JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Özet

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Giriş

Embriyonik kök hücreler (hESC) ve uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (hiPSCs) de dahil olmak üzere insan pluripotent kök hücreler (hPSCs), yaygın olarak tüm hücre soyları halinde nedeniyle farklılaşma potansiyeli, normal ve hastalıklı organogenez deneysel modelleme gibi rejeneratif tıpta istismar üç germ katmanları 1,2. HPSCs farklılaşması kaderi fiziksel ipuçları 3-5 aracılık ettiği otokrin veya 1 sinyal parakrin yanı sıra mechanotransduction süreçleri modüle yerel çevresel faktörlere karşı oldukça duyarlıdır. Hücre micropatterning mekansal, hücre-hücre etkileşimleri 6 ve hücre-matris etkileşimlerinin 3 gibi, yerel hücresel mikro-kontrol etmek için bir araç olarak bir hücre popülasyonunun geometrisi ve konumu düzenlemek için geliştirilmiş tekniklerin bir dizi kapsar. hPSCs bağlamında, hücre micropatterning niş bağlıdır nasıl hakkında önemli bilgiler elde etmek için istihdam edilmiştirKBB otokrin sinyalizasyon erken embriyonik farklılaşma kalıpları 6 içine HESC Pluripotency-farklılaşma kararları 7 ve organizasyon düzenler. 2D ve 3D micropatterned hPSCs sırayla üç germ 8,9 içine farklılaşma kararları etkilemiş çok hücreli desen, koloni boyutunu denetlemek için kullanılmıştır. Bu integrin E-kadherin karışma hücre kaderi heterojen 10 çıkmasına neden olabilir araştırmak üzere bir hPSC koloni içindeki hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin ölçüde modüle edilmesi için çok-hPSC micropatterns kullanmışlardır. Doku veya organ gelişimi sırasında büyüme faktörleri ve hormonların etkisini araştırmak için gelişimsel hastalıklar 11, ilaç toksisitesi taraması için deneysel model olarak hPSCs ve çok hücreli micropatterns uygulanması yönünde yukarıdaki raporlar açık yeni caddeleri gösteriler ve oluşumunu çözülmeye doku desenleri.

Hücre micropatter bir sayısızFalconnet diğerleri tarafından gözden olarak ning teknikler geliştirilmiştir. ark. 12 ancak böyle mikro temas 7,8,13 yazdırma gibi sadece bir avuç, Mikro kültürü 14,15, photopatterning 6 ve microstencils 16 başarıyla hPSCs ile hayata geçirilmiştir. micropatterning hPSCs Challenge etkilenmeleri ve hücre eki ve hayatta kalma için spesifik hücre dışı matris (ECM) ve büyüme koşullarının sıkı bir gereksinimi bulunmaktadır. 2D hPSC kalıpları için, mikro-kontak baskı doku kültürü ve cam yüzeylerde 13 hPSC micropatterns oluşturmak için en yaygın yöntemlerden biridir. yöntem, Matrigel olarak laminin ve bazal zar matris, aşağıdakileri içeren hPSC kültür, kullanılan model yaygın ECM için kullanılabilir. Bununla birlikte, tipik olarak poli-D-lizin ile destekli iki aşamalı bir kaplama işlemini gerektirir ve hPSCs 6,13 üzerine takmak için stabil ECM micropatterns yapmak için özel bir atıl atmosfer ve nem koşulları ihtiyacı. Her micropatterning yönteminin en önemli husus çevreleyen bölgelere belirsiz hücre eki en aza indirirken yüzey modifikasyonu rejimi istenilen geometrik çözünürlükte hPSC yapışkanlı ECM desenleri üretebilir olup olmadığıdır.

Burada, hPSCs üzerinde takmak için önce yapışkan ECM desen nesil ek yüzey modifikasyon adımlar olmadan hPSC micropatterns oluşturmak için basit bir yöntem olarak şablon micropatterning kullandığını rapor etmiştir. Hücre şablonun içinden delikler fiziksel ECM kaplamalar ve daha sonra ekilmiş hPSCs içeren bir hücre kültür substrat üzerine sızdırmaz boyutu milimetre mikron olan ince bir zar, örneğin, polidimetilsiloksan (PDMS) tabakanın içerir. şablon desenlendirme fiziksel hPSC yatan ECM kaplı yüzeye doğrudan erişim ve ekleyebilirsiniz konumu frenleyici çalışır gibi, bu yöntem hPSC kültürleri destekleyen çeşitli yüzeylerde ile uyumludur. sadece requiremenT Şablon malzeme seçimi alt-tabaka ile bir tersinir bir yalıtım oluşturmak olabilir. Bu alt-tabakalar, geleneksel doku kültür polistiren (TCPS) 17, ligand konjuge tabakaları 18, hem de ayarlanabilir sertlik elastomer tabakaları kapsar (örn., PDMS) 19. Bu yöntem, aynı zamanda, uygun bağlanma ve hPSCs farklılaşması için izin verilmesi için, vitronektin (veya VTN protein), laminin ve bazal membran matris (örneğin, Matrigel ve Geltrax) gibi farklı ECM'nin kaplama sağlar. Belirli hPSC hattı Bu nedenle, optimum aktarım için ECM alt-tabaka konfigürasyonları uygun hücre-matris yapışma, hayatta kalma ve farklılaşması için micropatterning şablona. Son zamanlarda, benzer bir yöntem, aynı zamanda, poli (metil metakrilat) ile micropatterning HESC (PMMA), mikro-Şablon dizileri 16 hepatik farklılaşma doğrudan bildirilmiştir.

Hücre şablonlar, farklı malzemelerden imal edilebilir araya dahilALS 20,21, poli (p-ksilen) polimerler 22,23, PMMA 16 ve en çok PDMS 24-28. Silisyum ve poli (p-ksilen) polimerler şablonlar biyolojik kullanıcılara kendi sınırları erişilebilirlik özel ekipman 20-23 ile geçiş delikleri doğrudan aşındırma gerektirir. PDMS şablonlar tipik olarak 3 um 2,000 um 11,26-29 aralığındadır istenen bir özellik boyutuna bağlı olarak farklı yöntemler ile imal edilebilir. Küçük özellikler istenirse, ince stenciling levhalar micropatterns 28 kabartmaları içeren bir microfabricated silikon şablona basın kalıplama PDMS pre-polimer üretilebilir. Özellikler> 1,000 mikron, bir CO2 lazer kesici doğrudan şablon imalat sırasında önceden döküm PDMS kağıda desenleri kesmek için kolay ve düşük maliyetli bir yöntem sağlar. PDMS şablon geri dönüşümlü da yeterli tutarlılık ile deneylerini yapmak için onları maliyet-etkin hale getirir.

Burada lazer kesim tarafından 1000 mikron özelliklere sahip bir PDMS şablonun imalat ve HESC micropatterns üretimi için detaylı metodoloji sunuyoruz. Bu HESC micropatterns integrinin ölçüde modüle etmek için kullanıldı ve hücre yapışmasının mekansal polarizasyon hücresi kaderi heterojen 10 sonuçlanan araştırmak üzere E-kadherin uyumlu bir HESC koloni içinde yapışıklıklar aracılı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Bu protokol PDMS şablon kullanarak HESC hattının lazer kesim ve micropatterning, H9 tarafından 1000 mikron desenleri ile PDMS şablonun yapımını anlatmaktadır.

1. Tasarım ve micropatterning için PDMS şablonun Fabrikasyon

  1. İstenilen geometri ve boyut (örneğin, 1,000 mikron daireler) ve bilgisayar destekli tasarım yazılımı 10 kullanarak şablon conta geçiş delikleri ile stenciling sayfasını tasarlayın.
  2. 120-150 mikron ve kalın polidimetilsiloksan (PDMS) yaprak sırasıyla CO2 lazer kesici 10 kullanılarak 2 mm stenciling levha ve conta Lazerle kesilmiş.
  3. micropatterning PDMS şablonu elde etmek için 3-4 saat boyunca 60 ° C'de, sıvı sertleşmemiş PDMS ve fırında kullanarak PDMS şablonundaki sayfası ile PDMS conta Bond.
  4. Kullanmadan önce, bir fırın içinde, 30 dakika ve kurutma 120 ° C de otoklavlama PDMS şablon sterilize edin.

2. hESC AnaBakým

  1. Kültür HESC 37 ° C'de 1 x HESC nitelikli bazal membran matrisi kaplanmış hücre kültür plakaları bir besleme içermeyen muhafaza edici ortam içinde hatları ve% 5 CO2.
  2. Geçiş yaklaşık olarak% 70 dispaz tedavisi ile 37 ° C 'de 3 dakika inkübasyon ile birleşik ve mekanik 100-200 um kümelerine HESC koloniler ayrışan olan HESC. 6 bölme: 1 oranındaki bazal membran matris kaplı doku kültür polistiren üzerinde büyüme alanı 9.6 cm2 başına 30-50 kümeleri yoğunluğunda HESC topaklar Plate.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri 3. Stencil micropatterning

  1. Desenlendirme hücre önce Hazırlık
    1. Petri kabı içine ultra saf su içinde 700 ul% 70 analitik dereceli etanol dağıtım ve üstüne şablon koyarak bir 60 mm Petri kabı üzerine PDMS şablon Seal.
    2. t gecede izin biyogüvenlik kabini içinde Petri kabı yerleştirinO kuru etanol.
    3. hiçbir kabarcık şablon Petri kabı ile iyi bir sızdırmazlık oluşturur emin olmak için şablon altında bulunmaktadır edin. Bu ECM kaplama solüsyonu sızıntılarını önler. hücre tohumlama için hazır olana kadar steril koşullar altında Petri kabı ve mağaza kapatılmalıdır.
    4. Analiz Sertifikalarını göre hESC nitelikli bazal membran matris hacimde hazırlayın. Besin Karışımı, F-12 (DMEM / F12) üreticinin ürün sayfasına göre: her bir sıvı bölüntü verimleri 1 Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı içinde, 25 ml içinde seyreltilmiş x HESC nitelikli bazal membran matrisi çözeltisi emin olun.
    5. 1.5 × hESC nitelikli bazal membran matris çözümü yapmak için DMEM / F12 16.7 ml hESC nitelikli bazal membran matris bir kısım ekleyerek ECM kaplama çözeltisi hazırlayın. jelleşme önlemek için buz üzerinde tüm ECM kaplama çözümü tutun.
    6. 10 uM ROCK inhibitörü (Y27632) ile HESC bakım ortamı Supplement.
  2. stenciled alt-tabaka üzerine ECM kaplama
    1. 90 saniye boyunca 100 plazma 2 WO Petri kabı davranın. sterilite sağlamak için, yalnızca öncesinde plazma işlemine plazma odasının içine Petri kabı kapağını açın ve hızlı bir şekilde tedavinin tamamlanmasından sonra Petri kabı arka kapak. Bu yüzey ıslanmasını kolaylaştırır ve ECM kaplama çözeltisinin ilave edilmesi sırasında geçiş delikleri mikrodesenlerle hava kabarcığı oluşmasını engeller.
    2. Bütün şablon kapsayacak şekilde 1.5 × hESC nitelikli bazal membran matris solüsyon 450 ul ekleyin. Örneğin Parafilm olarak öz kapatılabilen film ile Petri Seal kurumasını önlemek için bir çözüm ve kullanımdan önce 37 ° C de 5 saat inkübe edilir.
  3. Stenciled alt tabaka üzerine Tohum HESC
    1. Yuvarlak, sıkı Packe tipik HESC morfolojisi kaybını gösteren farklılaşmış hücre alanları belirlemek için 6-çukurlu plaka içindeki HESC koloniler incelenmesi (örneğin, kayıpd epitel morfoloji, belirgin nükleol yüksek çekirdek / sitoplazma oranı). Bir vakum aspiratörü kullanarak farklı bölgeleri çıkarın.
    2. oyuk başına 2 ml DMEM / F12 ile iki kez yıkanır.
    3. 6 oyuklu plakanın her bir kuyucuğu, örneğin Accutase olarak sindirim enzimleri, 1 ml ilave edilir ve 8 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. alt tabakadan tüm kolonileri ayırmak için hafifçe plaka dokunun.
    4. Sindirim enzimlerinin 1 ml başına DMEM / F12 içinde en az 4 ml de her durulama ve 15 ml konik tüp içine hücre süspansiyonu toplanır.
    5. Oda sıcaklığında 3 dakika 200 x g'da hücre süspansiyonu santrifüj.
    6. Aspire süpernatant kaldırmak ve hücrelerin yeniden askıya ROCK inhibitörü (Rocki) ile desteklenmiş HESC bakım ortamı 400 ul ekleyin. Hücre süspansiyonu yukarı Pipet ve yavaşça aşağı 3 kez tek hücre içine kümeleri kırmak için.
    7. tek bir hücre süspansiyonu iyice karıştırın ve DMEM / F12 (1:20 seyreltme) 190 ul içine hücre örneklerinin 10 ul sulandırmak. Bir hemocytome kullanınter stok hücre süspansiyonu hücre yoğunluğu belirlemek için.
    8. Belirli bir şablon için gerekli olan hücre tohum yoğunluğu hesaplanır.
      Not: Örneğin, deneysel olarak tek hücreler konfluent tek tabaka yaklaşık / mm2 4,444 hücreleri elde etmek için, hücre tohum yoğunluğu saptadık. Bu durumda, bir 450 mm 2 alanına ve 400 ul tohumlama hacmi ile bir şablon 2.000.000 hücre / 400 ul bir yoğunlukta olduğu, bir hücre süspansiyonu gerektirecektir.
    9. Rocki ile desteklenmiş HESC kültür ortamı ile gerekli tohumlama yoğunluğu (adım 3.3.8 NOT bakınız) stok hücre süspansiyonu seyreltilir.
    10. Her şablonun içine hücrelerin gerekli sayıda içeren hücre süspansiyonu belirlenen hacim ekleme ve hücreler yerleşmek için izin oda sıcaklığında 5 dakika boyunca kaputu rahatsız Petri kabı bırakın.
    11. inkübatör içine Petri kabı aktarın ve hücre yapışmasını sağlamak üzere 1 saat boyunca inkübe edilir. sırasında Petri kabı seviyede tutmak için özenHücreler şablonun bir tek tabakalı olarak kalması, böylece süreci aktarın.
  4. Şablon çıkarma ve desensiz substratın pasivasyon
    1. hücrelerin düzgün alttaki tabaka üzerine takılı olup olmadığını kontrol etmek için mikroskop altında Petri kabı inceleyin.
    2. şablonun hücre süspansiyonu uzak aspire.
    3. şablon çevreleyen alana DMEM / F12 içinde% 0.5 Hücre kültürü uyumlu iyonik olmayan yüzey aktif madde 2 ml / tabak ekleyin.
    4. yavaşça şablon kalkmasına otoklavlanmış forseps bir çift kullanın. Şablon kurumasını hücreleri önlemek için sıyrılır gibi iyonik olmayan yüzey aktif madde çözeltisi etrafında dönme. Görme Petri kabındaki micropatterned hücreleri gözlemlemek.
    5. 37 ° C'de 10 dakika süre ile% 0.5, iyonik olmayan yüzey aktif madde DMEM / F12 çözeltisi içinde micropatterned hücreleri inkübe edin.
    6. uzaklıkta aspire iyonik olmayan yüzey aktif madde DMEM / F12 çözeltisi. 2 ml / DMEM / F12 çanak ile 3 kere yıkayın.
    7. hESC 2 ml / tabak eklemebakım ortamı Rocki ile takviye edilmiş ve bir gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
    8. Gece boyunca inkübasyondan sonra, Rocki ile takviye aspirat HESC bakım ortamı, DMEM / F12 ile bir kez yıkanır ve 2 ml / 100 ng / ml Aktivin, 25 ng / ml BMP4 ve 10 ng / ml FGF2'nin ile takviye farklılaştırma ortamının çanak ekleyerek mesoendoderm farklılaşmasını teşvik .
    9. Faz kontrast görüntüleme kullanılarak micropatterns değerlendirin ve daha önce 8 açıklandığı gibi, her model için ortalama Brachyury (T) yoğunluk profilleri hesaplamak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu yazıda 1000 mikron özellikleri üretmek için bir lazer kesici kullanarak bir hücre şablonun imalat açıklar. şablon 2 bölümden oluşmaktadır: ince stenciling sayfası geçiş delikleri mikrodesenlerle içeren (kalın yaklaşık 100-200 mikron) ve ECM kaplama çözeltisi veya hücre süspansiyonu içeren bir PDMS conta. Burada, 127 um ve 2 mm kalınlığında, ticari olarak temin PDMS sayfaları, sırasıyla delikli kalıpla baskı tabakası ve conta olarak kullanılmıştır...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Micropatterning şablon imalatı

Elek micropatterning niş aracılı farklılaşma model oluşturmanın araştırmak için hPSC micropatterns oluşturmak için ideal bir yöntem sağlar. Böyle microcontact baskı ve photopatterning gibi diğer micropatterning teknikleri üzerinde şablon desen önemli avantajı, yüzey modifikasyonu gerektirmez ve geleneksel TCPS yüzeylerde uygulanabilir olmasıdır. Bu nedenle, farklı hPSC hatları için optimize edilmiş kült?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Teşekkürler

Bu çalışma ödeneği başlatın NUS tarafından (R-397-000-192-133) ve ETPL Gap Fonu (R-397-000-198-592) desteklenir. GS NUS Araştırma bilginidir. Yazarlar, hücre micropatterning onu teknik destek için Dr. Jiangwa Xing teşekkür etmek istiyorum.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
 2 mm thick PDMS sheetSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.005Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheetSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.040Used to form stencil 
60 mm Petri dishNunc Nunclon Delta150326Substrate for micropatterning
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingaporeSCR005Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin  R&D Systems, Singapore338-AC-010Growth factor for H9 differentiation
BMP4 R&D Systems, Singapore338-BP-010Growth factor for H9 differentiation
Plasma system Femto Science, KoreaCUTE-MPFor plasma oxidation of stencil
DispaseStemCell™ Technologies, Singapore7923Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12GIBCO, USA11330032Basal medium for H9 cells
FGF2R&D Systems, Singapore233–FB–025Growth factor for H9 differentiation
H9 cell lineWiCell Research Institute, Inc., USAWA09Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrixMatrigel, BD Biosciences, Singapore354277Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscopeLeica Microsystems, SingaporeDMi1For capturing bright-field images
Laser cutterEpilog Helix 24 Laser SystemUsed to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium StemCell™ Technologies, Singapore5850Maintainence medium for H9 cells
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapore688000Maintains H9 cells as single cells 
STEMdiff™ APEL™ medium StemCell™ Technologies, Singapore5210Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate filmSureMark SingaporeSQ-6633Used to form stencil 
Cell culture compatible non-ionic surfactantPluronic acid F-127, Sigma, SingaporeP2443Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates

Referanslar

  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  3. Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  4. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
  5. Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
  6. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  7. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  8. Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
  9. Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  10. Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
  11. Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038(2015).
  12. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  13. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  14. Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
  15. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
  16. Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
  17. Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
  18. Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
  19. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
  20. Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
  21. Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
  22. Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
  23. Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
  24. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
  25. Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
  26. Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
  27. Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
  28. Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784(2014).
  29. Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
  30. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499(2012).
  31. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
  32. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
  33. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
  34. Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 112nsan pluripotent k k h crelerh cre micropatterningablonfarkl la ma kadermekansal organizasyondoku desenlemeembriyonik geli im

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır