クライオ走査電子顕微鏡により凍結破砕葉組織内の光合成膜の超分子組織を学びます

要約

Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.

要約

凍結破砕サンプルのクライオ走査電子顕微鏡（SEM）は近く、ネイティブ条件での生物学的構造の調査を可能にします。ここでは、葉試料内の光合成（チラコイド）膜の超分子組織を研究するための技術について説明します。これは、高圧葉組織の凍結、凍結破砕、二層コーティングし、最終的にクライオSEM画像によって達成されます。二層コーティング法の使用は、凍結、水和サンプルならびに最小充電効果に最小ビーム損傷に高倍率（> 100,000）の画像を取得することができます。記載された手順を用いて、我々はその場で、復活の植物Craterostigmaのpumilumの脱水中に行わ光化学と光捕集アンテナタンパク質複合体の超分子分布の変化を調べました。

概要

酸素発生型光合成、古代のシアノバクテリアに起因するが、葉緑体の細胞小器官の開発につながっ内共生イベントによって藻類や陸上植物に継承されました。すべての現代の酸素発生光栄養生物では、光合成電子伝達とプロトン起動力と還元力の発生が「チラコイド」膜と呼ばれる平坦化嚢様小胞内に行われています。これらの膜は、光合成の光駆動反応を行い、エネルギー変換のための媒体を提供するタンパク質複合体を収容します。植物や（一部）の藻類のチラコイド膜は、2つの別個の形態学的ドメインに区別される：「間質ラメラ」と呼ばれる「グラナ'とグラナを相互接続積み重ね膜と呼ばしっかり密着膜領域^、1。植物や藻類チラコイド膜の様々な凍結破壊の研究は1970年代初めに開始し、行われています。とき凍結破砕、膜細胞区画に応じて、exoplasmic顔（EF）と原形質顔（PF）を生成、それらの疎水性コア²に沿って分割する半膜ボーダー、もともとBranton らによって造語として。 。それぞれ、 'S'と'U'表す「積み重ね」と「アンスタック」膜領域と、EFでは、EFU、のPFとPFU：1975年³工場と藻類チラコイドは、4つの異なる破断面を有します。分割または破壊されていない膜タンパク質の複合体は、膜のE又はP側のいずれかに留まる傾向を有します。チラコイドの異なる破断面は、異なるサイズの粒子および密度^4、及び続く多数の調査を含む初期の観察は、光反応を行う観察粒子と膜タンパク質複合体との間の識別と相関関係につながっ^5-13 （また^、14,15をレビュー参照）。

FREチラコイド膜のエズ-破壊実験は、通常、単離手順中に発生する可能性があり、構造的および/ ​​または超分子組織内の任意の変化の危険にさらされ、（ただし^、16,17を参照）葉緑体または単離されたチラコイド膜の調製物に対して実施されます。破砕後、レプリカが厚いカーボンの層（C）、および生物学的材料¹⁸の最終的に消化し ​​て、その後、白金/カーボン（白金/ C）を蒸 ​​発させることによって調製されます。複製は、透過型電子顕微鏡（TEM）によって可視化されます。従来の凍結割れレプリカ法は、 例えば 、光合成膜と異なるへの適応の超分子組織を研究するための重要なツールとして機能し続けています。、光、条件^19-23。

homoiochlorophyllous復活工場Craterostigmaのpumilum ²⁴の我々の最近の研究では、超分子組織Oの変化を調査することを目的としましたチラコイド膜Fも含め全体としての細胞組織内の、脱水及び再水和中。 homoiochlorophyllous復活種の独自性は、彼らが彼らの光合成装置を保持しながら、それらの栄養組織（葉）で乾燥の条件を生き残ることができるということです。水が利用可能になると、これらの植物は回復し、数日²⁵時間以内に光合成活動を再開する。この研究のために、凍結破砕葉試料の低温走査EM（SEM）イメージングは​​、高圧力がサンプルクライオ固定化のために凍結と一緒にしました。これらの手順は、その天然の状態²⁶に近い状態で凍結された水和生物学的サンプルを可視化する手段を提供します。一つの主な利点は、サンプルが無い連続工程で凍結破断し、塗布後に直接検討されていることです。その水和状態が準備中に維持されているように、これは、異なる相対含水率（RWC）での植物の調査に特に関連します。どうやってこれまでに、1つのクリティカルな欠点は、凍結水和サンプルは光合成複合体の大きさの正確な測定に必要な高倍率、でスキャンする場合は特に、撮影時の光損傷に苦しむ可能性があることです。これを克服するために、この方法は、特定のクライオSEM撮像条件を利用して組み合わせ「二層コーティング^{」（DLC）27,28}と呼ばれます。これらは、有意に少ないビームと小文字が区別されたサンプルをもたらし、光合成タンパク質超分子組織と復活プラントCの他の細胞成分に関する貴重な情報の解明のために許可されましたその場で高倍率でpumilum。

プロトコル

高圧凍結により葉組織の1クライオ固定

注：このセクションでは、凍結破壊実験のための葉組織の高圧凍結を実行する方法について説明します。植物試料に関連する考慮事項については^29を参照^してください。これは、いくつかの修飾を有する組織または試料の他のタイプに適合させることができます。

1. カミソリ刃の角を使用して、0.1 / 0.2ミリメートルのアルミニウム血小板（ 図1）の0.1ミリメートルのキャビティの底部を傷つけます。少なくともダースの血小板（6サンプル）を準備します。ディスクの円周上にナイフマークを作成しないように注意してください。
   1. 無水エタノールにディスクを洗って、引っ掻き後、それらを乾燥させ、清潔な皿に保ちます。
2. 製造業者の指示に従って、高圧の冷凍機を準備します。イソプロパノールで高圧冷凍機のアルコール室を埋めます。
3. 自家製真空支援infiltratioを準備液体と葉組織に見出されるガスを置換するn個のデバイス。
   1. しっかりと10ミリリットル注射器の先端に200μlのピペットチップを接続します。先端の〜1cmに切断してください。しっかりカット先端に合わせて1.5ミリリットルのマイクロチューブのキャップに穴を作ります。真空は、シリンジのプランジャーを引くことにより、チューブ内に作成することができます。
4. カミソリの刃を用いて植物から葉の小片をカットし、ピンセットで1ヘキサデセンで半分満たされたマイクロチューブの内側の葉を置きます。優しく真空を作成するためのプランジャーを引いて、液体と葉の間のスペースに侵入、約30秒間保持し、その後ゆっくりプランジャーを解放します。
5. ピンセットを使用してチューブから葉片を削除します。それは0.2ミリメートルよりも厚い場合にはカミソリの刃で葉をトリミングし、血小板に収​​まる小片をカット。
6. 冷凍機のホルダーに傷側を上にしてきれいな血小板を配置し、その後ルの切断片を配置血小板へのaf。 1-ヘキサデセンと葉の周囲の残りのスペースを埋めます。葉が直面している傷と、別の血小板を用いたサンドイッチを閉じます。
7. 閉じて、ホルダーを締め、機械のチャンバーに挿入します。そして、（〜300のための2100バール - 500ミリ秒）を凍結する「ジェット」ボタンを押すと、すぐに液体窒素中にホルダーを移します。慎重にサンドイッチを破砕しないように注意しながら、予め冷却したピンセットを用いて、ホルダーから冷凍サンドイッチを削除します。
   注：クローズド冷凍サンドイッチは、凍結すぐに骨折したり、後で使用するために液体窒素中に保持することができます。液体窒素を取り扱うときは防護服やメガネを使用してください。

2.フリーズフラクチャーと二層コーティング^27,28

1. 製造元の指示に従って、両方の白金/炭素（のPt / C）を蒸発させるための銃や炭素を含む、使用のために凍結破砕機を準備します。 45度でのPt / C銃を置きますndは90度で炭素銃。
   1. プリプログラムのPt / Cの2-nmの層のコーティングスキーム（被覆率0.02から0.04 nmの/秒）と（〜0.1 nmの/秒での）炭素の6 nmの層。
      1. 凍結破砕機の画面上の設定を入力します。コー​​ティングスキームを保存するユーザー番号を選択します。
      2. 「レイヤー1」のためのPt / Cを選択してください。時間枠を選択例えば 、5分（コーティングを完了するのに必要な所要時間を超えます）。 2nmの厚さを定義するために、上下の矢印を使用してください。
      3. セレクト炭素を除いて、2の手順を繰り返し2.1.1.2レイヤと6nmの厚さを定義するために移動するには「レイヤー」ボタンを押してください。
   2. 銃の動作をテストおよび調整します。
      1. 「レイヤー1」を選択します。 「GUN1」ボタンを押すことでのPt / C銃を選択し、凍結破砕機の蒸発制御ユニットに「ON」ボタンを押してください。蒸発速度を監視し、UNT電圧と発光ノブを使用してそれを調整します0.04 nmの/秒 - イルは、0.02の割合に達しました。 Pt / C銃をオフにするを押して「OFF」。
      2. 「レイヤ2」を選択します。セレクト「GUN2」を除いて、2.1.2.1を繰り返し、〜0.1ナノメートル/秒の蒸着速度を調整。
2. （水和または脱水葉のために、それぞれ）-140 Cまたは-160℃に凍結破壊システムのステージを冷却します。マシンに真空凍結移送シャトルを取り付け、液体窒素で、その室を埋めます。 10 ^-7×8ミリバール-冷却凍結破砕チャンバ内の圧力は、通常、1の間です。
3. ローディングステーションに凍結破砕試料ホルダー（3 mmの血小板に適した）を挿入します。液体窒素でローディングステーション室にあふれます。
4. 高精度グレードのピンセットを使用して1つによって、ホルダ1の上に2冷凍サンドイッチをロードします。ホルダーに最初のサンドイッチを締めて、それが所定の位置にしっかり収まることを確認するためにホルダーを裏返し。第二のサンドイッチのために繰り返します。
5. D凍結破砕機から冷却シャトルをetachとローディングステーションに接続します。 、シャトル弁を開き、ホルダーに後退アームを導入し、所定の位置にロック。シャトルにホルダーとアームを再導入し、ローディングステーションノブを使用して、シャトル弁を閉じます。凍結破砕機にシャトルを取り付け、後退アームとチャンバー内にホルダーをご紹介します。マシンからシャトルを取り外します。
6. それはサンドイッチのトップ血小板をオフにノックするような高さに凍結破壊ミクロトームナイフを合わせます。
7. ミクロトームナイフで、すぐにサンドイッチを壊し、その後、すぐにナイフに破片しがみついによってサンプルの汚染を防止するために、それを上げ、中の水分子によって汚染の可能性からのサンプルを遮蔽するために新たに露出した平面の上に冷却されたシャッターを回しますチャンバー。
8. コー​​ト白金および炭素を含むサンプル。
   1. 皮下の「レイヤ1」を入力してくださいREEN。ボタンを「ON」に続いて「GUN1」ボタンを押すことでのPt / C銃をオンにします。蒸発速度を調べ、それが0.02に達すると - 0.04ナノメートル/秒、同時にサンプルを公開し、堆積層の厚さを監視するために、「測定」ボタンを押してください。
      注：厚さが事前に選択された値に達したときに銃が自動的にオフになります。
   2. Pt / Cの蒸発が完了したときにシャッターを有するサンプルをカバーします。
   3. 「レイヤ2」に移動するには「レイヤー」ボタンを押してください。繰り返します（炭素用）」GUN2 'とは0.1nm /秒〜の蒸発速度を選択することを除いて、2.8.1と2.8.2のステップ。
9. -120℃に凍結破壊システムのステージを温めます。

3.クライオ走査電子顕微鏡

1. クライオ作業のための走査型電子顕微鏡を準備します。
   1. メインメニューからステージ/ステージ初期化を選択して確定します。
   2. [ツール/ガットOパネルには、リストから選択して「エアロック」パネルを開きます。 「閉じる列商工バルブ」ボタンをクリックします。 「真空」タブの下ベントボタンをクリックして、顕微鏡室ベント。
   3. ツール/後藤パネルを選択して、「ステージポイントリスト」パネルを開きます。サンプルホルダを受け入れるための適切な座標にステージを移動するためのクライオ交換位置を選択します。注：「凍結交換位置は、「真空搬送ユニットの位置に位置合わせとなるように予め設定されています。
   4. 手袋のきれいなペアを持つ試料室を開き、顕微鏡のメインステージにクライオステージを挿入します。チャンバーを閉じ、「真空タブ」の下にポンプ]ボタンをクリックします。
   5. -120℃に顕微鏡を冷却します。液体窒素で顕微鏡デュワーを埋めます。ステージの温度が-120℃以下に下がると-120℃にクライオ転送制御部への熱の機能を有効にします。
2. ATT顕微鏡にクライオ移送シャトルをACHと（ステップ2.5のように）顕微鏡クライオステージに後退アームを使用して、サンプルホルダーを転送します。顕微鏡からのシャトルを取り外します。
3. エアロックパネルの「オープンカラム商工バルブ」ボタンをクリックしてください。
4. ジョイスティックを使用して - （2ミリメートル作動距離1）慎重に、対物レンズに近い試料ホルダーを移動します。 「開口部」タブで10μmの開口部を選択します。 「ガン」タブでEHTフィールドをダブルクリックします。 EHTターゲットの10（キロボルト）を入力し、[OK]をクリックします。底EHT]タブをクリックし、「EHTオン」を選択します。
5. 「検出器」タブ内の検出器ドロップダウンリストから「InLens」を選択します。必要に応じて（ピント、明るさやコントラスト、ビームアライメント、非点収差）撮影条件を最適化します。
6. 「スキャン」タブをクリックします。ビームのダメージを最小限にするために（ピクセルあたり100ナノ秒の滞留時間に対応する、「スキャン速度= 1 '）の高速スキャンを選択し、1024×768ピクセルの「ストア解像度」。 「ノイズリダクション」ドロップダウンリストで「ライン平均」を選択します。検索のための30行 - 20にNの値を調整します。骨折した細胞と葉緑体（ 図2Aおよび図2B）を有する領域を検索する（キーボード上のコントロールのタブを押して）「センターポイント」機能を使用してサンプルを移動します。
7. （ - 70 KX 50）（ 図2Cおよび2D）低倍率で骨折した葉緑体の画像を取得します。興味深いの葉緑体骨折の顔にズームインし、高倍率で画像を取得する（キーボード上のコントロールシフト-タブを押して）「センター機能」機能を使用します（100から200 KX、3および図4）。画像取得のためのステップ3.6と同じパラメータを使用しますが、ノイズリダクション³⁰ N> 100へのライン平均値を変更します。
   1. スキャンを停止し、保存するための主顕微鏡制御部上または「スキャン」タブで記者フリーズ「保存TIFF」ボタンを押して画像を表示します。

4.画像解析

注：このセクションでは、フィジー³¹のオープンソースパッケージを使用して凍結破壊SEM像から膜粒子のセグメンテーションのための短い手順を説明します。同様の結果が他の画像解析ソフトウェアを用いて得ることができます。

1. メインプログラムウィンドウに画像ファイルをドラッグしてフィジーで画像を開きます。イメージ/タイプ/ 8ビットを選択することにより、8ビットにイメージを変換します。選択画像/ /明るさ/コントラストを調整し、必要に応じて（ 図5A）を調整します。
2. 直線ツールを使用して、ラインに埋め込まれた画像のスケールバーのサイズを引きます。分析/セットスケールを選択します。適切なスケール情報（長さの既知の距離と単位）を入力し、[OK]をクリックします。この調整スケーリングされた画像を保存します。
3. 選択プロセス/フィルター/ガウスぼかし（1.5 nmの半径）とOK（ 図5B）をクリックします。
4. 選択画像/ / AUTを調整します（Niblack法を使用して）ローカルしきい値oおよびOK（ 図5C）をクリックします。
5. [編集/反転およびプロセスを選択/バイナリ/流域（ 図5D）。
6. フリーハンド選択ツールで関心領域（ROI）の周りに境界線を描画します。編集/選択を選択することにより、ROIマネージャーに選択を追加/マネージャまたは 'T'をクリックして追加します。
7. 外編集/クリア（ 図5E）を選択します。
8. セット/分析測定を選択し、適切なパラメータ（ 例えば、面積、フィット楕円）を選択します。
9. 粒子を分析/分析]を選択します。オプション '縁に除外」し、[OK]をクリックし、必要に応じて、「Managerへの追加」と、粒子の大きさについて適切な範囲を入力し、「結果の表示」をマークします。その結果を図5Fに示されています。
10. 保存されたスケーリングされた画像化されたファイル（ステップ4.2）を開きます。 「すべて表示」を選択し、ROIマネージャの「ラベル」を選択解除します。選択した気難しいを確認レは、元の画像の上に置いて、手動で追加またはROIマネージャのボタンを「追加」または「削除」使用して選択を削除します。フリーハンド選択ツールとROIマネージャー（ 図5G及び5H）の「更新」ボタンを使用して、必要な任意の選択を修正してください。
11. 得られた測定値を使用してデータを分析します。結果ウィンドウで、結果をクリックして/、例えば、取得するために平均エリアを要約し、ROIマネージャに表示された粒子の長軸と短軸を意味します。結果/ディストリビューションをクリックし、（このような領域のような）パラメータを選択して、このパラメータのヒストグラムを表示するには、[OK]をクリックします。

結果

図1は 、高圧凍結、凍結破砕Craterostigma pumilumの葉片を含む血小板のクライオSEM像を示します。いくつかのサンプルでは、骨折した細胞の大部分は、（ 図1A）が得られます。他では、葉片がしっかりとアッパーディスクにバインドされたままで、それ（ 図1B）と一緒に叩き落とされます。しかし、後者の場合には、いくつか?...

ディスカッション

この論文に記載された技術は、低温走査型電子顕微鏡によるよく保存高圧凍結した植物組織のコンテキスト内で凍結破断した膜の調査を可能にします。これらの手順を使用することの主な利点は、試料調製は、純粋に物理的なことです。化学物質や脱水を伴う全く手順は必要ありません。これにより、ネイティブに近い状態^26,32で生物学的構造を研究することができます。葉組織を使...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol abs	Bio-Lab	052505
Isopropanol	Bio-Lab	162605
1-hexadecene	Sigma-Aldrich	H7009
0.1/0.2 Platelets	Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland	241	Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems.
High-precision-grade tweezers	Electron Microscopy Sciences	72706-01	Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers.
High-pressure freezing machine	Bal-Tec	HPM 010	High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Freeze-fracture system	Leica Microsystems	EM BAF 060
Cryo preparation loading stage	Leica Microsystems	16770228
Specimen holder for univeral freeze fracturing	Leica Microsystems	16LZ04746VN	Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm
Vacuum cryo-transfer shuttle	Leica Microsystems	EM VCT 100
Scanning electron microscope	Zeiss	Ultra 055
Cryo SEM stage	Leica Microsystems	16770299905
Image acquisiton software	SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Image analysis software	Fiji/Image J, National Institute of Health	http://fiji.sc/Fiji