人类多能干细胞的模板微图案用于探测分化命运的空间组织

摘要

人多能干细胞（hPSCs）具有分化和自我组织成不同的组织型态的内在能力;尽管这需要空间环境梯度的表现。我们提出模版图案化作为一种​​简单而可靠的方法，以产生生物化学和机械梯度用于控制HPSC分化模式。

摘要

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

引言

人多能干细胞（hPSCs），包括胚胎干细胞（胚胎干细胞）和诱导多能干细胞（人iPS细胞），被广泛利用于再生医学以及正常和病变器官的实验模型，因为它们的分化潜能的进入所有的细胞谱系三种胚层^1,2。 hPSCs分化命运是可以调节通过物理线索^3-5介导的自分泌或旁分泌信号¹以及机械传导过程当地的环境因素非常敏感。细胞微图案包括一组已发展到在空间上组织的细胞群的几何形状和位置作为平均值来控制本地细胞微环境，如细 ​​胞-细胞相互作用⁶和细胞-基质相互作用³的技术。在hPSCs的背景下，细胞微已被用来获得显著的认识到如何利基依赖耳鼻喉科自分泌信号调节胚胎干细胞多能性分化的第⁷和组织成早期胚胎分化的模式^6。二维和三维微图案hPSCs已被用来控制多细胞型态，这反过来又影响分化决定成三种胚层^8,9的菌落尺寸。我们采用多HPSC微图案来调制HPSC菌落内的细胞-细胞和细胞-基质相互作用的程度来探测整联E-钙粘蛋白的串扰可以如何产生细胞命运异质^10。从朝hPSCs作为实验模型用于发育疾病^11，要研究的组织或器官发育过程中的生长因子和激素的影响药毒性筛选的多细胞微图案的应用上述报告打开新的途径的示范，并解开的形成组织模式。

细胞micropatter有无数宁技术已被开发作为由Falconnet 等审查。人 ^12，但只有一小部分，如微接触印刷^7,8,13，微孔文化^14,15，光图案⁶和microstencils ¹⁶已成功地实施hPSCs。与缩微hPSCs的挑战在于他们的脆弱性和具体的细胞外基质（ECM）和生长条件的细胞附着和生存的严格的要求。对于2D HPSC模式，微接触印刷是最常用的方法，以产生对组织培养和玻璃基板¹³ HPSC微图案之一。该方法可用于在HPSC培养，包括层粘连蛋白和基底膜基质，如基质胶中使用图案共同的ECM。然而，它通常需要用聚-D-赖氨酸辅助的两步涂层的方法，并且需要特定的惰性大气和湿度条件下，使稳定的ECM微图案为hPSCs到^6,13- ​​附加。每个图案化方法的首要考虑因素是表面修饰制度是否能够产生在所需的几何分辨率HPSC粘性ECM模式，同时尽量减少非特异性的细胞附着到周边地区。

在这里，我们报告的模板使用缩微作为一种简单的方法来产生HPSC微图案无粘结ECM模式产生之前的其他表面改性步骤hPSCs附加上。小区模版包括薄膜， 例如，聚二甲基硅氧烷（PDMS）片材，具有微米到毫米的通孔密封到一个细胞培养基材的物理上包含ECM的涂料，并随后接种hPSCs大小。作为模版图案形成工程通过物理约束，其中HPSC可以访问和连接直接到下面的ECM涂覆的衬底的位置，该方法是与能够支持HPSC培养各种基材相容。唯一requirement是该模版材料的选择可以形成与基材的可逆密封。这些底物包括常规组织培养聚苯乙烯^{（TCPS）17，}配体缀合的基片^18，以及与可调刚性的弹性体基底（ 例如 ^{，PDMS）19。}这种方法还允许不同的ECM的涂层，例如玻连蛋白（或VTN蛋白），层粘连蛋白和基底膜基质（ 例如 ，基质胶和Geltrax），以允许适当附着和hPSCs的分化。为特定HPSC线。因此，我们可以传送优化的ECM-基板配置到模版图案化以获得最佳的细胞 - 基质粘附，存活和分化。最近，一个类似的方法也有报道直接通过使用聚甲基丙烯酸甲酯微图案的hESCs（PMMA）微模版阵列¹⁶肝分化。

细胞的模板可以由不同的材料制成，包括满足ALS ^20,21，聚（对苯二甲基）聚合物^22,23，聚甲基丙烯酸甲酯¹⁶和最常见的是，PDMS ^24-28。硅和聚（对-亚二甲苯）聚合物模具需要具有专门的设备^20-23，这限制了它们的可访问生物用户通孔的直接蚀刻。 PDMS模具可以通过根据所需的特征尺寸，其通常从3微米至2,000微米^11,26-29范围不同的方法来制造。如果小的功能需要，薄板材制版可通过冲压成型PDMS在包含微图案²⁸的浮雕精细加工硅模板预聚物生产。为特征> 1000微米，CO ₂激光切割器提供了一种简单和低成本的方法模版制造期间直接切上的预铸的PDMS片的图案。 PDMS模具的可回收也使得它们具有成本效益的，进行了一系列的具有足够一致性的实验。

在这里，我们介绍的详细方法为PDMS模板由激光切割制造1000微米的特性和人类胚胎干细胞微图案的产生。这些胚胎干细胞微图案被用于调节整联的程度和E-cadherin介导的凝聚力的hESC集落内粘连以便调查细胞粘附的空间偏振如何导致细胞命运异质^10。

研究方案

备注:本协议描述PDMS模具的制造与1000微米的图案通过激光切割和图案化的人类胚胎干细胞系，H9使用PDMS模板。

1.设计和微图案PDMS模板的制作

1. 设计具有所需的几何形状和尺寸（ 例如 ，1000微米圈）和使用计算机辅助设计软件¹⁰模版垫片的贯通孔的制版薄板。
2. 激光切割的120-150微米和2毫米厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片分别使用CO ₂激光切割器¹⁰的制版薄板和垫片。
3. 粘结的PDMS垫片用液体未固化的PDMS和烘烤的PDMS蜡纸在60℃下3-4小时，以获得用于微图案的PDMS模具。
4. 消毒通过高压与PDMS模版，在120℃下，在使用前的烘箱30分钟并干燥。

2.人类胚胎干细胞主tenance

1. 培养的hESC细胞系在无饲养维持培养基上1×的hESC合格基底膜基质涂覆的细胞培养板在37℃和5％的CO _2。
2. 通道的时候都大致由3分钟温育70％汇合，在37℃用分散酶处理和机械解离胚胎干细胞集落入100-200微米的团块的人类胚胎干细胞。 6分光比:30-50团块每生长面积9.6 ^平方厘米的基底膜基质涂层组织培养聚苯乙烯在1密度板材的人类胚胎干细胞团块。

3.人类胚胎干细胞的模具微图案

1. 准备细胞图案前
   1. 通过分配在超纯水700μl的70％的分析纯的乙醇放入培养皿，并把模版上顶部密封一个PDMS模版到60毫米的培养皿。
   2. 将生物安全柜内培养皿一夜之间令t他乙醇干燥。
   3. 检查模板下方存在无气泡，保证了模具形成具有培养皿良好的密封。这可以防止的ECM涂覆溶液泄漏。密封在无菌条件下在培养皿和存储直到它准备好细胞接种。
   4. 据分析证书准备的hESC合格基底膜基质的等分。确保每个等分试样产率1×的hESC合格基底膜基质溶液在25ml的Dulbecco改良Eagle培养基中稀释时:营养混合物F-12（DMEM / F12），根据制造商的产品片。
   5. 通过加入的hESC合格基底膜基质的一种分装成16.7毫升的DMEM / F12，以使1.5×的hESC合格基底膜基质溶液制备的ECM涂覆溶液。保持冰的所有ECM涂层解决方案，以防止凝胶化。
   6. 人类胚胎干细胞的补充维持培养基用10μMROCK抑制剂（Y27632）。
2. 的钢印基板上涂ECM
   1. 对待培养皿100 WO ₂等离子90秒。以确保无菌性，只打开等离子体处理之前的等离子体室内部的培养皿盖，并迅速覆盖背面治疗结束后的培养皿。这有利于表面润湿，并防止另外的ECM涂布溶液过程中的通孔的微图案形成气泡。
   2. 添加450微升的1.5×的hESC合格基底膜基质溶液覆盖整个模具。密封培养皿具有自密封膜，如石蜡膜，以防止该溶液干涸，并在使用前于37℃孵育5小时。
3. 人类胚胎干细胞播种到钢印基板
   1. 检查在6孔板的hESC集落，以确定表示典型的hESC形态损失的分化的细胞区域（ 例如，圆形的，紧密PACKE的损失ð上皮形态，高核/质比核仁明显）。除去使用真空吸气器有区别的区域。
   2. 以每孔2mL的DMEM / F12洗涤两次。
   3. 加入1 ml消化酶，诸如的Accutase的，每6孔板的孔中并在37℃孵育8分钟。轻轻敲击板从基材分离所有殖民地。
   4. 与至少4毫升每毫升消化酶的DMEM / F12的冲洗每个孔，并收集细胞悬液分成15毫升锥形管中。
   5. 离心在200×g下将细胞悬浮液在室温下3分钟。
   6. 抽吸除去上清，加入400微升补充有ROCK抑制剂（ROCKi）hESC细胞维持培养基来重新悬浮细胞。吸取细胞悬液上下轻轻3次打破团块成单个细胞。
   7. 混合单细胞悬液好，稀释10微升细胞样本为190微升DMEM / F12（1:20稀释）的。使用hemocytome之三，以确定在股票细胞悬浮液的细胞密度。
   8. 计算对于给定的模版所需的细胞接种密度。
      注意:例如，我们已通过实验确定的细胞接种密度，以获得单细胞的汇合单层是约4,444个/ mm ^2。因此，随着为450mm ²的面积和400微升的接种体积模版将需要一个细胞悬浮液以200万个细胞/ 400微升的密度。
   9. 稀释股票细胞悬液到所需的接种密度（见步骤3.3.8注）补充了人类胚胎干细胞ROCKi培养基。
   10. 添加包含所需数量的细胞到每个模版细胞悬浮液的指定体积和离开的培养皿在室温下在通风橱中不受干扰5分钟以使细胞沉淀。
   11. 转移培养皿进入培养箱，孵育1小时，以允许细胞附着。请注意在保持培养皿水平转移过程中，使细胞保持在模板单层。
4. 模板拆除和无图案基板的钝化
   1. 在显微镜下检查培养皿，以检查是否细胞被适当地附着在下面的衬底。
   2. 从模具吸走细胞悬液。
   3. 加的在DMEM / F12 0.5％细胞培养物相容的非离子表面活性剂为2ml /皿周围模版的区域。
   4. 使用一对蒸压镊子轻轻撕下模板。漩涡非离子表面活性剂溶液周围的模版被剥离，以防止细胞干燥。目视观察微图案化细胞在培养皿。
   5. 孵育微图案化细胞在0.5％的非离子表面活性剂的DMEM / F12溶液在37℃10分钟。
   6. 抽吸掉非离子表面活性剂的DMEM / F12溶液。用2ml / DMEM / F12的碟洗3次。
   7. 人类胚胎干细胞加入2毫升/皿维持培养基补充有ROCKi并在37℃下孵育过夜。
   8. 过夜孵育后，补充有ROCKi抽吸人类胚胎干细胞维持培养基，用DMEM / F12洗涤一次，并加入2毫升/分化培养基的培养皿补充有100纳克/毫升活化素，25纳克/毫升BMP4和10ng / ml的FGF2诱导mesoendoderm分化。
   9. 评估使用相衬成像的微图案以及如前面^8中所述计算平均的Brachyury（T）的强度分布为每个图案。

结果

在本文中，我们通过使用激光切割机产生1000微米的特征描述模板电池的制造。模版被由两部分组成:一薄镂花片含有通孔的微图案（大约100-200微米厚），以及将PDMS垫片以包含ECM的包衣溶液或细胞悬浮液。这里，127微米和2毫米厚的市售的PDMS片分别用作制版片和垫圈。制备可控厚度的PDMS片，例如旋涂等方法，也可用于制造的部件。两种成分通过使用液态未固化的PDMS预聚物?...

讨论

微图案模板的制作

模板缩微提供生成HPSC微图案调查利基介导的分化图案的理想方法。比其他图案化技术，例如微接触印刷和光图案模版图案形成的主要优点是，它不需要表面改性，可在常规的TCPS衬底来实现。因此，对于不同的HPSC线进行了优化培养基和ECM涂料可以很容易地转移到模版图案化。

有有助于良好微图案的产生的细胞模版的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm Petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates