Stencil Micropatterning de las células madre pluripotentes para el sondeo Organización Espacial de la diferenciación Parcas

Resumen

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) tienen la capacidad intrínseca para diferenciarse y auto-organizarse en patrones de tejidos distintos; aunque esto requiere la presentación de los gradientes ambientales espaciales. Presentamos micropatterning plantilla como un método simple y robusto para generar gradientes bioquímicas y mecánicas para el control de los patrones de diferenciación HPSC.

Resumen

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introducción

Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs), incluyendo las células madre embrionarias (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son ampliamente explotados en la medicina regenerativa, así como el modelado experimental de la organogénesis normal y enfermo debido a su potencial de diferenciación en linajes celulares de todos tres capas germinales ^1,2. El destino de diferenciación de hPSCs son muy sensibles a factores ambientales locales que pueden modular procesos mechanotransduction autocrinos o paracrinos de señalización ^1, así como mediadas por señales físicas ^3-5. Micropatterning célula abarca un conjunto de técnicas que se han desarrollado para organizar espacialmente la geometría y la localización de una población de células como un medio para controlar el microambiente celular local, tales como las interacciones célula-célula ⁶ y de las interacciones célula-matriz ^3. En el contexto de hPSCs, micropatterning celular se ha empleado para obtener una mejor aproximación a la forma depende de nichola señalización autocrina ent modula células madre decisiones pluripotencia de ^{diferenciación-7} y organización en los primeros patrones de diferenciación de embriones ^6. 2D y 3D hPSCs micropatterned se han utilizado para controlar el tamaño de las colonias de los patrones multicelulares, que a su vez influyeron en las decisiones de diferenciación en las tres capas germinales ^8,9. Hemos empleado micropatrones HPSC multicelulares para modular el grado de célula-célula y las interacciones célula-matriz en una colonia de HPSC para investigar cómo la diafonía integrina-E-cadherina puede dar lugar a la heterogeneidad del destino celular ^10. Las manifestaciones de los informes anteriores nuevas vías abiertas hacia la aplicación de micropatterns multicelulares de hPSCs como modelos experimentales para la detección de toxicidad de los medicamentos para enfermedades del desarrollo ^11, para estudiar el efecto de los factores de crecimiento y hormonas durante el tejido o el desarrollo de órganos, y para desentrañar la formación de los patrones de tejido.

Una miríada de micropatter celulartécnicas Ning se han desarrollado como revisado por Falconnet et. al., ¹² pero sólo un puñado, tales como micro-impresión de contacto ^{7,8,13, 14,15} cultura microplaca, photopatterning ⁶ y ¹⁶ microstencils se han aplicado con éxito con hPSCs. El reto con hPSCs micropatterning radica en su vulnerabilidad y un requisito estricto de matrices específicas extracelular (ECM) y condiciones de crecimiento para la fijación celular y la supervivencia. Para los patrones 2D HPSC, la impresión por microcontacto es uno de los métodos más comunes para generar micropatterns HPSC en cultivo de tejidos y de sustratos de vidrio ^13. El método se puede utilizar para patrón ECM común utilizado en la cultura HPSC, incluyendo laminina y la membrana basal, tales como matrices de Matrigel. Sin embargo, se requiere típicamente un procedimiento de revestimiento de dos etapas con la ayuda de poli-D-lisina, y necesita condiciones atmosféricas inertes y humedad específicas para hacer micropatrones ECM estables para hPSCs para fijar en ^6,13. La consideración más importante de cada método micropatterning es si el régimen de modificación de la superficie puede generar patrones de ECM HPSC-adhesivas en una resolución geométrica deseada al tiempo que minimiza la unión celular no específica a las zonas circundantes.

Aquí, se presenta el uso de la plantilla micropatterning como un método simple para generar micropatterns HPSC sin etapas adicionales de modificación de la superficie antes de la generación de patrones de ECM adhesivas para hPSCs para unir sucesivamente. La plantilla de célula comprende una membrana delgada, hoja por ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), con micras a milímetro tamaño orificios pasantes selladas sobre un sustrato de cultivo de células para contener físicamente recubrimientos ECM y hPSCs posteriormente sembradas. Como patrón de la plantilla funciona restringiendo físicamente el lugar donde HPSC puede acceder y conectar directamente al sustrato ECM subyacente recubierto, este método es compatible con varios sustratos que pueden apoyar las culturas HPSC. Los únicos requirement es que la elección del material de la plantilla puede formar un cierre reversible con el sustrato. Estos sustratos incluyen poliestireno convencional de cultivo de tejidos (TCPS) ^17, los sustratos conjugados de ligando ^18, así como sustratos elastoméricos con rigidez sintonizable (por ejemplo., PDMS) ^19. Este método también permite recubrimiento de diferentes ECM, tales como vitronectina (o proteína VTN), laminina y matrices de membrana basal (por ejemplo, Matrigel y Geltrax) para permitir la unión y la diferenciación de hPSCs adecuada. configuraciones ECM-sustrato, por lo tanto, podemos transferir optimizados para una línea específica para HPSC stencil Micropatterning para una óptima adhesión célula-matriz, la supervivencia y la diferenciación. Recientemente, también se ha informado de un método similar para dirigir la diferenciación hepática por hESCs Micropatterning utilizando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) matrices de micro-stencil ^16.

stencils celulares pueden ser fabricados de diferentes materiales, incluyendo reunieronALS ^20,21, poli (p-xilileno) polímeros ^22,23, PMMA ¹⁶ y más comúnmente, PDMS ^24-28. El silicio y el poli (p-xilileno) polímeros plantillas requieren el grabado directo de los orificios pasantes con equipo especializado ^{20 a 23,} lo que limita su accesibilidad para los usuarios biológicos. PDMS plantillas pueden ser fabricados por diferentes métodos dependiendo del tamaño característica requerida, que varía típicamente de 3 micras a 2000 micras ^11,26-29. Si se desean características pequeñas, hojas de estarcir delgadas se pueden producir mediante moldeo por prensado PDMS pre-polímero en una plantilla de silicio microfabricado que contiene relieves de los micropatrones ^28. Para las funciones de> 1.000 micras, un cortador láser de CO ₂ proporciona un método fácil y de bajo costo para reducir directamente los patrones en una hoja de PDMS pre-fundido durante la fabricación de la plantilla. El reciclado de las plantillas de PDMS también los hace rentable para llevar a cabo una serie de experimentos con suficiente consistencia.

A continuación, se presenta la metodología detallada para la fabricación de una plantilla de PDMS con 1.000 micras características mediante corte por láser y la generación de células madre micropatterns. Estos micropatrones de células madre se utilizan para modular la amplitud de la integrina y E-cadherina mediadas adherencias dentro de una colonia hESC cohesiva con el fin de investigar cómo polarización espacial de la adhesión celular resultó en la celda destino heterogeneidad ^10.

Protocolo

NOTA: Este protocolo describe la fabricación de PDMS plantilla con 1.000 micras patrones de corte por láser y micropatterning de la línea de células madre, H9 usando la plantilla de PDMS.

1. Diseño y fabricación de PDMS de la plantilla para Micropatterning

1. El diseño de la hoja de colocación de letreros de agujeros pasantes de la geometría y el tamaño deseados (por ejemplo, 1.000 micras círculos) y la junta de la plantilla utilizando el software de diseño asistido por ordenador ^10.
2. Laser-cortar la hoja de colocación de letreros y la junta en 120-150 micras y 2 mm de espesor polidimetilsiloxano (PDMS) hojas, respectivamente, utilizando un láser de _CO2-fresa ^10.
3. Unir la junta de PDMS con la hoja de la plantilla PDMS utilizando PDMS sin curar líquidos y horno a 60 ° C durante 3-4 h para obtener la plantilla de PDMS micropatterning.
4. Esterilizar la plantilla PDMS en autoclave a 120 ° C durante 30 min y secado en un horno antes de su uso.

2. CMEh Principalmantenimiento

1. Cultura de las líneas de células madre en un medio de mantenimiento sin alimentador de 1 × placas de cultivo celular recubierto de matriz de la membrana basal de células madre cualificado a 37 ° C y 5% de _CO2.
2. Pasaje la hESCs cuando son aproximadamente el 70% de confluencia en un 3 minutos de incubación a 37 ° C con dispasa tratamiento y disociar mecánicamente las colonias de células madre en 100-200 micras grumos. Placa de los grupos hESCs a una densidad de 30-50 grupos por 9,6 cm ² de área de crecimiento en la membrana basal de la matriz recubierta de poliestireno de cultivo de tejido en relación de 1: 6 de división.

3. Plantilla Micropatterning de células estaminales embrionarias humanas

1. Preparación previa a la celda patrón
   1. Sellar una plantilla de PDMS en una placa de Petri de 60 mm mediante la supresión de 700 l 70% de etanol grado analítico en agua ultrapura en la placa de Petri y la colocación de la plantilla en la parte superior.
   2. Coloque la placa de Petri en el interior de cabinas de seguridad durante la noche para permitir que tél etanol seco.
   3. Verificar existe ninguna burbuja debajo de la plantilla para asegurar que la plantilla se forma un buen sello con la placa de Petri. Esto evita las fugas de solución de recubrimiento ECM. Sellar la placa de Petri y almacenar bajo condiciones estériles hasta que esté listo para la siembra de células.
   4. Preparar alícuotas de matriz de membrana basal células madre cualificado de acuerdo con el certificado de análisis. Asegúrese de que cada uno de los rendimientos alícuota de 1 × solución matriz de la membrana basal células madre cualificado cuando se diluye en 25 ml de de Eagle modificado por Dulbecco: mezcla nutriente F-12 (DMEM / F12) de acuerdo con la hoja de producto del fabricante.
   5. Preparar la solución de recubrimiento ECM mediante la adición de una alícuota de la matriz de la membrana basal células madre cualificado en 16,7 ml de DMEM / F12 para hacer 1,5 x solución matriz de la membrana basal células madre cualificado. Mantener toda la solución de revestimiento de ECM en hielo para evitar la gelificación.
   6. Suplemento medio de mantenimiento de células madre con 10 mM inhibidor ROCA (Y27632).
2. ECM recubrimiento sobre el sustrato estarcido
   1. El tratamiento de la placa de Petri con 100 WO ₂ plasma durante 90 segundos. Para garantizar la esterilidad, sólo se abra la tapa de placa de Petri en el interior de la cámara de plasma antes del tratamiento de plasma, de forma rápida y cubrir de nuevo la placa de Petri después de la finalización del tratamiento. Esto facilita la humectación de la superficie y previene la formación de burbujas de aire en el micropatrón orificios pasantes durante la adición de solución de recubrimiento ECM.
   2. Añadir 450 l de solución de matriz de membrana basal células madre cualificado 1,5 × para cubrir la totalidad de la plantilla. Sellar la placa de Petri con una película auto-sellable, tal como Parafilm, para evitar que la solución se seque, y se incuba durante 5 horas a 37 ° C antes de su uso.
3. CMEh de siembra sobre el sustrato estarcido
   1. Examine las colonias de células madre en la placa de 6 pocillos para identificar las áreas de células diferenciadas que muestra la pérdida de la morfología típica de células madre (por ejemplo, pérdida de redondeada, bien packed morfología epitelial, relación / citoplasma alta núcleo con nucléolos prominentes). Eliminar regiones diferenciadas utilizando un aspirador de vacío.
   2. Lavar dos veces con 2 ml de DMEM / F12 por pocillo.
   3. Añadir 1 ml de las enzimas digestivas, tales como Accutase, por pocillo de placa de 6 pocillos y se incuba a 37 ° C durante 8 min. Golpear suavemente la placa para separar todas las colonias del sustrato.
   4. Enjuague cada pocillo con al menos 4 ml de DMEM / F12 por 1 ml de las enzimas digestivas y recoger la suspensión de células en 15 ml de tubo cónico.
   5. Centrifugar la suspensión celular a 200 g durante 3 min a temperatura ambiente.
   6. Aspirar para eliminar el sobrenadante y añadir 400 l de medio de mantenimiento suplementado con células madre inhibidor ROCA (Rocki) para volver a suspender las células. Pipetear la suspensión de células arriba y abajo 3 veces con cuidado para romper grumos en células individuales.
