer l' extérieur (Figure 5E).
8. Sélectionnez Analyser / Set mesures, choisissez les paramètres appropriés (par exemple, la région, l' ellipse en forme).
9. Sélectionnez Analyser / analyser des particules. Entrez une gamme appropriée pour la taille des particules et marquer «Résultats», «Ajouter au Manager 'et, si nécessaire, le« Exclure sur les bords de l'option et cliquez sur OK. Le résultat est représenté sur la figure 5F.
10. Ouvrez le fichier à l'échelle imagée enregistrée (étape 4.2). Sélectionnez 'Show All' et décochez 'étiquettes' dans le gestionnaire de ROI. Revoir la partic sélectionnéeles posé sur l'image originale et ajouter ou supprimer des sélections en utilisant le "Ajouter" ou "Supprimer" boutons du gestionnaire de ROI manuellement. Corrigez toutes les sélections nécessaires à l'aide de l'outil Sélection au lasso et le bouton 'Update' du ROI Manager (figures 5G et 5H).
11. Analyser les données en utilisant les mesures obtenues. Dans la fenêtre des résultats, cliquez sur Résultats / Résumer pour obtenir, par exemple, la zone moyenne, et la moyenne Major et axes mineurs des particules figurant dans le gestionnaire de ROI. Cliquez sur Résultats / Distribution, sélectionnez un paramètre (comme la région) et cliquez sur OK pour afficher un histogramme pour ce paramètre.

Résultats

La figure 1 montre des images cryo-MEB de plaquettes contenant congelé, fracturés Craterostigma pièces pumilum foliaires haute pression. Dans certains échantillons, de grandes régions de cellules brisées sont obtenues (figure 1A). Dans d' autres cas , la pièce de la feuille reste fortement liée au disque supérieur et est arraché avec elle (figure 1B). Cependant, même dans le second cas, une partie du tiss...

Discussion

La technique décrite dans ce document permet l'étude des membranes de gel fracturé dans le contexte des tissus végétaux congelés à haute pression bien conservés par microscopie électronique à balayage cryo. Le principal avantage de l'utilisation de ces procédures est que la préparation de l'échantillon est purement physique; aucune mesure impliquant des produits chimiques ou la déshydratation sont nécessaires. Ainsi, il permet d' étudier les structures biologiques à un état ​​quasi-...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol abs	Bio-Lab	052505
Isopropanol	Bio-Lab	162605
1-hexadecene	Sigma-Aldrich	H7009
0.1/0.2 Platelets	Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland	241	Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers	Electron Microscopy Sciences	72706-01	Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine	Bal-Tec	HPM 010	High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system	Leica Microsystems	EM BAF 060
Cryo preparation loading stage	Leica Microsystems	16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing	Leica Microsystems	16LZ04746VN	Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle	Leica Microsystems	EM VCT 100
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 055
Cryo SEM stage	Leica Microsystems	16770299905
Image acquisiton software	SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software	Fiji/Image J, National Institute of Health	http://fiji.sc/Fiji