La visualización de las primeras etapas de la fagocitosis

Resumen

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Resumen

El cuerpo de los mamíferos está equipado con varias capas de mecanismos que ayudan a defenderse de las invasiones de patógenos. Fagocitos profesionales del sistema inmune - como los neutrófilos, células dendríticas y macrófagos - conservan la capacidad innata para detectar y borrar dichos patógenos invasores a través de la fagocitosis ^1. La fagocitosis implica eventos coreografía de reorganización de la membrana y la remodelación de la actina en la superficie celular ^{2, 3.} Los fagocitos interiorizan con éxito y erradicar moléculas extrañas que se hayan cumplido todas las etapas de la fagocitosis. Estos pasos incluyen reconocimiento y unión del patógeno por los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reside en la superficie celular, la formación de la taza de fagocitosis a través de protuberancias membranosas de actina enriquecido (seudópodos) para rodear el material en partículas, y la escisión del fagosoma, seguido de maduración fagolisosoma que resultados en lamatando del patógeno ^{3, 4.}

Imaging y cuantificación de las diversas etapas de la fagocitosis es instrumental para elucidar los mecanismos moleculares de este proceso celular. El presente trabajo reporta métodos para estudiar las diferentes fases de la fagocitosis. Se describe un enfoque basado en microscopio para visualizar y cuantificar la formación de una copa de unión, fagocítica, y la internalización de partículas por los fagocitos. Como la fagocitosis se produce cuando los receptores innatas en las células fagocíticas encuentran ligandos sobre una partícula objetivo más grande que 0,5 m, los ensayos que aquí presentamos comprender el uso de hongos patógenos Candida albicans y otras partículas tales como zymosan y perlas recubiertas con IgG.

Introducción

A pesar de la continua exposición a patógenos tales como bacterias, virus y hongos, nuestro cuerpo está bien equipado con mecanismo inmunológico que proporciona protección frente a la infección. El sistema inmune innato es la primera línea de defensa contra los patógenos invasores y se basa principalmente en las células fagocíticas que reconocen y se internalizan objetivos extranjeros.

La fagocitosis es un proceso celular evolutivamente conservada que abarca la inmersión de las partículas no deseadas de más de 0,5 micras. Las células fagocíticas expresan una amplia gama de receptores inmunes (también conocidos como receptores de reconocimiento de patrón, PRRS) en la superficie celular que les permiten reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) presentes en los patógenos antes de la inmersión ^3. La unión de patógenos es seguido por la agrupación de receptores en la superficie celular y provoca la formación de una taza fagocítica. Esto da lugar a la remodelación de la membrana actina guiado que sobresale alrededorel objetivo, finalmente, que la envuelve y pellizcos-off para formar una vacuola phagosomal discreta ^{2, 5.} El fagosoma continuación, madura y se acidifica mediante fusión posterior con los endosomas tardíos y lisosomas que forma fagolisosómica ^6.

Aunque se describe como la fagocitosis mediada por el receptor de eventos y actina impulsado, este proceso también se basa en la modificación espacial-temporal de los lípidos que componen la membrana de plasma, tales como fosfoinosítidos (IP) y esfingolípidos ^{7, 8.} Mientras que la polimerización de actina es dictada por una acumulación local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P ₂₎ en la base de la copa fagocítica, despolimerización de la actina depende de la conversión de (PI (4,5) P ₂ a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P ₃₎ ^{3, 9.} Ambas modificacionesson esenciales ya que el primero lleva a la extensión de los seudópodos alrededor del objetivo y éste permite el hundimiento de las partículas en el citosol de la fagocitos ^10.

Las células que tienen la capacidad de fagocitar o son fagocitos profesionales, como macrófagos / monocitos, granulocitos / neutrófilos, y células dendríticas (DC) o fagocitos no profesionales, tales como fibroblastos y células epiteliales ^11. La fagocitosis realizada por todos los fagocitos juega un papel central en el mantenimiento del tejido y remodelación, mientras que la fagocitosis realizada por fagocitos profesionales se encarga de la coordinación de la respuesta inmune innata y adaptativa frente a los patógenos. fagocitos profesionales no sólo engullen y matan el patógeno, sino también los antígenos presentes en las células linfoides del sistema inmune adaptativo. Esto contribuye a la liberación de citoquinas pro-inflamatorias y para la participación de las células linfoides, por lo tanto, conduce ael bloqueo con éxito de la infección ^12.

técnicas bioquímicas convencionales han sido fundamentales en la obtención de conocimientos sobre el mecanismo molecular de diferentes procesos celulares durante la fagocitosis, tales como las modificaciones posteriores a la traducción y diversas asociaciones de alta afinidad entre proteínas. Sin embargo, es difícil obtener información con respecto a la dinámica espacial y temporal de los acontecimientos fagocíticas utilizando los métodos bioquímicos convencionales. imágenes de células vivas no sólo nos permite supervisar eventos celulares en cuenta la sensibilidad de tiempo sino que también nos permite obtener información a nivel de células individuales. Aquí se describe un método para investigar las diferentes etapas de la fagocitosis, así como analizar todo el proceso espaciotemporalmente usando microscopía confocal.

Protocolo

1. Preparación de DC2.4 y RAW 264.7 Líneas Celulares

NOTA: La línea celular similar a macrófagos RAW 264.7 y la DC2.4 línea de células dendríticas son tanto de origen murino, y se utilizaron las siguientes condiciones para cultivar las células.

1. Crecer células RAW 264.7 en DMEM (medio de Eagle Mínimo de Dulbecco) suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C en un incubador humidificado con 5% de CO _2.
2. Se cultivan las células DC2.4 en condiciones similares con la de las células RAW 264.7, salvo el uso del medio RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado con L-glutamina en lugar de DMEM.

2. Preparación de conjugados fluorescentes Partículas: Perlas de C. albicans, zimosán, recubiertas de IgG-

1. Cultivo de Candida albicans
   1. Inocular C. albicans cepa SC5314 de un stock de glicerol congelado en 25 ml de YPD suplementado con Uri (2% Bacto-peptona, 1%extracto de levadura, 2% de glucosa y 80 mg / ml uridina) durante la noche a 30 ° C.
      NOTA: Evitar crecer el cultivo de Candida más de una DO ₆₀₀ de 12.
   2. Tomar 1 ml de la C. albicans y girar hacia abajo a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   3. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento con 1 ml de PBS.
   4. Recoger el precipitado por centrifugación a 2000 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   5. Repita el paso 2.1.4.
   6. Calcular la multiplicidad de infección (MOI) de C. albicans en relación con el número de fagocitos y proceder con el ensayo de fagocitosis tal como se describe en la sección 3. Un OD ₆₀₀ de 1 es equivalente a 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans por 1 ml.
      NOTA: Generación de Candida-BFP se describe en la referencia ^13.
2. Preparación de zimosán y perlas recubiertas con IgG
   NOTA: Zymosan es una que contiene β-glucano-preparación de partículas de hidratos de carbono por hongos que deriva de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan se conoce para evocar señales inflamatorias en los macrófagos y las células dendríticas, y se ha utilizado ampliamente en estudios de fagocitosis ^{13, 14, 15.}
   1. En resumen vórtice del tubo que contiene el material en partículas, y la alícuota una cantidad suficiente para un experimento en un tubo de 1,5 ml.
      NOTA: Por lo general usamos relación 1:10 (para una celda, añadir 10 zymosan partículas o perlas recubiertas con IgG).
   2. Añadir 1 ml de PBS enfriado en hielo, y recoger las partículas por centrifugación durante 1 min a 10.000 x g.
   3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en PBS 1 ml de hielo-frío.
   4. Repita los pasos 2.2.2-2.2.3
      NOTA: Continúe con el punto 2.2.5 o almacenar el tubo a 4 ° C hasta su uso.
   5. Sonicar las partículas de 10 seg en baño de ultrasonido ultrasónico (120 V, 50 a 60 kHz) con el fin de evitar unany la agregación de partículas.

3. La fagocitosis

NOTA: La fagocitosis es un proceso complejo que se inicia con la unión de las partículas en la superficie celular de los fagocitos a través de la interacción de PRRS con ligandos sobre la superficie de la partícula. La unión es seguido por el montaje de actina y sus proteínas asociadas en el sitio de contacto, y la formación de una taza de fagocitosis. El desmontaje posterior actina se produce en el fagosoma y da lugar a la inmersión completa de las partículas. A continuación se describen las diferentes etapas de la fagocitosis.

1. Ensayo de unión
   NOTA: La finalidad de este experimento es para controlar la primera etapa de la fagocitosis que implica la interacción entre los ligandos sobre las partículas diana y los receptores en los fagocitos.
   1. Semillas de unos 5 x 10 ⁴ células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alterntivamente, células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 ó 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de cristal. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO _2.
      NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar.
   2. Colocar el portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 min.
   3. Retire con cuidado el medio de cada pocillo usando una pipeta o un aspirador.
      PRECAUCIÓN: Realice este paso cuidadosamente como cada pocillo de un sistema de cámaras cubreobjetos es pequeño; es fácil de perturbar las células con la punta de una pipeta o un fuerte flujo de aire de un aspirador.
   4. Mezclar las partículas marcadas con fluorescencia con un medio de cultivo celular (preparado como se ha descrito anteriormente). Añadir Candida -BFP (a una MOI de 10), con fluorescencia perlas-conejo-zymosan conjugado o látex IgG-FITC (10 partículas por célula) a las células. Utilizar un volumen final de 200 l medios de comunicación para una cámara bien para asegurar que todas las células están cubiertos.
   5. Girar por el tobogán de cámara en 277xg durante 3 min a 10 ° C.
      NOTA: Este paso de centrifugación ayuda a aumentar el contacto entre las partículas y las células, y se sincroniza el proceso de unión.
   6. Transferir inmediatamente la diapositiva cámara a un incubador humidificado 37 ° C con 5% de _CO2 durante 5 min.
   7. Retire la diapositiva cámara de la incubadora y aspirar los medios de comunicación.
   8. Se lavan las células 3 veces con PBS helado.
      NOTA: Compruebe la presencia de partículas sueltas con un microscopio óptico y se lava varias veces con PBS, si es necesario. Es esencial para eliminar las partículas no unidas del pozo para minimizar el ruido de fondo durante el análisis.
   9. Fijar las células mediante la adición de 500 l 4% de paraformaldehído (PFA) diluido en PBS mediante incubación durante 30 min a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: Este paso requiere el uso de PFA al 4%, que es altamente tóxico, corrosivo, y carcinógeno potencial. Adecuada se debe tener cuidado al usar este líquido. Además, proteja las muestras de la luz.
   10. Lavar las células mediante la adición de 500 l de PBS en la cámara y aspirar la solución suavemente.
   11. 3.1.9 Repita el paso dos veces.
       NOTA: En este paso, vuelva a llenar cada vial inmediatamente después de retirar el PBS anterior.
   12. Detener la fijación mediante la incubación con 500 l de 50 mM NH ₄ Cl en PBS durante 10 min.
   13. Lavar las células dos veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10.
   14. Permeabilizar las células mediante la adición de 250 l de tampón de unión (0,1% de saponina, 0,2% de BSA en PBS) durante 30 min a temperatura ambiente.
   15. Manchas F-actina mediante la adición de faloidina conjugada con fluorescencia (diluido 1: 500 en tampón de unión). Se incuban las células durante 1 hora a temperatura ambiente.
   16. Lavar las células tres veces con PBS como se describe en el paso 3.1.10.
   17. Capturar imágenes utilizando un microscopio confocal (objetivo 63X y 402 nm y 488 nm láser) y analizar las imágenes usando ImageJ ^16.
       NOTA: La unión Una partícula éxito se caracteriza por la presencia de un cu fagocíticap en el lugar donde el contacto de partículas de la célula fagocítica (Figura 1). Vea el paso 3.2.5.
2. La fagocitosis Ensayo de absorción
   NOTA: Este experimento está diseñado para controlar la internalización completa de las partículas marcadas con fluorescencia por los fagocitos usando microscopía confocal (Figura 2).
   1. Semillas de unos 5 x 10 ⁴ células en un portaobjetos de cámara, de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Alternativamente, las células de la placa sobre cubreobjetos (en formato de 24 o 12 pocillos) o placas de 96 pocillos con fondo de vidrio. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO _2.
      NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o una técnica similar.
   2. Mantenga los portaobjetos de cámara (o placa) a 10 ° C durante 10 minutos.
      NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la endocitosis, así como la fagocitosis no deseado y, posteriormente, tener un fagocitosis sincronizada.
   3. perfORM pasos de 3.1.3 a 3.1.5
   4. La transferencia de la diapositiva cámara a un 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO _2, y se incuba durante diferentes puntos de tiempo. Fijar las células después de la infección 30, 60 y 90 minutos después. Observe C. albicans se empiezan a formar hifas después de la infección de 60 minutos; fagocitos comienzan a mostrar la muerte celular (pyroptosis) después de 90 min ^8.
      NOTA: Esta es una recomendación, y la optimización es esencial en función del tipo de células y el material en partículas utilizado.
   5. Realice los pasos de 3.1.7 a 3.1.15. Analizar las imágenes usando ImageJ ^16.
      NOTA: una absorción exitosa se caracteriza por una internalización completa de un material en partículas en el interior del citoplasma de un fagocito (Figura 2). La tinción de los fagocitos con marcador de superficie celular tales como faloidina ayuda a delinear el contorno de las células. También es esencial para llevar a cabo z-pilas con el fin de determinar si el material en partículas se une a la superficie celular o completely internalizado.
3. Imágenes en vivo de la fagocitosis
   NOTA: En este protocolo se describe el uso de la microscopía confocal para capturar las diferentes etapas de la fagocitosis utilizando zymosan fluorescente conjugado. Nosotros usamos la línea de células dendríticas DC2.4 que expresa de forma estable etiquetada con mCherry F-actina ^8, un biosensor que muestra la distribución de actina filamentosa en las células vivas. Desde la fagocitosis es un proceso actina impulsado por la formación de imágenes en vivo en esta celda no sólo nos permite capturar el movimiento y la dinámica de la red de F-actina, sino también para visualizar los diferentes eventos fagocíticas dentro de las células vivas (Figura 3, Película 1).
   1. Semillas de unos 5 x 10 ⁴ células en un portaobjetos de cámara, a una concentración de modo que son 60 a 70% de confluencia en el momento del experimento. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C incubadora humidificada con 5% de CO _2.
      NOTA: Las células pueden ser contados utilizando hemocitómetro o unatécnica similar.
   2. Mantener los portaobjetos de cámara en hielo durante 10 min.
      NOTA: Enfriamiento es necesario con el fin de bloquear la absorción no deseada, y tener una fagocitosis sincronizada.
   3. Realice los pasos de 3.1.3 a 3.1.5
   4. Pre-calentar la platina del microscopio a 37 ° C y equilibrar la cámara con 5% de CO _2. Espere 30 a 45 min para la temperatura y el CO ₂ para estabilizar antes de iniciar la formación de imágenes.
      NOTA: Dado que las emisiones de CO ₂ y los niveles de temperatura son críticos para la fagocitosis, es importante para encender el calentador de microscopio antes del experimento para equilibrar la cámara ambiental.
   5. Colocar el portaobjetos cámara que contiene las células en el recinto microscopio incubador equilibrado a 37 ° C y 5% de CO _2.
   6. Realizar las imágenes en directo ^{17, 18.}
      NOTA: Los ajustes de la potencia del láser (ganancia, agujero de alfiler, etc.) puede variar dependiendo del tipo de THe microscopio y la sonda fluorescente usada. Por lo tanto, se recomienda consultar el manual del microscopio para la condición óptima para su imágenes en vivo ^17,18.
      1. Utilice microscopio láser confocal de barrido (y el software asociado) para imágenes en vivo. Utilice petróleo objetivo 63X 1.4NA con un agujero de alfiler de 1-1.1 unidades Airy.
      2. Para iniciar la proyección de imagen, se utiliza el campo brillante para encontrar una región representativa en la diapositiva cámara. A continuación, seleccione el campo haciendo clic en la opción de posición sobre el software. Para detectar las buenas prácticas agrarias en la pista 1 utiliza el conjunto de filtros de 488 nm láser con un divisor de haz a 582 nm, para detectar longitudes de onda entre 488 y 582 nm.
      3. En la pista 2 seleccionar un conjunto de filtros óptima para mCherry (RFP), utilizando un divisor de haz a 578 nm y la detección de longitudes de onda entre 578 y 600 nm. Utilice 488 nm y 578 nm con láseres de potencia del láser 50% y una salida de ganancia de 600-700. Obtener imágenes cada 30 seg durante un total de 90 min.

Resultados

se presenta método basado en microscopio para controlar las diferentes etapas de la fagocitosis. Se muestran los diferentes eventos durante la fagocitosis de partículas fluorescentes diferentes de células DC2.4. Usando las técnicas descritas aquí, se investigó el papel de los esfingolípidos en las primeras etapas de la fagocitosis. Para este propósito, las células dendríticas DC2.4 genéticamente deficientes en Sptlc2, la enzima que cataliza la primera y la tasa de limitación de paso en la ruta de biosíntesi...

Discusión

fagocitos profesionales, como los macrófagos y las células dendríticas, envolver y eliminar los patógenos invasores por lo tanto haciendo la fagocitosis un componente importante del sistema de defensa del huésped. Durante este proceso se someten a los fagocitos extensa reorganización de la membrana y la reorganización del citoesqueleto en su superficie celular ^{8, 19, 20.} Para entender mejor este proceso dinámico, la vis...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144