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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) hanno la capacità intrinseca di differenziare e di auto-organizzarsi in schemi dei tessuti distinti; anche se questo richiede la presentazione di gradienti spaziali ambientali. Presentiamo stencil micropatterning come metodo semplice e robusto per generare gradienti biochimici e meccanici per controllare modelli differenziazione HPSC.

Abstract

Human pluripotent stem cells (hPSCs), including embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells, have the intrinsic ability to differentiate into all three germ layers. This makes them an attractive cell source for regenerative medicine and experimental modeling of normal and diseased organogenesis. However, the differentiation of hPSCs in vitro is heterogeneous and spatially disordered. Cell micropatterning technologies potentially offer the means to spatially control stem cell microenvironments and organize the resultant differentiation fates. Micropatterning hPSCs needs to take into account the stringent requirements for hPSC survival and maintenance. Here, we describe stencil micropatterning as a method that is highly compatible with hPSCs. hPSC micropatterns are specified by the geometries of the cell stencil through-holes, which physically confine the locations where hPSCs can access and attach to the underlying extracellular matrix-coated substrate. Due to this mode of operation, there is greater flexibility to use substrates that can adequately support hPSCs as compared to other cell micropatterning methods. We also highlight critical steps for the successful generation of hPSC micropatterns. As an example, we demonstrate that stencil micropatterning of hPSCs can be used to modulate spatial polarization of cell-cell and cell-matrix adhesions, which in turn determines mesoendoderm differentiation patterns. This simple and robust method to micropattern hPSCs widens the prospects of establishing experimental models to investigate tissue organization and patterning during early embryonic development.

Introduzione

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), comprese le cellule staminali embrionali (hESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSCs), sono ampiamente sfruttati in medicina rigenerativa, nonché la modellazione sperimentale di organogenesi normale e malati a causa del loro potenziale di differenziazione in linee cellulari di tutti tre strati germinali 1,2. I destini di differenziazione di hPSCs sono estremamente sensibili ai fattori ambientali locali in grado di modulare i processi meccanotrasduzione autocrini o paracrini segnalazione 1 e mediate da stimoli fisici 3-5. Cellulare micropatterning comprende un insieme di tecniche che sono state sviluppate per organizzare spazialmente la geometria e la posizione di una popolazione di cellule come un mezzo per controllare il microambiente cellulare locale, come le interazioni cellula-cellula 6 e interazioni cellula-matrice 3. Nel contesto di hPSCs, micropatterning cellulare è stato impiegato per ottenere informazioni importanti sul modo in cui nicchia dipendeent segnalazione autocrina modula hESC pluripotenza decisioni-differenziazione 7 e organizzazione in primi modelli di differenziazione embrionali 6. 2D e 3D hPSCs micropatterned sono stati utilizzati per controllare la dimensione delle colonie di modelli multicellulari, che a sua volta influenzato decisioni differenziazione nei tre strati germinali 8,9. Abbiamo impiegato multicellulari microdisegni HPSC di modulare la portata di cellula-cellula e cellula-matrice interazioni all'interno di una colonia HPSC per sondare come integrina-E-caderina crosstalk può dare origine a destino cellulare eterogeneità 10. Le manifestazioni delle suddette relazioni aprire nuove strade verso l'applicazione di microdisegni multicellulari di hPSCs come modelli sperimentali per lo screening tossicità dei farmaci per le malattie dello sviluppo 11, per studiare l'effetto di fattori di crescita e ormoni durante tessuti o lo sviluppo degli organi, e per svelare la formazione di modelli tessuti.

Una miriade di cellule micropattertecniche ning sono stati sviluppati come recensito da Falconnet et. al. 12, ma solo una manciata, come il micro-contatto stampa 7,8,13, cultura micropozzetti 14,15, photopatterning 6 e microstencils 16 sono state implementate con successo con hPSCs. La sfida con hPSCs micropatterning risiede nella loro vulnerabilità e un requisito stringente di matrici specifiche extracellulare (ECM) e condizioni di crescita per il fissaggio e la sopravvivenza cellulare. Per i modelli 2D HPSC, stampa micro-contatto è uno dei metodi più comuni per generare microdisegni HPSC per la cultura dei tessuti e del vetro substrati 13. Il metodo può essere utilizzato per modello ECM comune utilizzato in coltura HPSC, compresi laminina e membrana basale matrici, come Matrigel. Tuttavia, esso richiede in genere un processo di rivestimento in due fasi aiutati da poli-D-lisina, e ha bisogno di particolari condizioni atmosferiche e di umidità inerti per rendere microdisegni ECM stabili per hPSCs di allegare a 6,13. La più importante considerazione di ciascun metodo micropatterning è se il regime di modifica della superficie in grado di generare modelli di ECM HPSC-adesivo alla risoluzione geometrica desiderata, riducendo al minimo l'adesione cellulare non specifica alle aree circostanti.

Qui, si segnala l'uso di stencil micropatterning come un metodo semplice per generare microdisegni HPSC senza ulteriori passaggi la modifica della superficie prima della generazione di modelli ECM adesivi per hPSCs per fissare su. La cella comprende stencil di una sottile membrana, foglio per esempio, polidimetilsilossano (PDMS), con Micron per millimetriche dimensioni fori passanti sigillati su un substrato di coltura cellulare per contenere fisicamente rivestimenti ECM e hPSCs successivamente seminate. Come stencil patterning agisce trattenendo fisicamente la posizione in cui HPSC può accedere e collegare direttamente al substrato sottostante ECM rivestite, questo metodo è compatibile con vari substrati che possono sostenere culture HPSC. Gli unici requirement è che la scelta del materiale matrice può formare una tenuta reversibile con il substrato. Tali substrati comprendono convenzionale polistirene coltura tissutale (TCPS) 17, substrati coniugati ligando 18, così come substrati elastomerici rigidità sintonizzabile (ad es., PDMS) 19. Questo metodo permette anche di rivestimento di diversi ECM, come ad esempio vitronectina (o proteine ​​VTN), laminina e matrici membrana basale (ad esempio, Matrigel e Geltrax) per consentire il corretto fissaggio e la differenziazione di hPSCs. Pertanto, siamo in grado di trasferire ottimizzati configurazioni ECM-substrato per una specifica linea di HPSC a stencil micropatterning per ottimale cellula-matrice di adesione, la sopravvivenza e la differenziazione. Recentemente, un metodo simile è stato anche segnalato per dirigere la differenziazione epatica da hESC micropatterning utilizzando poli (metacrilato di metile) (PMMA) matrici di micro-stencil 16.

stencil cellulari possono essere fabbricate con materiali diversi, tra cui incontratials 20,21, poli (p-xililene) polimeri 22,23, PMMA 16 e più comunemente, PDMS 24-28. Silicone e poli (p-xililenici) polimeri stencil richiedono incisione diretta dei fori passanti con attrezzature specializzate 20-23, che limita la loro accessibilità agli utenti biologici. PDMS stencil possono essere fabbricati con metodi diversi a seconda della dimensione del tratto richiesto, che varia tipicamente da 3 micron a 2000 micron 11,26-29. Se piccole caratteristiche si desiderano, fogli Stenciling sottili possono essere prodotti da stampa stampaggio PDMS pre-polimero su un modello di silicio microfabbricazione contenente rilievi dei microdisegni 28. Per le caratteristiche> 1.000 micron, un taglio laser CO 2 fornisce un metodo semplice e di basso costo per tagliare direttamente i modelli su un foglio pre-fuso PDMS durante stencil fabbricazione. La riciclabilità dei stencil PDMS li rende anche conveniente per condurre una serie di esperimenti con sufficiente coerenza.

Qui, vi presentiamo la metodologia dettagliata per la fabbricazione di uno stencil PDMS con 1.000 micron caratteristiche da taglio laser e la generazione di microdisegni hESC. Questi microdisegni hESC sono stati usati per modulare l'entità della integrina ed E-caderina mediati aderenze all'interno di una colonia hESC coesa in modo da indagare come la polarizzazione spaziale di adesione cellulare portato nella cella destino eterogeneità 10.

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Protocollo

NOTA: Questo protocollo descrive la fabbricazione di PDMS stencil con 1.000 micron modelli di taglio laser e micropatterning della linea hESC, H9 con lo stencil PDMS.

1. progettazione e fabbricazione di PDMS Stencil per micropatterning

  1. Progettare il foglio di stencil con fori passanti della geometria desiderata e le dimensioni (ad esempio, 1.000 micron cerchi) e la guarnizione stencil utilizzando il computer-aided software di progettazione 10.
  2. Laser-tagliare il foglio di stencil e la guarnizione sul 120-150 micron e 2 mm di spessore polidimetilsilossano (PDMS) fogli rispettivamente con un laser CO 2-cutter 10.
  3. Incollare la guarnizione PDMS con il foglio di stencil PDMS utilizzando PDMS TDS liquidi e cuocere in forno a 60 ° C per 3-4 ore per ottenere lo stencil PDMS per micropatterning.
  4. Sterilizzare il stencil PDMS in autoclave a 120 ° C per 30 min ed essiccamento in forno prima dell'uso.

2. hESC principalemanutenzione

  1. Cultura le linee di hESC in un mezzo di manutenzione senza alimentatore su 1 × membrana basale matrice rivestito piastre di coltura di cellule hESC-qualificato a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. Passaggio le hESC quando sono circa il 70% confluenti per 3 min di incubazione a 37 ° C con dispasi trattamento e dissociare meccanicamente le colonie hESC in 100-200 micron grumi. Piastra le ciuffi hESCs ad una densità di 30-50 ciuffi per 9,6 centimetri 2 di superficie crescita su membrana basale matrice rivestite tessuto coltura polistirene in rapporto 1: 6 splitting.

3. Stencil micropatterning di cellule staminali embrionali umane

  1. Preparazione prima cella patterning
    1. Sigillare uno stencil PDMS su una capsula di Petri 60 millimetri per l'erogazione di 700 ml al 70% di etanolo grado analitico in acqua ultrapura nella capsula di Petri e mettendo lo stencil sulla parte superiore.
    2. Porre la capsula di Petri all'interno dell'armadio biosicurezza durante la notte per lasciare tegli etanolo anidro.
    3. Vedi esiste nessuna bolla sotto lo stampino per garantire che il stencil forma una buona tenuta con la piastra di Petri. Questo impedisce le fughe di soluzione di rivestimento ECM. Sigillare la piastra di Petri e conservare in condizioni sterili finché è pronto per la semina cellulare.
    4. Preparare aliquote di matrice membrana basale hESC qualificato secondo il certificato di analisi. Assicurarsi che ogni rendimenti aliquote 1 × soluzione matrice membrana basale hESC qualificato quando diluito in 25 ml di Modified Eagle Medium di Dulbecco: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12) in base alla scheda prodotto del produttore.
    5. Preparare la soluzione di rivestimento ECM con l'aggiunta di una aliquota di matrice membrana basale hESC-qualificato in 16,7 ml di DMEM / F12 per fare 1,5 × soluzione matrice membrana basale hESC-qualificato. Tenere tutte le soluzione di rivestimento ECM sul ghiaccio per evitare la gelificazione.
    6. Supplemento hESC terreno di mantenimento con 10 inibitore ROCK micron (Y27632).
  2. rivestimento ECM sul substrato stenciled
    1. Trattare la piastra di Petri con 100 WO 2 plasma per 90 sec. Per garantire la sterilità, solo aprire il coperchio capsula di Petri all'interno della camera di plasma prima del trattamento al plasma, e rapidamente coprire di nuovo la piastra di Petri dopo il completamento del trattamento. Questo facilita bagnatura superficiale e previene la formazione di bolle d'aria nella micropattern fori passanti durante l'aggiunta della soluzione di rivestimento ECM.
    2. Aggiungere 450 ml di 1,5 × soluzione matrice membrana basale hESC qualificato per coprire l'intera stencil. Sigillare la piastra di Petri con pellicola di auto-saldabile, ad esempio Parafilm, per evitare che la soluzione si secchi, e incubare per 5 ore a 37 ° C prima dell'uso.
  3. HESC semina sul substrato stenciled
    1. Esaminare le colonie hESC in 6 pozzetti per identificare le aree di cellule differenziate che mostrano la perdita della tipica morfologia hESC (ad esempio, la perdita di arrotondata, strettamente Packed morfologia epiteliale, alto rapporto / citoplasma nucleo con nucleoli prominenti). Rimuovere le regioni differenziate con un aspiratore.
    2. Lavare due volte con 2 ml DMEM / F12 per pozzetto.
    3. Aggiungere 1 ml di enzimi digestivi, come Accutase, per pozzetto della piastra da 6 pozzetti e incubare a 37 ° C per 8 min. Toccare la piastra delicatamente per staccare tutte le colonie dal substrato.
    4. Lavare ogni pozzetto con almeno 4 ml di DMEM / F12 per 1 ml di enzimi digestivi e raccogliere la sospensione cellulare in tubo da 15 ml.
    5. Centrifugare la sospensione cellulare a 200 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
    6. Aspirare per rimuovere il surnatante e aggiungere 400 ml di media hESC manutenzione integrato con inibitore ROCK (Rocki) per risospendere le cellule. Pipetta la sospensione cellulare su e giù per 3 volte delicatamente per rompere grumi nelle singole cellule.
    7. Mescolare il singolo pozzo sospensione cellulare e diluire 10 ml di campioni di cellule in 190 ml di DMEM / F12 (1:20 diluizione). Utilizzare un hemocytometer per determinare la densità delle cellule in sospensione magazzino cellulare.
    8. Calcolare la densità di semina cellulare richiesto per un determinato stencil.
      NOTA: Per esempio, abbiamo sperimentalmente determinato la densità di semina cellulare di ottenere un monostrato confluente di singole cellule è di circa 4.444 cellule / mm 2. Così, uno stencil con una superficie di 450 mm 2 e il volume semina di 400 microlitri richiederà una sospensione cellulare di essere a una densità di 2 milioni di cellule / 400 microlitri.
    9. Diluire la sospensione della cella alla densità di semina desiderata (vedi punto 3.3.8 NOTA) con terreno di coltura hESC integrato con Rocki.
    10. Aggiungere un volume designato di sospensione cellulare contenente il numero di celle in ciascun stencil e lasciare la piastra di Petri indisturbato in cappuccio per 5 min a temperatura ambiente per permettere alle cellule di stabilirsi.
    11. Trasferire la piastra di Petri in incubatore e incubare per 1 ora per consentire l'adesione delle cellule. Fare attenzione a mantenere il livello capsula di Petri durante latrasferire processo in modo che le cellule rimangono come un monostrato nello stencil.
  4. Rimozione Stencil e passivazione del substrato nanostrutturata
    1. Esaminare la piastra di Petri al microscopio per verificare se le cellule siano fissati correttamente sul substrato sottostante.
    2. Aspirare via sospensione cellulare dallo stencil.
    3. Aggiungere 2 ml / piatto di coltura cellulare 0,5% di tensioattivo non ionico compatibili in DMEM / F12 alla zona circostante stencil.
    4. Utilizzare un paio di pinze in autoclave a buccia delicatamente lo stencil. Agitare la soluzione tensioattivo non ionico intorno come lo stencil è staccata per evitare che le cellule si secchi. Visivamente osservare le micropatterned cellule nella capsula di Petri.
    5. Incubare le micropatterned cellule in soluzione di tensioattivo-DMEM / F12 non ionico 0,5% per 10 min a 37 ° C.
    6. Aspirare via il tensioattivo-DMEM soluzione / F12 non ionico. Lavare 3 volte con 2 ml / piatto di DMEM / F12.
    7. Aggiungere 2 ml / piatto di hESCterreno di mantenimento integrato con Rocki e incubare a 37 ° C durante la notte.
    8. Dopo incubazione per una notte, aspirare hESC terreno di mantenimento supplementato con rocki, lavare una volta con DMEM / F12 e indurre differenziazione mesoendoderm aggiungendo 2 ml / piatto di terreno di differenziamento supplementato con 100 ng / ml Activin, 25 ng / ml BMP4 e 10 ng / FGF2 ml .
    9. Valutare le microdisegni utilizzando l'imaging a contrasto di fase e calcolare i profili di intensità media Brachyury (T) per ogni modello come descritto in precedenza 8.

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Risultati

In questo articolo, descriviamo la fabbricazione di uno stencil cella utilizzando una taglierina laser per generare 1.000 micron caratteristiche. La matrice è composta da 2 parti: un sottile foglio stencil (circa 100-200 micron di spessore), contenente la micropattern fori passanti, ed una guarnizione PDMS a contenere la soluzione di rivestimento ECM o sospensione cellulare. Qui, 127 micron e 2 mm di spessore fogli PDMS disponibili in commercio sono stati usati come foglio stencil e la ...

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Discussione

Fabbricazione di stencil micropatterning

micropatterning Stencil fornisce un metodo ideale per generare microdisegni HPSC per indagare nicchia mediata differenziazione patterning. Il vantaggio principale di stencil patterning rispetto ad altre tecniche micropatterning, come la stampa microcontact e photopatterning, è che non richiede la modifica della superficie e può essere implementato su supporti TCP convenzionali. Pertanto, terreni di coltura ottimizzati e riv...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è sostenuto da NUS Messa in concessione (R-397-000-192-133) e ETPL Fondo Gap (R-397-000-198-592). GS è uno studioso NUS di ricerca. Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Jiangwa Xing per il suo supporto tecnico micropatterning cellulare.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
 2 mm thick PDMS sheetSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.005Used to form reservoir for stencil
120-150 μm thick PDMS sheetSpecialty Silicone Products Inc., USASSPM823-.040Used to form stencil 
60 mm Petri dishNunc Nunclon Delta150326Substrate for micropatterning
AccutaseAccutase, Merck Millipore, SingaporeSCR005Enzyme to break H9 cells into single cells
Activin  R&D Systems, Singapore338-AC-010Growth factor for H9 differentiation
BMP4 R&D Systems, Singapore338-BP-010Growth factor for H9 differentiation
Plasma system Femto Science, KoreaCUTE-MPFor plasma oxidation of stencil
DispaseStemCell™ Technologies, Singapore7923Enzyme used to weaken the cell-ECM adhesion during passaging
DMEM/F12GIBCO, USA11330032Basal medium for H9 cells
FGF2R&D Systems, Singapore233–FB–025Growth factor for H9 differentiation
H9 cell lineWiCell Research Institute, Inc., USAWA09Human embryonic stem cells
hESC-qualified basement membrane matrixMatrigel, BD Biosciences, Singapore354277Extra-cellular matrix coating to support growth of H9 cells
Inverted microscopeLeica Microsystems, SingaporeDMi1For capturing bright-field images
Laser cutterEpilog Helix 24 Laser SystemUsed to generate through holes in PDMS sheet
mTeSR™1 medium StemCell™ Technologies, Singapore5850Maintainence medium for H9 cells
PDMS SYLGARD® 184, Dow Corning Co., USA3097358-1004Used for sticking the PDMS stencil and reservior
ROCKi Y27632Calbiochem, Merck Millipore, Singapore688000Maintains H9 cells as single cells 
STEMdiff™ APEL™ medium StemCell™ Technologies, Singapore5210Differentiation medium for H9 cells
Polyethylene terephthalate filmSureMark SingaporeSQ-6633Used to form stencil 
Cell culture compatible non-ionic surfactantPluronic acid F-127, Sigma, SingaporeP2443Passivating reagent to repel cell adhesion in non-micropatterned substrates

Riferimenti

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