   7. Mezclar el bien suspensión de células individuales y se diluye 10 l de muestras de células en 190 l de DMEM / F12 (1:20 dilución). Use un hemocytometer para determinar la densidad celular en la suspensión celular stock.
   8. Calcular la densidad de la siembra de células necesaria para una plantilla dada.
      NOTA: Por ejemplo, se ha determinado experimentalmente la densidad de la siembra de células para obtener una monocapa confluente de células individuales es de aproximadamente 4.444 células / mm ^2. Por lo tanto, una plantilla con una superficie de 450 mm ² y el volumen de siembra de 400 l se requiere una suspensión de células a ser a una densidad de 2 millones de células / 400 l.
   9. Se diluye la suspensión de células de valores para la densidad de siembra requerido (véase el paso 3.3.8 NOTA) con medio de cultivo suplementado con células madre Rocki.
   10. Añadir un volumen designado de suspensión de células que contiene el número requerido de células en cada plantilla y dejar la placa de Petri sin problemas en campana durante 5 min a temperatura ambiente para permitir que las células se asienten.
   11. La transferencia de la placa de Petri en la incubadora y se incuba durante 1 hora para permitir para la fijación celular. Tenga cuidado de mantener el nivel de placa de Petri durante eltransferir proceso para que las células se mantienen como una monocapa en la plantilla.
4. La eliminación de la plantilla y la pasivación del sustrato sin patrón
   1. Examinar la placa de Petri bajo un microscopio para verificar si las células están bien fijados en el sustrato subyacente.
   2. Aspirar distancia suspensión de células de la plantilla.
   3. Añadir 2 ml / placa de cultivo de células de 0,5% de tensioactivo no iónico compatible en DMEM / F12 a la zona que rodea a la plantilla.
   4. Use un par de pinzas tratadas en autoclave para pelar suavemente de la plantilla. Agitar la solución de tensioactivo no iónico como alrededor de la plantilla se despega para evitar que las células se sequen. observar visualmente las células micropatterned en la placa de Petri.
   5. Se incuban las células en solución micropatterned tensioactivo no iónico-DMEM / F12 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
   6. Aspirar la solución de distancia / F12 tensioactivo-DMEM no iónico. Lavar 3 veces con 2 ml / plato de DMEM / F12.
   7. Añadir 2 ml / placa de células madremedio de mantenimiento suplementado con Rocki e incubar a 37 ° C durante la noche.
   8. Después de la incubación durante la noche, aspirado hESC medio de mantenimiento suplementado con Rocki, lavar una vez con DMEM / F12 y inducir la diferenciación mesoendoderm añadiendo 2 ml / placa de medio de diferenciación suplementado con 100 ng / ml de activina, 25 ng / ml BMP4 y 10 ng / FGF2 ml .
   9. Evaluar los micropatterns utilizando imágenes de contraste de fase y calcular los perfiles promedio Brachyury (T) de intensidad para cada patrón como se describe anteriormente ^8.

Resultados

En este trabajo se describe la fabricación de una plantilla de células mediante el uso de un cortador láser para generar 1.000 micras características. La plantilla se compone de 2 partes: una lámina delgada de letreros (aproximadamente 100-200 m de espesor) que contiene la microestructura agujeros pasantes, y una junta de PDMS para contener la solución de recubrimiento ECM o suspensión celular. Aquí, las hojas gruesas de PDMS comercialmente disponibles 127 micras y 2 mm se usaron...

Discusión

La fabricación de plantillas Micropatterning

micropatterning de la plantilla proporciona un método ideal para generar micropatterns HPSC para la investigación de nicho mediada por los patrones de diferenciación. La principal ventaja de los patrones de la plantilla sobre otras técnicas micropatterning, tales como impresión por microcontacto y photopatterning, es que no requiere modificación de la superficie y puede ser implementado sobre sustratos TCPS convenc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm Petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates