סטנסיל micropatterning של תאי גזע האנושי pluripotent עבור גשוש הארגון המרחבי של גורל הבידול

Summary

יש תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) את היכולת הפנימית להבדיל עצמי לארגן לתוך דפוסי רקמה ייחודיים; אם כי זה דורש ההצגה הדרגתית סביבה המרחבית. אנו מציגים סטנסיל micropatterning כשיטה פשוט חזקה כדי ליצור הדרגתי ביוכימיות מכאניות לשליטת דפוסי בידול hPSC.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introduction

תאי גזע פלוריפוטנטיים האדם (hPSCs), כולל תאי גזע עובריים (hESCs) ותאי גזע מושרים (hiPSCs), מנוצלים נרחב ברפואה רגנרטיבית וכן מודלים ניסיוניים של organogenesis בריאים וחולים בגלל פוטנציאל הבידול שלהם לתוך שושלות תאים של כל שלוש שכבות ניבטות ^1,2. גורלן הבידול של hPSCs רגיש מאוד גורמים סביבתיים מקומיים שיכול לווסת autocrine או paracrine איתות ¹ כמו גם תהליכי mechanotransduction בתיווך רמזים פיסיים ^3-5. Micropatterning הסלולרי מקיף קבוצה של טכניקות פותחו כדי לארגן את הגיאומטריה ומיקום מרחבית של אוכלוסיית תא כאמצעי לשלוט microenvironment הסלולר המקומי, כגון תאי תאי אינטראקציות ⁶ ואינטראקציות-מטריקס ³ תאים. בהקשר של hPSCs, תא micropatterning הועסק כדי לקבל תובנות משמעותיות לתוך איך נישה-תלוייםאיתות autocrine אף אוזן גרון מודולציה החלטות בידול-pluripotency hESC ⁷ וארגון לתוך דפוסי הבידול עובריים מוקדם ^6. HPSCs micropatterned 2D and 3D שמש לשלוט בגודל המושבה של דפוסים רבים-תאיים, אשר בתורו השפיעו החלטות בידול לשלוש השכבות ניבטו ^8,9. יש לנו עובדים micropatterns hPSC רב-תאיים לווסת את מידת תאים תאים ואינטראקציות תא-מטריקס בתוך המושבה hPSC לחקור כיצד integrin-E-cadherin crosstalk יכול להצמיח ההטרוגניות גורל התא ^10. ההפגנות מן האפיקים החדשים הפתוחים דוחות מעל לקראת היישום של micropatterns הרב-תאיים של hPSCs כמודלים ניסיוניים להקרנת תרופה רעילה למחלות התפתחותיות ^11, כדי לחקור את ההשפעה של גורמי גדילה והורמונים במהלך רקמות או התפתחות איברים, וכדי לפתור את ההיווצרות דפוסי רקמה.

מספר עצום של תאים micropatterטכניקות נינג פותחו כפי שנסקרו על ידי Falconnet et. al. ¹² אבל רק קומץ, כגון מגע מיקרו הדפסת ^7,8,13, תרבות microwell ^14,15, photopatterning ⁶ ו microstencils ¹⁶ יושמו בהצלחה עם hPSCs. האתגר עם hPSCs micropatterning טמון פגיעותם ודרישה מחמירה של מטריצות תאיות ספציפיות (ECM) ותנאי צמיחה עבור התקשרות לתא והישרדות. דפוסי 2D hPSC, הדפסת מייקרו מגע היא אחת השיטות הנפוצות ביותר כדי ליצור micropatterns hPSC על מצעי תרבות זכוכית רקמות ^13. השיטה יכולה לשמש כדי ECM משותף דפוס המשמש בתרבות hPSC, לרבות מטריצות הממברנה laminin ומרתף, כגון Matrigel. עם זאת, בדרך כלל זה דורש תהליך ציפוי שני שלבים שנעזר Poly-D- ליזין, ועליו תנאים אטמוספריים ולחות אינרטי ספציפיים לעשות micropatterns ECM יציב hPSCs לצרף על ^6,13. התמורה ובראשונה של כל שיטת micropatterning היא האם משטר שינוי פני השטח יכול ליצור דפוסי ECM hPSC-דבקים ברזולוציה הגיאומטרית הרצויה תוך מזעור מצורף תא נוקב אל בסביבותיה.

כאן אנו מדווחים על שימוש סטנסיל micropatterning כשיטה פשוטה ליצור micropatterns hPSC ללא צעדים שינוי פני השטח נוספים לפני דור דפוסי ECM דבק hPSCs לצרף על. סטנסיל התא מורכב של קרום דק, למשל, polydimethylsiloxane (PDMS) גיליון, עם מיקרון מילימטר גודל דרך נקבי חתום על מצע תרבית תאים להכיל ציפוי ECM פיזית ובהמשך hPSCs הזורע. כמו דפוסי סטנסיל עובדים פיזית ירסנו את המיקום שבו hPSC יכול לגשת ולצרף ישירות למצע ECM המצופה הבסיסי, שיטה זו היא תואמת עם מצעים שונים שיכול לתמוך תרבויות hPSC. Requiremen רקt הוא כי הבחירה של חומר סטנסיל יכולה ליצור חותם הפיך עם המצע. מצעים אלה כוללים קלקר בתרבית רקמה קונבנציונלי (TCPS) ^17, מצעי מצומדות ליגנד ^18, כמו גם מצעים אלסטומרי עם קשיחות מתכוננת (למשל., PDMS) ^19. שיטה זו גם מאפשרת ציפוי של ECM שונים, כגון vitronectin (או חלבון VTN), laminin ומטריצות קרום במרתף (למשל, Matrigel ו Geltrax) כדי לאפשר התקשרות נאותה והבחנה של hPSCs. לכן, אנחנו יכולים להעביר אופטימיזציה תצורות ECM-מצע עבור קו hPSC ספציפי שבלונת micropatterning הידבקות, הישרדות התמיינות תאים-מטריקס אופטימלית. לאחרונה, בשיטה דומה גם דווחה לכוון בידול הכבד על ידי hESCs micropatterning באמצעות פולי (methacrylate מתיל) (PMMA) מערכים-סטנסיל מיקרו ^16.

סטנסילים ניידים יכולים להיות מפוברקים מחומרים שונים, לרבות נפגשו als ^20,21, פולי (p-xylylene) פולימרים ^22,23, PMMA ¹⁶ והכי נפוץ, PDMS ^24-28. סיליקון פולי (p-xylylene) סטנסילים פולימרים דורשים תחריט הישיר של החורים דרך עם ציוד מיוחד ^20-23, אשר מגביל הנגישות שלהם למשתמשים ביולוגיים. סטנסילים PDMS יכול להיות מפוברק על ידי שיטות שונות בהתאם לגודל המאפיין הרצוי, אשר בדרך כלל נע בין 3 מיקרומטר 2,000 מיקרומטר ^11,26-29. אם תכונות קטנות הן רצויות, גיליונות שכפולים רזה יכולים להיות מיוצרים על ידי דפוס עיתונות PDMS מראש פולימר על תבנית סיליקון microfabricated המכילה תבליטים של micropatterns ^28. עבור תכונות> 1,000 מיקרומטר, חותך ליזר CO ₂ מספק שיטת עלות קלה ונמוכה לחתוך את הדפוסים ישירות על גיליון מראש casted PDMS במהלך ייצור סטנסיל. המחזור של סטנסילים PDMS גם גורם להם חסכוני לבצע סדרה של ניסויים עם עקביות מספיק.

התחת = "jove_content"> כאן, אנו מציגים את המתודולוגיה מפורט על המצאה של סטנסיל PDMS עם 1,000 מיקרומטר תכונות ידי חיתוך לייזר דור micropatterns hESC. Micropatterns hESC אלה שימשו כדי לווסת את מידת integrin ו- E-cadherin בתיווך הידבקויות תוך מושבה hESC מלוכדת כדי לחקור כיצד הקיטוב המרחבי של הידבקות התא הביאה ההטרוגניות גורל התא ^10.

Protocol

הערה: פרוטוקול זה מתאר את הייצור של סטנסיל PDMS עם 1,000 מיקרומטר דפוסים ידי ליזר חיתוך micropatterning של קו hESC, H9 באמצעות שבלונת PDMS.

תכנון ייצור 1. של סטנסיל PDMS עבור micropatterning

1. לעצב את גיליון שכפול עם חורים דרך של גיאומטריה לגודל הרצוי (למשל, 1,000 מיקרומטר עיגולים) ואת אטם סטנסיל באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב ^10.
2. בחיתוך לייזר הגיליון שכפול אטם על 120-150 מיקרומטר ו -2 מ"מ polydimethylsiloxane עבה (PDMS) גליונות בהתאמה באמצעות ¹⁰ CO _2-חיתוך בלייזר.
3. איגרות החוב אטם PDMS עם הסדין סטנסיל PDMS באמצעות PDMS ואופים דפוקה נוזלי ב 60 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שעות כדי להשיג את השבלונה PDMS עבור micropatterning.
4. לעקר את הסטנסיל PDMS ידי מעוקר ב 120 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר ייבוש בתנור לפני השימוש.

2. hESCs ראשיtenance

1. תרבות קווי hESC בתווך ללא תחזוקה מזינה על 1 × קרום במרתף hESC מוסמך צלחות תרבית תאים מצופים מטריקס ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
2. מסדרון, hESCs כאשר הם כ 70% ומחוברים על ידי 3 דגירת דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם dispase טיפול מכאני מתנערים מושבות hESC לתוך 100-200 מיקרומטר גושים. פלייט גושים hESCs בצפיפות של 30-50 גושים לכל 9.6 ס"מ ² של אזור הגידול על קלקר בתרבית רקמה מצופה מטריצה ​​קרום במרתף בבית 1: יחס פיצול 6.

3. סטנסיל micropatterning של בתאי גזע עובריים אנושיים

1. הכנה לפני תא דפוסים
   1. חותם סטנסיל PDMS לצלחת פטרי 60 מ"מ על ידי מחלק 700 μl 70% אתנול כיתה אנליטיות מים ultrapure לתוך צלחת פטרי הצבת השבלונה על גבי.
   2. מניחים את צלחת פטרי בתוך ארון biosafety לילה לתת tהוא אתנול יבש.
   3. בדקו אין בועה שקיימת מתחת השבלונה על מנת להבטיח כי סטנסיל מהווה חותם טוב עם צלחת פטרי. הדבר מונע דליפות של פתרון ציפוי ECM. חותם את צלחת פטרי ולאחסן בתנאים סטריליים עד שהוא מוכן זריעת תאים.
   4. כן aliquots של מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך על פי תעודת הניתוח. ודא שכל תשואות aliquot 1 × פתרון מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך כאשר מדולל 25 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco: מזין תערובת F-12 (DMEM / F12) על פי גיליון מוצר של יצרן.
   5. הכן את הפתרון ציפוי ECM על ידי הוספת aliquot אחד מטריצה ​​קרום במרתף hESC מוסמך לתוך 16.7 מ"ל של DMEM / F12 כדי להפוך 1.5 × פתרון מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך. שמור את כל פתרון ציפוי ECM על קרח כדי למנוע gelation.
   6. מוסף בינוני תחזוקה hESC עם 10 מיקרומטר ROCK מעכב (Y27632).
2. ציפוי ECM על פני המצע סטנסיל
   1. פנקו את צלחת פטרי עם 100 WO ₂ פלזמה למשך 90 שניות. כדי להבטיח סטריליות, רק לפתוח את מכסת צלחת פטרי בתוך חדר הפלזמה לפני טיפול פלזמה, ובמהירות לכסות בחזרה צלחת פטרי לאחר השלמת טיפול. זה הופך לפשוט הרטבת שטח ומונע היווצרות בועת אוויר micropattern דרך חורה במהלך התוספת של פתרון ציפוי ECM.
   2. להוסיף 450 μl של 1.5 × פתרון מטריקס קרום במרתף hESC מוסמך לכסות את הסטנסיל כולו. חותם את צלחת פטרי עם סרט עצמי סגר, כגון Parafilm, כדי למנוע את הפתרון מההתייבשות, דגירה במשך 5 שעות ב 37 מעלות לפני השימוש.
3. HESCs מתזמן על גבי מצע סטנסיל
   1. בדוק מושבות hESC בצלחת 6 גם לזהות את אזורי תא הבדיל מראים פסד של מורפולוגיה hESC הטיפוסית (כמו, אובדן packe המעוגלת, בחוזקהמורפולוגיה אפיתל ד, יחס גרעין / הציטופלסמה גבוהה עם nucleoli בולט). הסר אזורים מובחנים באמצעות aspirator ואקום.
   2. שטפו פעמיים עם 2 מ"ל DMEM / F12 לכל טוב.
   3. הוסף 1 מ"ל של אנזימי עיכול, כגון Accutase, לכל גם צלחת 6 באר לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות. קש על הצלחת בעדינות כדי לנתק את כל המושבות מן המצע.
   4. יש לשטוף היטב עם כל 4 מ"ל לפחות של DMEM / F12 לכל 1 מ"ל של אנזימי עיכול לאסוף את ההשעיה התא לתוך 15 מ"ל צינור חרוטי.
   5. צנטריפוגה ההשעיה התא ב × 200 גרם במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
   6. לשאוב להסיר את supernatant ולהוסיף 400 μl של מדיום תחזוקה hESC השלימו עם מעכב ROCK (ROCKi) מחדש להשעות את התאים. פיפטה את תא השעיה ולמטה 3 פעמים בעדינות לשבור גושים לתוך תאים בודדים.
   7. מערבבים היטב ההשעיה תא בודד לדלל 10 μl של דגימות תאים לתוך 190 μl של DMEM / F12 (01:20 דילול). השתמש hemocytometer כדי לקבוע את צפיפות תאי השעית תא המניות.
   8. חשב את צפיפות זריעת תא הדרושה סטנסיל נתון.
      הערה: לדוגמה, אנו באופן ניסיוני קבענו את צפיפות תאי הזריעה להשיג בשכבה ומחוברת של תאים בודדים היא כ 4,444 תאים / מ"מ ^2. לפיכך, סטנסיל עם שטח של 450 מ"מ ² ונפחי זריעה של 400 μl ידרוש השעית תא להיות בצפיפות של 2 מיליון תאים / 400 μl.
   9. לדלל את ההשעיה תא המניות לצפיפות זריעת הנדרש (ראה הערה צעד 3.3.8) עם המדיום תרבות hESC בתוספת ROCKi.
   10. הוספת נפח מיועד של השעית תא המכיל את המספר הדרוש של תאים לתוך אחד סטנסיל ולהשאיר צלחת פטרי ללא הפרעת מכסה המנוע במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר כדי לאפשר לתאים להתיישב.
   11. מעביר את צלחת פטרי לתוך חממת דגירה במשך שעה 1 כדי לאפשר התקשרות לתא. תשמור על עצמך כדי לשמור על רמת צלחת פטרי במהלךלהעביר תהליך כך התאים נשארים כמו בשכבה ב השבלונה.
4. הרחקת פסיבציה סטנסיל של מצע unpatterned
   1. בדוק את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק אם התאים מחוברים כראוי על גבי המצע הבסיסי.
   2. לשאוב משם השעית תא מן השבלונה.
   3. הוסף 2 מ"ל / תבשיל של פעילי שטח בלתי יוניים תואם תרבית תאים 0.5% ב DMEM / F12 לאזור שמסביב השבלונה.
   4. השתמש זוג מלקחיים autoclaved להתקלף השבלונה בעדינות. מערבולת הפתרון הפעיל שטח בלתי יוני סביב כמו סטנסיל הוא קלף כדי למנוע את התאים מההתייבשות. מבחינה ויזואלית לבחון את תאי micropatterned בצלחת פטרי.
   5. דגירה-תאי micropatterned בתמיסת 0.5% שאינם יונית פעיל שטח-DMEM / F12 במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
   6. לשאוב משם הפתרון הלא יוניים פעילי שטח-DMEM / F12. לשטוף 3 פעמים עם 2 מ"ל / תבשיל של DMEM / F12.
   7. הוסף 2 מ"ל / תבשיל של hESCבינוני תחזוקה בתוספת ROCKi לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   8. לאחר הדגירה לילה, מדיום תחזוקה hESC לשאוב בתוספת ROCKi, לשטוף פעם אחת עם DMEM / F12 ו להשרות התמיינות mesoendoderm על ידי הוספת 2 מ"ל / תבשיל של מדיום בידול השלימו עם 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP4 ו -10 ng / FGF2 מ"ל .
   9. להעריך את micropatterns באמצעות הדמיה לעומת שלב ולחשב את פרופילי עצמה הממוצעים Brachyury (T) עבור כל תבנית כפי שתואר לעיל ^8.

תוצאות

במאמר זה נתאר את ייצור של סטנסיל התא באמצעות מכשיר חיתוך בלייזר כדי ליצור 1,000 מיקרומטר תכונות. סטנסיל הורכבה 2 חלקים: סדין שכפול דק (כ 100-200 מיקרומטר עבה) המכיל את micropattern דרך חורים, ואת אטם PDMS להכיל פתרון ציפוי ECM או השעית תא. הנה, 127 מיקרומטר ו -2 מ"מ עוב?...

Discussion

המצאה של סטנסילים micropatterning

micropatterning סטנסיל מספק שיטה אידיאלית ליצור hPSC micropatterns על חקירת דפוסי בידול בתיווך נישה. היתרון העיקרי של דפוסים סטנסיל על פני שיטות micropatterning אחרות, כגון הדפסת microcontact ו photopatterning, הוא שהיא אינה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.005	Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheet	Specialty Silicone Products Inc., USA	SSPM823-.040	Used to form stencil
60 mm Petri dish	Nunc Nunclon Delta	150326	Substrate for micropatterning
Accutase	Accutase, Merck Millipore, Singapore	SCR005	Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin	R&D Systems, Singapore	338-AC-010	Growth factor for H9 differentiation
BMP4	R&D Systems, Singapore	338-BP-010	Growth factor for H9 differentiation
Plasma system	Femto Science, Korea	CUTE-MP	For plasma oxidation of stencil
Dispase	StemCell™ Technologies, Singapore	7923	Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12	GIBCO, USA	11330032	Basal medium for H9 cells
FGF2	R&D Systems, Singapore	233–FB–025	Growth factor for H9 differentiation
H9 cell line	WiCell Research Institute, Inc., USA	WA09	Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrix	Matrigel, BD Biosciences, Singapore	354277	Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscope	Leica Microsystems, Singapore	DMi1	For capturing bright-field images
Laser cutter	Epilog Helix 24 Laser System		Used to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5850	Maintainence medium for H9 cells
PDMS	SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA	3097358-1004	Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632	Calbiochem, Merck Millipore, Singapore	688000	Maintains H9 cells as single cells
STEMdiff™ APEL™ medium	StemCell™ Technologies, Singapore	5210	Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate film	SureMark Singapore	SQ-6633	Used to form stencil
Cell culture compatible non-ionic surfactant	Pluronic acid F-127, Sigma, Singapore	P2443	Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates