Stencil micropatterning de células-tronco pluripotentes humana para sondar organização espacial de diferenciação Fates

Resumo

células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tem a capacidade intrínseca de se diferenciar e se auto-organizam em padrões de tecidos distintos; embora isso exige a apresentação de gradientes ambientais espaciais. Apresentamos stencil micropatterning como um método simples e robusto para gerar gradientes bioquímicas e mecânicas para controlar os padrões de diferenciação HPSC.

Resumo

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introdução

As células estaminais pluripotentes humanas (hPSCs), incluindo células embrionárias estaminais (hESCs) e células estaminais pluripotentes induzidas (hiPSCs), são amplamente explorados em medicina regenerativa, bem como modelagem experimental da organogénese normais e doentes devido ao seu potencial de diferenciação em linhagens celulares de todos três camadas germinativas ^1,2. O destino de diferenciação de hPSCs são altamente sensíveis a factores ambientais locais que podem modular processos mecanotransdução autócrino ou parácrino de sinalização ^1, bem como mediadas por sinais físicos ^3-5. Micropatterning celular engloba um conjunto de técnicas que foram desenvolvidas para organizar espacialmente a geometria e a localização de uma população de células como um meio para controlar o micro-ambiente celular local, tais como as interacções célula-célula e ⁶ interacções célula-matriz ^3. No contexto da hPSCs, micropatterning celular tem sido empregado para obter insights importantes sobre como nicho dependeráent sinalização autócrina modula hESC decisões pluripotência-diferenciação ⁷ e organização em primeiros padrões de diferenciação embrionárias ^6. 2D e 3D hPSCs micropatterned têm sido utilizados para controlar o tamanho das colónias de padrões multicelulares, que por sua vez influenciam as decisões de diferenciação para as três camadas germinais ^8,9. Temos empregue micropadrões HPSC multicelulares para modular o grau de célula-célula e as interacções célula-matriz dentro de uma colónia HPSC para sondar como integrina-E-caderina diafonia pode dar origem ao destino celular heterogeneidade ^10. As manifestações dos relatórios acima abrir novos caminhos para a aplicação de micropadrões multicelulares de hPSCs como modelos experimentais para o rastreio toxicidade dos medicamentos para doenças do desenvolvimento ^11, para estudar o efeito de fatores de crescimento e hormônios durante a tecido ou desenvolvimento de órgãos, e para desvendar a formação de padrões de tecido.

Uma miríade de micropatter celularning técnicas têm sido desenvolvidas como revisto por Falconnet et. . al ^12, mas apenas um punhado, como micro-contacto imprimir ^7,8,13, micropoços cultura ^14,15, photopatterning ⁶ e microstencils ¹⁶ foram implementadas com sucesso com hPSCs. O desafio com hPSCs micropatterning reside na sua vulnerabilidade e uma exigência rigorosa de matrizes específicas extracelular (MEC) e as condições de crescimento para a fixação e sobrevivência celular. Para padrões 2D HPSC, impressão micro-contato é um dos métodos mais comuns de gerar micropadrões HPSC em cultura de tecido e vidro substratos ^13. O método pode ser usado para padrão de ECM comum utilizado na cultura HPSC, incluindo matrizes de laminina e da membrana basal, tais como Matrigel. No entanto, isso requer tipicamente um processo de revestimento de duas etapas auxiliado por poli-D-lisina, e necessita de condições atmosféricas e humidade inertes específicos para fazer micropadrões ECM estáveis ​​para hPSCs para anexar em ^6,13. A principal consideração de cada método micropatterning é se o regime de modificação da superfície pode gerar padrões de ECM HPSC-adesivas na resolução geométrica desejada, minimizando a fixação das células inespecífica para as áreas circundantes.

Aqui, nós relatamos o uso de micropatterning estêncil como um método simples para gerar micropadrões HPSC sem etapas de modificação de superfície suplementar, antes da geração de padrões de ECM adesivas para hPSCs para anexar diante. O estêncil célula é composta por uma fina membrana, folha por exemplo, polidimetilsiloxano (PDMS), com micron de milímetro de tamanho orifícios lacrados em um substrato de cultura de células para conter fisicamente revestimentos ECM e hPSCs posteriormente semeadas. Como estêncil padronização funciona, restringindo fisicamente do local onde HPSC pode acessar e ligam directamente ao substrato subjacente ECM revestido, este método é compatível com vários substratos que podem suportar culturas HPSC. As únicas requirement é que a escolha do material da matriz pode formar uma vedação reversível com o substrato. Estes substratos incluem poliestireno convencional de cultura de tecidos (TCPS) ^17, substratos conjugados de ligando ^18, bem como substratos elastoméricos com rigidez ajustável (por exemplo., PDMS) ^19. Este método também permite que o revestimento de ECM diferente, tais como vitronectina (ou proteína VTN), laminina e matrizes de membrana basal (por exemplo, Matrigel e Geltrax) para permitir a fixação e diferenciação de hPSCs adequada. configurações de ECM-substrato Portanto, podemos transferir otimizadas para uma linha específica para HPSC estêncil micropatterning para óptima de células-matriz de adesão, sobrevivência e diferenciação. Recentemente, um método semelhante foi também relatada para dirigir a diferenciação hepática por hESCs micropatterning usando poli (metacrilato de metilo) (PMMA) de matrizes de micro-estêncil ^16.

stencils celular pode ser fabricado a partir de materiais diferentes, incluindo metals ^20,21, poli (p-xilileno) polímeros ^22,23, PMMA ¹⁶ e mais comumente, PDMS ^24-28. Silicone e poli (p-xilileno) polímeros stencils exigem gravura directa dos furos de passagem com equipamento especializado ^20-23, o que limita a sua acessibilidade aos utilizadores biológicos. PDMS matrizes podem ser fabricados por diferentes métodos, dependendo do tamanho funcionalidade requerida, que tipicamente varia de 3 uM a 2.000 uM ^11,26-29. Se pequenas características são desejadas, folhas de stencil finos pode ser produzida por moldagem por prensa de pré-polímero de PDMS em um modelo de silício microfabricado contendo relevos dos micropadrões ^28. Para recursos> 1.000 mm, um cortador de laser de CO ₂ proporciona um método de custo fácil e baixo para cortar diretamente os padrões sobre uma folha de PDMS pré-fundido durante a fabricação stencil. A reciclagem dos stencils PDMS também os torna rentável para realizar uma série de experimentos com consistência suficiente.

Aqui, apresentamos a metodologia detalhada para a fabricação de um estêncil PDMS com 1.000 mm características de corte a laser e à geração de micropadrões hESC. Estas células estaminais embrionárias humanas micropadrões foram usadas para modular o grau de integrina e E-caderina mediada aderências dentro de uma colónia coesa células estaminais embrionárias humanas, de modo a investigar a forma como a polarização espacial de adesão celular resultou na célula destino heterogeneidade ^10.

Protocolo

NOTA: Este protocolo descreve a fabricação de PDMS stencil com 1.000 mm padrões de corte a laser e micropatterning da linha de células estaminais embrionárias humanas, H9 usando o stencil PDMS.

1. Projeto e Fabricação de PDMS do estêncil para micropatterning

1. Projetar a folha de stencil com furos de passagem da geometria desejada e tamanho (por exemplo, 1.000 mm círculos) ea junta estêncil usando software de desenho auxiliado por computador ^10.
2. Laser-cortar a folha de stencil e junta em 120-150 mm e 2 mm de espessura polidimetilsiloxano (PDMS) folhas, respectivamente, usando um laser de CO _2-cortador ^10.
3. Unir a junta PDMS com a folha de stencil PDMS usando PDMS não curado líquidos e leve ao forno a 60 ° C durante 3-4 horas para obter o stencil PDMS para micropatterning.
4. Esteriliza-se o estêncil PDMS em autoclave a 120 ° C durante 30 min e secagem num forno antes da sua utilização.

2. hESCs Principalmanutenção

1. Cultura as linhas de células estaminais embrionárias humanas em um meio de manutenção isento de alimentador em 1 × placas de cultura celular de matriz revestida da membrana basal hESC qualificado a 37 ° C e 5% de CO _2.
2. A passagem hESCs quando eles são aproximadamente 70% confluentes por 3 minutos de incubação a 37 ° C com dispase tratamento e mecanicamente dissociar as colónias em células estaminais embrionárias humanas 100-200 uM aglomerados. Placa os aglomerados hESCs a uma densidade de 30-50 aglomerados por 9,6 centímetros ² de área de crescimento sobre-revestidos de matriz de membrana basal do tecido em polistireno para cultura de relação de 1: 6 a divisão.

3. Stencil micropatterning de células estaminais embrionárias humanas

1. Preparação prévia para a célula padronização
   1. Selar um stencil PDMS em um 60 milímetros placa de Petri dispensando 700 mL de 70% de etanol grau analítico em água ultrapura para a placa de Petri e colocar o estêncil no topo.
   2. Coloque a placa de Petri dentro de gabinete de biossegurança durante a noite para deixar tele etanol seco.
   3. Verificar existe nenhuma bolha por baixo da matriz para assegurar que a matriz forma uma boa vedação com a placa de Petri. Isto impede as fugas de solução de revestimento de ECM. Selar a placa de Petri e armazenar em condições estéreis até que esteja pronto para a semeadura de células.
   4. Preparar alíquotas de matriz de membrana basal hESC-qualificados de acordo com o Certificado de Análise. Assegurar que cada alíquota rendimentos 1 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificada quando diluída em 25 ml de Dulbecco Modified Eagle Medium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F12) de acordo com a folha de produto do fabricante.
   5. Preparar a solução de revestimento ECM através da adição de uma alíquota de matriz de membrana basal hESC-qualificada em 16,7 ml de DMEM / F12 para fazer 1,5 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificado. Manter toda a solução de revestimento de ECM no gelo para evitar a gelificação.
   6. Suplemento meio de manutenção hESC com 10 mM inibidor ROCHA (Y27632).
2. revestimento de ECM no substrato estampado
   1. Trate a placa de Petri com 100 WO ₂ plasma durante 90 segundos. Para garantir a esterilidade, a apenas abrir a tampa placa de Petri dentro da câmara de plasma antes do tratamento por plasma, e rapidamente a tampa traseira do prato de Petri, após a conclusão do tratamento. Isto facilita a molhagem da superfície e impede a formação de bolhas de ar no micropadrão orifícios de passagem durante a adição da solução de revestimento de ECM.
   2. Adicionar 450 mL de 1,5 × solução de matriz de membrana basal hESC-qualificados para cobrir todo o stencil. Selar a placa de Petri com uma película auto-selável, tais como Parafilm para evitar que a solução de secar e incubar durante 5 horas a 37 ° C antes da utilização.
3. HESCs de semeadura sobre o substrato estampado
   1. Examinar colónias em células estaminais embrionárias humanas de 6 poços da placa para identificar as áreas de células diferenciadas mostrando a perda de morfologia típica de células estaminais embrionárias humanas (por exemplo, perda de arredondada, firmemente packed morfologia epitelial, razão / citoplasma alta núcleo com nucléolo proeminente). Remover regiões diferenciadas usando um aspirador a vácuo.
   2. Lavar duas vezes com 2 ml de DMEM / F12 por poço.
   3. Adicionar 1 ml de enzimas digestivas, tais como Accutase, por poço da placa de 6 poços e incuba-se a 37 ° C durante 8 min. Toque a placa suavemente para retirar todas as colônias de substrato.
   4. Lavar cada poço com, pelo menos, 4 ml de DMEM / F12 por 1 ml de enzimas digestivas e recolher a suspensão de células no tubo de 15 ml.
   5. Centrifugar a suspensão de células a 200 x g durante 3 minutos à temperatura ambiente.
   6. Aspirar para eliminar o sobrenadante e adicionar 400 ul de meio de manutenção de células estaminais embrionárias humanas suplementado com inibidor ROCHA (Rocki) para re-suspender as células. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo 3 vezes suavemente para quebrar aglomerados em células individuais.
   7. Misture bem a única suspensão de células e dilui-se 10 ul de amostras de células em 190 ul de DMEM / F12 (diluição de 1:20). Use um hemocytomeTer para determinar a densidade de células na suspensão de células de reserva.
   8. Calcula-se a densidade de sementeira de células necessário para uma determinada matriz.
      NOTA: Por exemplo, temos experimentalmente determinada a densidade de sementeira de células para se obter uma monocamada confluente de células isoladas é de cerca de 4.444 células / mm ^2. Assim, uma matriz com uma área de 450 ^mm2 e volume de sementeira de 400 uL irá necessitar de uma suspensão de células a ser a uma densidade de 2 milhões de células / 400 ul.
   9. Dilui-se a suspensão de células de ações para a densidade de semeadura necessária (veja o passo 3.3.8 NOTA) com meio de cultura suplementado com hESC Rocki.
   10. Adicionar um volume designado de suspensão de células contendo o número necessário de células em cada matriz e deixar a placa de Petri na capa sem ser perturbado durante 5 min à temperatura ambiente para permitir que as células assentar.
   11. Transferir a placa de Petri em incubadora e incubar durante 1 h para permitir a ligação de células. Tome cuidado para manter o nível de placa de Petri durante oprocesso de transferência de modo que as células permanecem como uma monocamada na matriz.
4. Remoção de estêncil e passivação do substrato unpatterned
   1. Examinar a placa de Petri sob um microscópio para verificar se as células forem correctamente ligado ao substrato subjacente.
   2. Aspirar afastado suspensão de células a partir do stencil.
   3. Adicione 2 ml / prato de cultura de células de 0,5% compatível surfactante não-iônico em DMEM / F12 para a área em torno do estêncil.
   4. Use um par de fórceps autoclavados para descascar delicadamente fora do estêncil. Agitar a solução de agente tensioactivo não iónico como em torno do estêncil é retirado para evitar que as células de secar. Observar visualmente as células micropatterned na placa de Petri.
   5. Incubar as células em solução de tensioactivo micropatterned-DMEM / F12 não iónico 0,5% durante 10 min a 37 ° C.
   6. Aspirar a solução de distância / F12 de DMEM-surfactante não-iónico. Lavar 3 vezes com 2 mL / prato de DMEM / F12.
   7. Adicione 2 ml / prato de hESCmeio de manutenção suplementado com Rocki e incubar a 37 ° C durante a noite.
   8. Após incubação durante a noite, o meio de manutenção aspirado de células estaminais embrionárias humanas suplementado com Rocki, lavar uma vez com meio DMEM / F12 e induzir a diferenciação mesoendoderm por adição de 2 ml / placa de meio de diferenciação suplementado com 100 ng / ml de Activina, 25 ng / ml BMP4 e 10 ng / FGF2 ml .
   9. Avaliar os micropadrões utilizando imagiologia de contraste de fase e calcular os perfis de intensidade média Brachyury (t) para cada padrão, tal como descrito anteriormente ^8.

Resultados

Neste artigo, descreve a fabricação de um estêncil célula usando um cortador a laser para gerar 1.000 mm características. A matriz foi composta por 2 partes: uma folha de stencil fina (cerca de 100-200 mm de espessura) que contém o micropadrão furos de passagem, e uma junta de PDMS para conter a solução de revestimento de ECM ou de suspensão de células. Aqui, 127 im e 2 mm de espessura folhas de PDMS comercialmente disponíveis foram usadas como a folha de stencil e junta resp...

Discussão

Fabricação de stencils micropatterning

micropatterning estêncil fornece um método ideal para gerar micropadrões HPSC para investigar mediada por nicho de padronização diferenciação. A principal vantagem de estêncil sobre outras técnicas de modelação micropatterning, tais como a impressão e microcontact photopatterning, é que ele não necessita de modificação da superfície, e podem ser aplicadas em substratos convencionais TCPS. Portanto, os meios d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm Petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates