JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

Abstract

קריו סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) של דגימות-שבר הקפאה מאפשר חקירה של מבנים ביולוגיים בתנאי יליד קרובים. כאן אנו מתארים טכניקה ללימוד הארגון המולקולרי של פוטוסינתטיים (תילקואיד) ממברנות בתוך דגימות עלים. זו מושגת על ידי הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלה, להקפיא-שבירה, ציפוי שכבה כפולה ולבסוף הדמית קריו-SEM. השימוש בשיטה ציפוי שכבה כפולה מאפשר רכישת הגדלה גבוהה (> 100,000X) תמונות עם נזק קרן מינימלי דגימות קפואות-hydrated כמו גם אפקטים טעינה מינימלית. שימוש בהליכים שתוארו חקרנו את השינויים בחלוקה מולקולרית של מתחמי photosystem וחלבון אנטנת אור-קציר המתרחשים במהלך ההתייבשות של pumilum Craterostigma צמח תחייתו, באתרו.

Introduction

פוטוסינתזה חמצנית, שמקורם כחוליות עתיקות, ירשה אצות וצמחים קרקע על ידי אירועי endosymbiotic שהובילו להתפתחות של אברון הכלורופלסט. בכל phototrophs חמצנית ימינו, הובלת האלקטרונים פוטוסינתטיים והדור בכוח פרוטון-מניע כוח צמצום מתבצעות בתוך שלפוחית ​​דמויי השק פחוס כינה 'תילקואיד' ממברנות. ממברנות אלה לשכן את קומפלקסי חלבוני המבצעות תגובות מונחים-האור של פוטוסינתזה ולספק בינוני עבור תמרת אנרגיה. הממברנות תילקואיד של צמחים ובעלי (חלק) אצות הם מובחנים לשני תחומים מורפולוגיים ברורים: אזורים קרום appressed בחוזקה שנקרא 'Grana' וממברנות unstacked בו מקשרים בין Grana, שנקרא 'lamellae stroma' 1. להקפיא שבר שונים מחקרים של צמח וממברנות תילקואיד אצות נערכו, החל בשנות ה -1970 המוקדמות. כאשר שבר-הקפאה, ממברנותלפצל יחד Core 2 הידרופובי שלהם, יצירת פנים exoplasmic (EF) ופנים protoplasmic (PF), תלוי בתא הסלולר אשר לגבולות חצי קרום, כפי שטבע במקור על ידי Branton et al. יש ב -1975 3 צמחים תילקואיד אץ ארבעה פרצופים שברים שונים:. מקדמי פליטה, EFu, PFS ו Pfu, עם 's' ו 'U' 'מוערם' ו 'unstacked' קרום אזורים מציינים, בהתאמה. מתחמי חלבון הממברנה, אשר אינם לפצל או שבורים, יש נטייה להישאר עם או E או P צד של הממברנה. התצפיות הראשוניות כי פניהם שבר השונים של תילקואיד מכילים חלקיקים בגדלים שונים וצפיפות 4, ואת חקירות רבות שלאחר מכן, הובילו לזיהוי קורלציה בין החלקיקים הנצפים ואת קומפלקסי חלבונים בממברנה מבצעות תגובות האור 5-13 (ראה גם ביקורות 14,15).

freEze-שבר ניסויים של ממברנות תילקואיד בדרך כלל מבוצעים על הכנות של כלורופלסטים או ממברנות תילקואיד המבודדות (אך ראה 16,17), בסיכון של כל שינוי ב מבני ו / או ארגון מולקולרי אשר עלול להתרחש במהלך ההליך בבידוד. בעקבות שבר, העתקים מוכנים ידי אידוי של פלטינה / פחמן (Pt / C), ולאחר מכן על ידי שכבה עבה של פחמן (C), ולבסוף עיכול של החומר הביולוגי 18. רפליקות הם דמיינו ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (TEM). הטכניקה להקפיא שבר-ההעתק המסורתית ממשיכה לשמש ככלי חשוב ללימוד הארגון המולקולרי של ממברנות פוטוסינתטיים והתאמתנו שונים, למשל., אור, תנאי 19-23.

במחקר האחרון שלנו של צמח תחיית homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, אנו בקשנו לבחון את השינויים שחלו o הארגון המולקולריממברנות תילקואיד f, כמו גם בארגון הסלולר הכוללת, במהלך התייבשות התייבשות. ייחודו של מיני תחייה homoiochlorophyllous הוא שהם מסוגלים לשרוד בתנאים של יובש ברקמות וגטטיבי שלהם (עלים), תוך שמירה על מנגנון הפוטוסינתזה שלהם. ברגע שמים זמינים, הצמחים האלה להתאושש ולהמשיך בפעילות פוטוסינתטיים בתוך שעות עד מספר ימים 25. לצורך המחקר, EM-סריקת קריו (SEM) הדמיה של דגימות עלים שבר הקפאה אוחדה עם בלחץ גבוה קופא-וקיבוע קריו מדגם. נהלים אלה לספק אמצעי לדמיין דגימות ביולוגיות קפוא hydrated בכל מדינה קרובה למצב הטבעי שלהם 26. יתרון עיקרי אחת הוא כי דגימות נבחנות ישירות לאחר שבר הקפאה וציפוי ללא מדרגות רצופות. זה רלוונטי במיוחד לחקירת צמחים תכולי מי ביחס שונה (RWC), כמדינת הידרציה שלהם נשמרת במהלך הכנה. אֵיךפעם, חיסרון קריטי אחד הוא כי דגימות קפואות-hydrated עלולים לסבול מנזק הקורה במהלך ההדמיה, במיוחד כאשר סרק בהגדלה גבוהה, נדרש עבור מדידה מדויקת של גודל של מתחמי פוטוסינתטיים. כדי להתגבר על זה, שיטה הנקראת 'ציפוי שכבה כפולה "(DLC) 27,28 בשילוב עם תנאי הדמית קריו-SEM ספציפיים נוצלו. אלה באו לידי ביטוי דגימות כי הם פחות קורה רגיש ואפשרנו להבהרת מידע רב ערך על ארגון פוטוסינתטיים חלבון מולקולרי ומרכיבים תאיים אחרים של הצמח ותחייתו ג pumilum בהגדלה גבוהה באתרו.

Protocol

1. קריו קיבעון של רקמות ליף ידי הקפאה בלחץ גבוה

הערה: סעיף זה מתאר כיצד לבצע הקפאה בלחץ גבוה של רקמות עלו לניסוי להקפיא שבר. משיקולים הקשורים דגימות צמח לראות 29. זה יכול להיות מותאם עבור סוגים אחרים של רקמות או דגימות עם שינוי כלשהו.

  1. שימוש בפינה של סכין גילוח, לגרד את החלק התחתון של חלל 0.1 מ"מ של טסיות אלומיניום 0.1 / 0.2 מ"מ (איור 1). הכן לפחות תריסר טסיות (6 דגימות). קח זהירות לא ליצור סימני סכין על ההיקף של הדיסק.
    1. לאחר מגרד, לשטוף דיסקים באתנול מוחלטת, ולתת להם להתייבש ולשמור בצלחת נקייה.
  2. הכן את מכונת ההקפאה בלחץ גבוה פי הוראות היצרן. ממלא את חדר האלכוהול של מכונת ההקפאה בלחץ גבוה עם isopropanol.
  3. כן infiltratio תוצרת בית ואקום בסיועn המכשיר להחליף גז נמצא רקמת העלה עם נוזל.
    1. בחוזקה להתחבר טיפ 200 פיפטה μl עד הסוף של מזרק 10 מ"ל. חותכים ~ 1 ס"מ של קצה. עושים חור במכסה של צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל ל בחוזקה להתאים את קצה לחתוך. אבק יכול להיווצר בתוך הצינור על ידי משיכת הבוכנה של המזרק.
  4. חותכים חתיכה קטנה של עלים מצמח באמצעות סכין גילוח עם פינצטה מעמידים את עלה בתוך צינור microcentrifuge חצי מלא עם 1-hexadecene. לחדור את החללים בין תאית של העלה עם הנוזל על ידי משיכת הבוכנה בעדינות כדי ליצור ואקום, להחזיק למשך כ -30 שניות, ואז לאט לאט לשחרר את הבוכנה.
  5. הסר את פיסת עלה מהצינור באמצעות פינצטה. חתוך את עלה עם סכין גילוח במקרה זה הוא עבה יותר 0.2 מ"מ וחותכים חתיכה קטנה שתתאים לתוך טסיות.
  6. מניח טסיות נקי עם הצד השרוט לגמרי לתוך המחזיק של מכונת ההקפאה ולאחר מכן למקם את פיסת הקיצוץ של leaf לתוך טסיות. למלא את החלל שנותר סביב עלה עם 1-hexadecene. סיגרו את הכריך באמצעות טסיות אחר, עם השריטות מול העלים.
  7. סגור והדק את הבעל ולהכניס אותו לתוך התא של המכונה. ואז ללחוץ על כפתור "יט 'להקפיא (~ 2,100 ברים תמורת 300 - 500 אלפיות השניה), ובמהירות להעביר לבעל לתוך חנקן נוזלי. מוציאים בזהירות את הכריך קפוא מבעל באמצעות פינצטה מראש מקורר, נזהרת שלא שבר את הכריך.
    הערה: כריכים קפואים סגורים יכולים להיות הקפאה שברה מייד או לשמור חנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. השתמש בגדי משקפי מגן בעת ​​טיפול בחנקן נוזלי.

2. Freeze-שברים-שכבה כפולה ציפוי 27,28

  1. הכן את מכונת שבר הקפאת לשימוש, כולל שני רובים לאידוי פלטינה / פחמן (Pt / C) ופחמן, על פי הוראות היצרן. מניחים את האקדח Pt / C ב 45 מעלותnd אקדח פחמן ב -90 מעלות.
    1. -תוכנית קדם ערכת ציפוי של שכבה 2 ננומטר של Pt / C (שיעור ציפוי 0.02 - 0.04 ננומטר / sec) ושכבת 6 ננומטר של פחמן (ב ~ 0.1 ננומטר / sec).
      1. הזן את ההתקנה, במסך של מכונת הקפאה-שהבר. בחר מספר משתמשים שבו ערכת הציפוי תישמר.
      2. בחר Pt / C עבור 'שכבה 1 ". בחר מסגרת זמן, למשל., 5 דק '(יעלה את הזמן הדרוש לצורך השלמת ציפוי). השתמש בחצים מעלה-מטה להגדיר בעובי של 2 ננומטר.
      3. לחץ על לחצן 'שכבה' לעבור שכבה חזור על שלב 2. 2.1.1.2, למעט פחמן בחר ולהגדיר בעובי של 6 ננומטר.
    2. בדוק ולהתאים פעולת אקדח.
      1. בחירה 'שכבה 1 ". בחר את אקדח Pt / C על ידי לחיצה על הכפתור "GUN1 'ולחץ על כפתור ON בשלט האידוי של מכונת הקפאה-שהבר. לפקח על קצב האידוי לערוך אותו באמצעות ידיות מתח ופליטת until עמד על שיעור של 0.02 - 0.04 ננומטר / sec. "OFF" לחץ על כדי לכבות את האקדח Pt / C.
      2. בחירה 'שכבה 2'. חזור 2.1.2.1, למעט בחירה 'GUN2' ולהתאים עבור שיעור האידוי של ~ 0.1 ננומטר / sec.
  2. מצנן את במת מערכת שבר הקפאת -140 C או C -160 (עלי hydrated או מיובשים, בהתאמה). צרף מעבורת העברת הוואקום קריו למכונית ולמלא הקאמרי שלה עם חנקן נוזלי. לחץ בתא ההקפאה-שבר מקורר הוא בדרך כלל בין 1 - 8 x 10 -7 mbar.
  3. הכנס בעל דגימה שבירה הקפאה (מתאים טסיות 3 מ"מ) לתוך תחנת הטעינה. להציף את תא טעינת התחנה עם חנקן נוזלי.
  4. טען שני כריכים קפואים על אחד בעל יד אחד באמצעות פינצטה כיתת דיוק גבוה. הדק את הכריך הראשון לתוך החזיק ואז להעיף את הבעל מעל לבדוק שזה מתאים בבטחה במקום. חזור על הכריך השני.
  5. Detach המעבורת המקוררת ממכשיר שהבר הקפיא ולחבר אותו אל תחנת הטעינה. פתח את שסתום ההסעות, להציג את הזרוע בהתכנסות אל הבעל וכלא אותו למקומו. מחדש להציג את הזרוע עם הבעל לתוך המעבורת לסגור את שסתום ההסעות באמצעות כפתור תחנת טעינה. צרף המעבורת למכונית להקפיא שבר ולהציג בעל ההחדרה עם היד חוזר בה. לנתק את ההסעות מהמכונה.
  6. יישר את הסכין microtome שבר הקפאת לגובה כזה שהוא יוריד את טסיות העליון של כריכים.
  7. עם סכין microtome, במהירות לשבור את הסנדוויצ'ים, ומייד ולהעלות אותו על מנת למנוע זיהום של הדגימות ידי היצמדות פסולה אל הסכין, ולהפוך את התריס המקורר מעל למישור שנחשף מחדש כדי להגן על הדגימות מפני זיהום אפשרי על ידי מולקולות מים החדר.
  8. מעיל דגימות עם פלטינה ופחמן.
    1. הזן 'שכבה 1 "על SCreen. הפעל את האקדח Pt / C על ידי לחיצה על כפתור "GUN1 'ואחריו כפתור ON. לבדיקת קצב האידוי ברגע שהוא מגיע 0.02 - 0.04 ננומטר / sec, בו זמנית לחשוף את הדגימות ולחצו על כפתור "מדוד" לפקח על עובי השכבה שהופקדה.
      הערה: האקדח יכבה באופן אוטומטי כאשר העובי הגיע הערך שנבחר מראש.
    2. מכסה את הדגימות עם התריס כאשר אידוי Pt / C הושלם.
    3. לחץ על לחצן 'שכבה' לעבור 'שכבה 2'. חזור על שלבים 2.8.1 ו 2.8.2, למעט בחירת 'GUN2' (עבור פחמן) ושיעור אידוי של ~ 0.1 ננומטר / sec.
  9. מומלץ לחמם את במת מערכת שבר הקפאת -120 C.

3. Cryo-מיקרוסקופ אלקטרוני סורק

  1. הכן את מיקרוסקופ אלקטרונים סורק לעבודה קריו.
    1. בחר שלב / שלב initialise מהתפריט confirm הראשי.
    2. בחרו כלים / Goto לוח, ולפתוח בלוח airlock 'על ידי בחירה מתוך הרשימה. לחץ על הכפתור 'הטור הסגור לשכת Valve ". Vent תא מיקרוסקופ על ידי לחיצה על כפתור Vent תחת הלשונית 'אבק'.
    3. בחר כלים / גוטו לוח, ולפתוח בלוח שלב נקודות רשימה '. בחר את מיקום שער קריו לעבור לשלב לקואורדינטות הראויות לקבל את בעל המדגם. הערה: עמדת קריו-החליפין 'מוגדר מראש להיות בקנה אחד עם עמדת יחידת העברת ואקום.
    4. פתח את תא הדגימה עם זוג נקי של כפפות והכנס את הבמה cryo על הבמה המרכזית של המיקרוסקופ. סגור את התא ולחץ על כפתור המשאבה בכרטיסייה 'האבק'.
    5. מצננים את מיקרוסקופ כדי -120 C. מלאו את המיקרוסקופ דיואר עם חנקן נוזלי. הפעל את פונקציית חום על יחידת הבקרה קריו-העברת -120 C פעם את הטמפרטורה של שלב יורדת מתחת -120 C.
  2. עו"דACH מעבורת קריו-העברת המיקרוסקופ ולהעביר בעל המדגם באמצעות הזרוע בהתכנסות אל במת cryo מיקרוסקופ (כמו בשלב 2.5). לנתק את המעבורת מן מיקרוסקופ.
  3. לחץ על כפתור 'טור להרחיב לשכת Valve' בלוח מנעל האוויר.
  4. בזהירות להזיז את בעל הדגימה קרוב העדשה האובייקטיבית (עבודה מרחוק 1 - 2 מ"מ) באמצעות ג'ויסטיק. בחר צמצם 10 מיקרומטר על הכרטיסייה 'הפתחים'. לחץ לחיצה כפולה על שדה EHT בכרטיסייה 'אקדח'. זן 10 (ק) עבור יעד EHT ולחץ על אישור. הקישו על הכרטיסייה EHT התחתונה ובחר "EHT ביום '.
  5. בחירה 'InLens' מהרשימה הנפתחת גלאי בכרטיסייה 'גלאי'. לייעל את תנאי הדמיה (פוקוס, בהירות והניגודיות, יישור קרן, אסטיגמציה) על פי צורך.
  6. לחץ על הכרטיסייה 'סריקה'. בחר סריקה מהירה ( 'מהירות סריקה = 1', המתאים להתעכב זמן של 100 NSEC לפיקסל) כדי למזער את הנזק הקורה, ואתא 'ברזולוצית חנות' של 1,024 x 768 פיקסלים. בחר "קו ממוצע 'ברשימה הנפתחת' הפחתת רעש '. התאם את הערך של N כדי 20 - 30 קווים לחיפוש. הזז את המדגם באמצעות הפונקציה 'Centre Point' (על ידי לחיצה לשונית מלאה במקלדת) כדי לחפש אזורים עם תאי שבר כלורופלסטים (איורים 2 א ו -2).
  7. לרכוש תמונות של כלורופלסטים שבר בהגדלות נמוכות (50 - 70 KX) (איור 2 ג ו 2D). השתמש בפונקצית 'תכונת המרכז' (על ידי לחיצה מלאה-Shift-Tab במקלדת) כדי להתקרב אל פן שבר הכלורופלסט מעניינים לרכוש תמונות בהגדלה גבוהה (100 - 200 KX, איורים 3 ו -4). השתמש באותו הפרמטרים כמו בשלב 3.6 לרכישת תמונה, אבל לשנות את הערך הממוצע ליין N> 100 עבור הפחתת רעש 30.
    1. Freeze לחץ על יחידת בקרת מיקרוסקופ הראשית או בלשונית 'הסריקה' כדי לעצור את הסריקה ולשמוראת התמונה על ידי לחיצה על כפתור "שמור TIFF '.

ניתוח תמונה 4.

הערה: סעיף זה מתאר הליך קצר עבור פילוח של חלקיקי קרום מתמונות SEM-שבר הקפאה באמצעות חבילת הקוד פתוח 31 פיג'י. ניתן להשיג תוצאות דומות עם תוכנת ניתוח תמונה אחרת.

  1. פתח את התמונה עם פיג'י ידי גרירת קובץ התמונה לתוך חלון התוכנה הראשי. המר את התמונה לפורמט 8-bit על ידי בחירת תמונה / סוג / 8 סיביות. תמונה בחר / התאם / בהירות / ניגודיות ולהתאים לפי הצורך (איור 5 א).
  2. באמצעות כלי הקו הישר, למתוח קו את גודל סרגל קנה מידת תמונה המוטבע. בחר לנתח / סט סולם. הזן את הפרטים בקנה המידה הנכונים (מרחק ידוע יחיד אורך) ולחץ על אישור. שמור תמונה מותאמת מותאם זה.
  3. תהליך / מסננים בחרו / לטשטש גאוס (1.5 רדיוס ננומטר) ולוחצים על אישור (איור 5).
  4. תמונה בחר / התאם / Auto מקומי סף (בשיטת Niblack) ולחץ על אישור (5C איור).
  5. בחר ערוך / הפוך ואז תהליך / בינארי / פרשת המים (5D איור).
  6. צייר גבול סביב האזור של (ROI) העניין עם כלי בחירת Freehand. מוסיפים את הבחירה למנהל ROI על ידי בחירת ערוך / בחירה / הוסף מנהל או על ידי לחיצה על 'T'.
  7. בחר עריכה / נקה בחוץ (איור 5E).
  8. בחר לנתח / מדידות גדר, לבחור את הפרמטרים המתאימים (למשל, אזור, אליפסה בכושר).
  9. בחר לנתח / לנתח חלקיקים. זן טווח מתאים לגודל של חלקיקים ולסמן 'תוצאות תצוגה', 'הוסף מנהל', ואם יש צורך, 'אל תכלול בקצוות "אפשרות ולחץ על אישור. התוצאה מוצגת באיור 5F.
  10. פתח את הקובץ צלם מדורגים הציל (שלב 4.2). בחר "הצג הכל", ובטל את הסימון 'תוויות' במנהל ההחזר על ההשקעה. סקור את partic שנבחרles הניח על התמונה המקורית והוסף ידני או סר של בחירות באמצעות 'הוסף' או על 'מחק' כפתורים של מנהל ROI. תקן כל בחירות צורך על ידי שימוש באפשרות בחירת Freehand ואת הכפתור 'עדכן' של מנהל ROI (דמויות 5G ו 5H).
  11. לנתח את הנתונים באמצעות המדידות שהתקבלו. בחלון התוצאות, לחץ על תוצאות / סכם להשיג, למשל, באזור הרע, רעת סרן וגרזנים מינור של החלקיקים המופיעים במנהל ההחזר על ההשקעה. לחץ תוצאות / הפצה, בחר פרמטר (כגון פינה) ולחץ על אישור כדי להציג היסטוגרמה עבור פרמטר זה.

תוצאות

איור 1 מציג קריו-SEM תמונות של טסיות המכיל בלחץ גבוה קפוא, להקפיא-שבר Craterostigma pumilum עלה חתיכות. בדגימות מסוימות, אזורים גדולים של תאים שבר מתקבלים (איור 1 א). במקרים אחרים, פיסת העלה נשארת הדוקה לדיסק העליון והוא יחוסל יחד עם זה (...

Discussion

הטכניקה המתוארת במאמר זה מאפשר חקירה של ממברנות-שבר הקפאת בהקשר של השתמרו היטב רקמות הצמח קפוא בלחץ גבוה על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים קריו-סריקה. היתרון העיקרי של שימוש נהלים אלה הוא כי הכנת מדגם היא פיזית גרידא; שום צעדי שימוש בחומרים כימיים או התייבשות נחוצים. לכן, ...

Disclosures

The authors declare they have no competing financial interests.

Acknowledgements

אנו מודים אנדרס Kaech (אוניברסיטת ציריך) עבור עצות מועילות שלו על סריקת הדמיה במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו נתמכה על ידי המחקר החקלאי הדו-לאומית ארה"ב-ישראל ופיתוח הקרן (מענק לא. ארה"ב-4334-10, ZR), הקרן הלאומית למדע (מענק לא. 1034/12, ZR), והתכנית מדע האדם Frontier (RGP0005 / 2013, ZR). המחקרים במיקרוסקופ אלקטרונים נערכו בבית אירווינג צ'רנה מוסקוביץ 'מרכז ננו וביו-ננו הדמיה במכון ויצמן למדע.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ethanol absBio-Lab052505
IsopropanolBio-Lab162605
1-hexadeceneSigma-AldrichH7009
0.1/0.2 PlateletsEngineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland241Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezersElectron Microscopy Sciences72706-01Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machineBal-TecHPM 010High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture systemLeica MicrosystemsEM BAF 060
Cryo preparation loading stageLeica Microsystems16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturingLeica Microsystems16LZ04746VNClamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttleLeica MicrosystemsEM VCT 100
Scanning electron microscopeZeissUltra 055
Cryo SEM stageLeica Microsystems16770299905
Image acquisiton softwareSmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis softwareFiji/Image J, National Institute of Healthhttp://fiji.sc/Fiji

References

  1. Anderson, J. M. Insights into the consequences of grana stacking of thylakoid membranes in vascular plants: a personal perspective. Aust. J. Plant Physiol. 26 (7), 625-639 (1999).
  2. Branton, D. Fracture Faces of Frozen Membranes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 55 (5), 1048-1056 (1966).
  3. Branton, D., et al. Freeze-Etching Nomenclature. Science. 190 (4209), 54-56 (1975).
  4. Goodenough, U. W., Staehelin, L. A. Structural Differentiation of Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes - Freeze-Etch Electron Microscopy of Wild-Type and Mutant Strains of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 48 (3), 594-619 (1971).
  5. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .6. Location of the P700-Chlorophyll a-Protein-1. Eur. J. Cell Biol. 31 (2), 305-314 (1983).
  6. Staehelin, L. A. Reversible Particle Movements Associated with Unstacking and Restacking of Chloroplast Membranes. Invitro. J. Cell Biol. 71 (1), 136-158 (1976).
  7. Miller, K. R. A Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-I - Changes in Unstacked Membrane Regions. Biochim. Biophys. Acta. 592 (1), 143-152 (1980).
  8. Miller, K. R., Cushman, R. A. Chloroplast Membrane Lacking Photosystem-II - Thylakoid Stacking in the Absence of the Photosystem-II Particle. Biochim. Biophys. Acta. 546 (3), 481-497 (1979).
  9. Miller, K. R., Staehelin, L. A. Analysis of Thylakoid Outer Surface - Coupling Factor Is Limited to Unstacked Membrane Regions. J. Cell Biol. 68 (1), 30-47 (1976).
  10. Simpson, D. J. Freeze-Fracture Studies on Barley Plastid Membranes .3. Location of the Light-Harvesting Chlorophyll-Protein. Carlsberg Res. Commun. 44 (5), 305-336 (1979).
  11. Olive, J., Recouvreur, M., Girardbascou, J., Wollman, F. A. Further Identification of the Exoplasmic Face Particles on the Freeze-Fractured Thylakoid Membranes - a Study Using Double and Triple Mutants from Chlamydomonas-Reinhardtii Lacking Various Photosystem-Ii Subunits and the Cytochrome B6/F Complex. Eur. J. Cell Biol. 59 (1), 176-186 (1992).
  12. Olive, J., Vallon, O., Wollman, F. A., Recouvreur, M., Bennoun, P. Studies on the Cytochrome B6/F Complex .2. Localization of the Complex in the Thylakoid Membranes from Spinach and Chlamydomonas-Reinhardtii by Immunocytochemistry and Freeze-Fracture Analysis of B6/F Mutants. Biochim. Biophys. Acta. 851 (2), 239-248 (1986).
  13. Armond, P. A., Staehelin, L. A., Arntzen, C. J. Spatial Relationship between Light Harvesting Complex and Photosystem-1 and Photosystem-2 in Stacked and Unstacked Chloroplast Membranes. J. Cell Biol. 70 (2), 400-418 (1976).
  14. Staehelin, L. A. Chloroplast structure: from chlorophyll granules to supra-molecular architecture of thylakoid membranes. Photosynth. Res. 76 (1-3), 185-196 (2003).
  15. Nevo, R., Charuvi, D., Tsabari, O., Reich, Z. Composition, architecture and dynamics of the photosynthetic apparatus in higher plants. Plant J. 70 (1), 157-176 (2012).
  16. Platt, K. A., Oliver, M. J., Thomson, W. W. Membranes and Organelles of Dehydrated Selaginella and Tortula Retain Their Normal Configuration and Structural Integrity - Freeze-Fracture Evidence. Protoplasma. 178 (1-2), 57-65 (1994).
  17. Platt-Aloia, K. A., Thomson, W. W. Advantages of the use of intact plant tissues in freeze-fracture electron microscopy. J. Electron Microsc. Tech. 13 (4), 288-299 (1989).
  18. Carson, J. L. Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy. J. Vis. Exp. (91), e51694 (2014).
  19. Kirchhoff, H., et al. Low-light-induced formation of semicrystalline photosystem II arrays in higher plant chloroplasts. Biochemistry. 46 (39), 11169-11176 (2007).
  20. Johnson, M. P., et al. Photoprotective Energy Dissipation Involves the Reorganization of Photosystem II Light-Harvesting Complexes in the Grana Membranes of Spinach Chloroplasts. Plant Cell. 23 (4), 1468-1479 (2011).
  21. Kirchhoff, H., Tremmel, I., Haase, W., Kubitscheck, U. Supramolecular photosystem II organization in grana thylakoid membranes: evidence for a structured arrangement. Biochemistry. 43 (28), 9204-9213 (2004).
  22. Belgio, E., Ungerer, P., Ruban, A. V Light-harvesting superstructures of green plant chloroplasts lacking photosystems. Plant Cell Environ. , (2015).
  23. Goral, T. K., et al. Light-harvesting antenna composition controls the macrostructure and dynamics of thylakoid membranes in Arabidopsis. Plant J. 69 (2), 289-301 (2012).
  24. Charuvi, D., et al. Photoprotection Conferred by Changes in Photosynthetic Protein Levels and Organization during Dehydration of a Homoiochlorophyllous Resurrection Plant. Plant Physiol. 167 (4), 1554-1565 (2015).
  25. Farrant, J. M., Brandt, W., Lindsey, G. G. An Overview of Mechanisms of Desiccation Tolerance in Selected Angiosperm Resurrection Plants. Plant Stress. 1 (1), 72-84 (2007).
  26. Walther, P., Schatten, H., Pawley, J. B. High-resolution cryoscanning electron microscopy of biological samples. Biological Low-Voltage Scanning Electron Microscopy. , 245-261 (2008).
  27. Walther, P., Müller, M. Double-layer coating for field-emission cryo-scanning electron microscopy--present state and applications. Scanning. 19 (5), 343-348 (1997).
  28. Walther, P., Wehrli, E., Hermann, R., Müller, M. Double-layer coating for high-resolution low-temperature scanning electron microscopy. J. Microsc. 179, 229-237 (1995).
  29. Hess, M. W. Cryopreparation methodology for plant cell biology. Cell. Electron Microsc. 79, 57-100 (2007).
  30. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184 (2), 355-360 (2013).
  31. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  32. Walther, P. Recent progress in freeze-fracturing of high-pressure frozen samples. J. Microsc. 212 (1), 34-43 (2003).
  33. Nevo, R., et al. Architecture of Thylakoid Membrane Networks. Lipids Photosynth. 30, 295-328 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

112exoplasmicprotoplasmicphotosystem

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved