Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

Zusammenfassung

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Zusammenfassung

Der Säugetierkörper ist mit verschiedenen Schichten von Mechanismen ausgestattet, die sich von Erreger Invasionen zu verteidigen helfen. Professionelle Phagozyten des Immunsystems - wie Neutrophile, dendritische Zellen und Makrophagen - behalten die angeborene Fähigkeit , solche eindringende Krankheitserreger durch Phagozytose ¹ zu erkennen und zu löschen. Phagozytose beinhaltet choreografierter Ereignisse von Membran Reorganisation und Aktin - Umbildung an der Zelloberfläche ^{2, 3.} Phagozyten erfolgreich internalisieren und fremde Moleküle nur auszurotten, wenn alle Stufen der Phagozytose erfüllt sind. Diese Schritte umfassen die Erkennung und Bindung des Erregers durch Mustererkennungsrezeptoren (PRRS) an der Zelloberfläche aufhalten, die Bildung von phagozytischen cup durch Actin angereicherte membranöse Vorsprünge (Pseudopodien) das teilchenförmige zu umgeben, und Spaltung der phagosome durch Phagolysosom Reifung dass Ergebnisse in derTöten des Erregers ^{3, 4.}

Bildgebung und Quantifizierung der verschiedenen Stadien der Phagozytose ist maßgeblich für die molekularen Mechanismen dieser zellulären Prozess Aufklären. Die vorliegende Manuskript berichtet Methoden, um die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu studieren. Wir beschreiben ein Mikroskop-basierten Ansatz zu visualisieren und die Bindung, phagozytische Tasse Bildung quantifizieren und die Internalisierung von partikulären von Phagozyten. Wie Phagozytose auftritt , wenn angeborenen Rezeptoren auf phagozytischen Zellen Liganden auf einem Zielpartikel auftreten größer als 0,5 um ist , die Assays wir die Verwendung von pathogenen Pilzen Candida albicans und andere Teilchen , wie beispielsweise Zymosan und IgG beschichteten Kügelchen umfassen hier präsentieren.

Einleitung

Trotz der kontinuierlichen Exposition gegenüber Krankheitserregern wie Bakterien, Viren und Pilze, ist unser Körper gut mit Immun-Mechanismus ausgestattet, der Schutz gegen eine Infektion bieten. Das angeborene Immunsystem ist die erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger und stützt sich hauptsächlich auf Phagozyten, die erkennen und ausländische Ziele verinnerlichen.

Phagozytose ist ein evolutionär konserviert zellulären Prozess, der die Phagozytose von unerwünschten Partikeln größer als 0,5 & mgr; m umfasst. Phagozytische Zellen exprimieren eine Vielzahl von Immunrezeptoren auf der Zelloberfläche (auch als pattern recognition receptors, PRR bekannt) , die es ihnen ermöglichen , ³ pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) , die auf Krankheitserreger vor engulfment zu erkennen. Pathogen-Bindung wird durch Rezeptor clustering an der Zelloberfläche folgt und löst die Bildung einer phagozytischen Tasse. Dies führt zu einer Membran Remodeling Aktin-angetrieben, ragt runddas Ziel ist , umhüllen sie schließlich und Abklemmen eines diskreten phagosomalen Vakuole ^{2, 5} zu bilden. Die phagosome reift dann und säuert durch anschließende Fusion mit späten Endosomen und Lysosomen , die Phagolysosom ⁶ bildet.

Obwohl die Phagozytose als rezeptorvermittelte und Aktin-driven Ereignis beschrieben wird, stützt sich dieses Verfahren auch auf räumlich-zeitlichen Modifikation von Lipiden, die die Plasmamembran, wie Phosphoinositiden (PIs) und Sphingolipide ^{7, 8} zusammenzusetzen . Während Aktin - Polymerisation durch eine lokale Ansammlung von Phosphoinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P ₂₎ an der Basis des phagozytischen cup diktiert wird, hängt Aktin Depolymerisation auf der Umwandlung von (PI (4,5) P ₂ bis Phosphoinosit-3,4,5-bisphosphat (PI (3,4,5) P ₃₎ ^{3, 9.} Beide Änderungensind wichtig , da Ersteres führt zu einer erfolgreichen Verlängerung der Pseudopodien um das Ziel und die letztere ermöglicht ¹⁰ von Teilchen in das Cytosol der Phagozyten sinkt.

Die Zellen, die die Fähigkeit zu phagozytieren haben , sind entweder professionelle Phagozyten, wie Makrophagen / Monozyten, Granulozyten / Neutrophilen und dendritischen Zellen (DCs) oder nicht - professionellen Phagozyten, wie Fibroblasten und Epithelzellen ^11. Die Phagozytose von allen Phagozyten ausgeführt spielt eine zentrale Rolle bei der Gewebe Wartung und Umbau, während der Phagozytose von professionellen Phagozyten durchgeführt, um die Koordination der angeborenen und adaptiven Immunantwort gegen Krankheitserreger verantwortlich ist. Professionelle Phagozyten nicht nur überfluten und den Erreger zu töten, sondern auch Antigene zu den lymphatischen Zellen des adaptiven Immunsystems. Dies trägt zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen und den Eingriff von lymphoiden Zellen, daher führt zudie erfolgreiche Blockade der Infektion ^12.

Herkömmliche biochemische Techniken haben dazu beigetragen, Wissen zu gewinnen über die molekularen Mechanismen der verschiedenen zellulären Prozessen während der Phagozytose, wie post-translationale Modifikationen und verschiedene hochaffinen Assoziation zwischen Proteinen. mit den üblichen biochemischen Methoden ist es jedoch schwierig, Informationen über die räumlichen und zeitlichen Dynamik der phagozytischen Ereignisse zu erhalten. Live-Cell-Imaging ermöglicht uns nicht nur zelluläre Ereignisse in einer Zeit, sensible Art und Weise zu überwachen, sondern auch ermöglicht es uns, Informationen auf Einzelzellebene zu gewinnen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die verschiedenen Stadien der Phagozytose zu untersuchen, sowie den gesamten Prozess zu analysieren raumzeitlich konfokalen Mikroskopie.

Protokoll

1. Herstellung von DC2.4 und RAW 264.7-Zelllinien

HINWEIS: Die Makrophagen-Zelllinie RAW 264.7 und die dendritische Zelllinie DC2.4 sind sowohl murinen Ursprungs, und die folgenden Bedingungen wurden verwendet, um die Zellen zu wachsen.

1. Wachsen RAW 264.7 - Zellen in DMEM (Dulbeccos Minimal Eagle-Medium) , ergänzt mit 10% inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
2. Wachsen DC2.4 Zellen unter ähnlichen Bedingungen mit der RAW 264.7-Zellen, mit der Ausnahme Gebrauch RPMI (Roswell Park Memorial Institute) Medium, das mit L-Glutamin anstelle von DMEM.

2. Herstellung von Fluorescent Konjugierte Partikel: C. albicans, Zymosan, IgG-beschichtete Beads

1. Wachsende Candida albicans
   1. Impfen SC5314 C. albicans Stamm aus einem gefrorenen Glycerolstammlösung in 25 ml YPD mit Uri ergänzt (2% Bacto-Pepton, 1%Hefeextrakt, 2% Glucose und 80 ug / ml Uridin) über Nacht bei 30 ° C.
      HINWEIS: Vermeiden Sie die Candida - Kultur wachsen mehr als einer OD ₆₀₀ von 12.
   2. Nehmen Sie 1 ml der C. albicans und Spin es bei 2.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur nach unten.
   3. Aspirieren den Überstand und resuspendiere das Pellet mit 1 ml PBS.
   4. Sammle das Pellet durch Zentrifugation bei 2.000 xg für 5 min bei Raumtemperatur.
   5. Wiederholen Sie Schritt 2.1.4.
   6. Berechne die Multiplizität der Infektion (MOI) von C. albicans in Bezug auf die Anzahl von Phagozyten und fahren mit der Phagocytose - Assay , wie in Kapitel 3 beschrieben eine OD ₆₀₀ von 1 bis 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans pro 1 ml entspricht.
      HINWEIS: Die Erzeugung von Candida-BFP in Bezug ¹³ beschrieben.
2. Herstellung von Zymosan und IgG beschichteten Beads
   HINWEIS: Zymosan ist ein β-Glucan enthaltendePilz-Kohlenhydrat - Partikelpräparat , das aus Saccharomyces cerevisiae abgeleitet. Zymosan ist bekannt Entzündungssignale in Makrophagen und dendritischen Zellen hervorzurufen, und es wurde ¹³ extensiv in Phagozytose Studien verwendet ^{wurden, 14, 15.}
   1. Kurz das Rohr Wirbel, der die Partikel enthält, und eine Menge für ein Experiment in ein 1,5-ml-Röhrchen ausreichend aliquotieren.
      HINWEIS: In der Regel verwenden wir im Verhältnis 1:10 (für eine Zelle, mit 10 zymosan Partikel oder IgG-beschichtete Beads).
   2. 1 ml eiskaltem PBS, und sammelt die Partikel durch bei 10.000 x g für 1 min zentrifugiert.
   3. Den Überstand aspirieren und das Pellet in 1 ml eiskaltem PBS.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.2-2.2.3
      HINWEIS: Gehen Sie 2.2.5 zu Schritt oder lagern Sie das Röhrchen bei 4 ° C bis zur Verwendung.
   5. Beschallen die Partikel für 10 Sekunden in Ultraschall-Ultraschallbad (120 V, 50-60 kHz), um eine zu vermeidenny Partikelaggregation.

3. Phagozytose

HINWEIS: Die Phagozytose ist ein komplexer Prozess, der mit der Bindung der Partikel auf der Zelloberfläche der Phagozyten durch Wechselwirkung von PRRs mit Liganden auf der Oberfläche des Partikels beginnt. Bindung wird durch die Montage von Aktin und seine zugehörigen Proteine ​​an der Stelle des Kontakts und die Bildung eines phagozytischen cup gefolgt. Die anschließende Aktin Demontage erfolgt auf phagosome und führt zur vollständigen engulfment des partikulären. Im Folgenden die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu beschreiben.

1. Bindungsassay
   HINWEIS: Der Zweck dieses Experiments ist es, die erste Stufe der Phagozytose zu überwachen, die die Wechselwirkung zwischen den Liganden auf den Zielpartikeln und den Rezeptoren auf den Phagozyten beinhaltet.
   1. Samen etwa 5 x 10 ⁴ Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alterntiv, Platten Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
      HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden.
   2. Legen Sie die Kammer Schieber (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min.
   3. Entfernen Sie vorsichtig das Medium aus jedem Well einer Pipette oder Absauger verwenden.
      ACHTUNG: Führen Sie diesen Schritt sorgfältig wie jede Vertiefung von einem Kammerschalennautilus Abdeckglas System ist klein; es ist leicht, Zellen mit der Spitze einer Pipette oder einer starken Luftstrom von einem Absauggerät zu stören.
   4. Mischen Sie die fluoreszenzmarkierte Partikel mit einem Zellkulturmedium (hergestellt wie oben beschrieben). Hinzufügen Candida -BFP (bei einer MOI von 10), fluoreszenz konjugiert-Zymosan oder Latexkügelchen-Kaninchen - IgG-FITC (10 Partikel pro Zelle) auf die Zellen. Verwenden, um ein Endvolumen von 200 & mgr; l Medium für eine Kammer auch alle Zellen, um sicherzustellen, abgedeckt sind.
   5. Spin down die Kammer Schieber bei 277xg für 3 min bei 10 ° C.
      Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt hilft, den Kontakt zwischen den Teilchen und den Zellen zu erhöhen, und es synchronisiert den Bindevorgang.
   6. Sofort übertragen die Kammer Folie zu einem 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO ₂ für 5 min.
   7. Entfernen Sie die Kammer Schlitten aus dem Inkubator und die Medien ansaugen.
   8. Waschen Sie die Zellen mit eiskaltem PBS 3x.
      HINWEIS: Überprüfen Sie das Vorhandensein von nicht gebundenen Partikel mit einem Lichtmikroskop und mehrmals mit PBS waschen, wenn nötig. Es ist wesentlich, ungebundene Partikel aus dem Bohrloch zu entfernen, Hintergrundrauschen während der Analyse zu minimieren.
   9. Fix-Zellen durch Zugabe von 500 ul 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS verdünnt, für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert.
      VORSICHT: Dieser Schritt erfordert die Verwendung von 4% PFA, die hoch toxisch, korrosiv ist und potentiell karzinogen. Die richtige Vorsicht ist geboten, wenn diese Flüssigkeit verwendet wird. Außerdem schützen Proben aus Licht.
   10. Die Zellen waschen von 500 ul PBS in die Kammer das Hinzufügen und die Lösung vorsichtig absaugen.
   11. Zweimal wiederholen 3.1.9 Schritt.
       HINWEIS: Bei diesem Schritt füllen jedes Fläschchen unmittelbar nach dem vorherigen PBS zu entfernen.
   12. Stoppen Sie die Fixierung von 10 min mit 500 & mgr; l von 50 mM NH ₄ Cl in PBS inkubiert.
   13. Wasche die Zellen zweimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben.
   14. Permeabilisieren Zellen durch Zugabe von 250 & mgr; l Bindungspuffer (0,1% Saponin, 0,2% BSA in PBS) für 30 min bei Raumtemperatur.
   15. Stain F-Aktin durch fluoreszenz konjugiertes Phalloidin Zugabe von (1: 500 verdünnt in Bindungspuffer). Inkubiere Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
   16. Wasche die Zellen dreimal mit PBS wie in Schritt 3.1.10 beschrieben.
   17. Zum Aufzeichnen von Bildern mit einem konfokalen Mikroskop (63X Ziel, und 402 nm und 488 nm Laser) unter Verwendung von und zu analysieren , Bilder mit ImageJ ^16.
       HINWEIS: Eine erfolgreiche Partikelbindung durch das Vorhandensein einer Phagozyten cu gekennzeichnet istp an der Stelle , wo das partikuläre Kontakt die phagozytische Zelle (Abbildung 1). Siehe Schritt 3.2.5.
2. Phagozytose Uptake Assay
   Hinweis: Dieses Experiment wurde entwickelt , die vollständige Internalisierung von fluoreszent markierten Partikel durch Phagozyten Mikroskopie mittels konfokaler zu überwachen (Abbildung 2).
   1. Samen etwa 5 x 10 ⁴ Zellen in einer Kammer gleiten , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Alternativ Platte Zellen auf Deckgläser (in 24- oder 12-Well-Format) oder Glasboden-96-Well-Platten. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
      HINWEIS: Die Zellen können unter Verwendung von Hämozytometer oder eine ähnliche Technik gezählt werden.
   2. Halten Sie die Kammer gleitet (oder Platte) bei 10 ° C für 10 min.
      HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um Endozytose sowie unerwünschte Phagozytose zu blockieren, und anschließend einen synchronisierten Phagozytose haben.
   3. PerfORM Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5
   4. Übertragen , um die Kammer auf einen Objektträger 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2, und inkubiere für verschiedene Zeitpunkte. Fix-Zellen nach 30, 60 und 90 Minuten nach der Infektion. Beobachten Sie C. albicans beginnen Hyphen bei 60 min nach der Infektion zu bilden; Phagozyten beginnen nach 90 min ⁸ Zelltod (pyroptosis) zu zeigen.
      ANMERKUNG: Dies ist eine Empfehlung und Optimierung ist wesentlich abhängig von dem Zelltyp und dem partikulären verwendet.
   5. Führen Sie die Schritte von 3.1.7 bis 3.1.15. Analysieren von Bildern mit ImageJ ^16.
      HINWEIS: eine erfolgreiche Aufnahme durch eine vollständige Internalisierung eines partikulären innerhalb des Zytoplasmas einer Phagozyten (Abbildung 2) gekennzeichnet ist. Die Färbung der Phagozyten mit Zelloberflächenmarker wie phalloidin hilft, die Form von Zellen zu beschreiben. Es ist auch wichtig, z-Stacks, um zu bestimmen, ob die teilchenförmige ist gebunden an der Zelloberfläche oder kompl auszuführenetely verinnerlicht.
3. Live - Imaging von Phagozytose
   HINWEIS: In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von Konfokalmikroskopie die verschiedenen Stadien der Phagozytose mittels fluoreszenz konjugiert Zymosan zu erfassen. Wir verwenden die dendritischen Zelllinie DC2.4 , die stabil exprimiert mCherry-markierten F-Actin - ^8, einen Biosensor, der die Verteilung von fadenförmigen Aktin in lebenden Zellen zeigt. Da Phagozytose ein Aktin-gesteuerter Prozess ist ermöglicht die Live - Bildgebung in dieser Zelle nicht nur uns , die Bewegung und Dynamik von F-Actin - Netzwerk zu erfassen, sondern auch die verschiedenen phagozytischen Ereignisse innerhalb der lebenden Zellen (Abbildung 3, Film 1) zu visualisieren.
   1. Samen etwa 5 x 10 ⁴ Zellen in einer Kammer Schieber in einer Konzentration , so dass sie 60-70% konfluent zu der Zeit des Experiments sind. Inkubiere Zellen über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator mit 5% CO _2.
      HINWEIS: Die Zellen können mit Hämozytometer oder ein gezählt werdenähnliche Technik.
   2. Halten Sie die Kammer gleitet auf Eis für 10 min.
      HINWEIS: Die Kühlung ist erforderlich, um unerwünschte Aufnahme zu blockieren, und ein synchronisiertes Phagozytose haben.
   3. Führen Sie die Schritte von 3.1.3 bis 3.1.5
   4. Pre-warm das Mikroskoptisch bis 37 ° C und die Kammer mit 5% CO ₂ ins Gleichgewicht. Warten 30-45 min für die Temperatur und das CO ₂ zu stabilisieren , bevor die Abbildungs beginnen.
      Hinweis: Da der CO ₂ und Temperaturniveaus für die Phagozytose kritisch sind, ist es wichtig , auf dem Mikroskop Erhitzer dem Experiment vor , um den Umgebungsraum äquilibrieren.
   5. Legen Sie die Kammer schieben Sie die Zellen im Mikroskop - Inkubator - Gehäuse ins Gleichgewicht gebracht bei 37 ° C und 5% CO ₂ enthält.
   6. Führen Sie die Live - Darstellung ^{17, 18.}
      HINWEIS: Die Einstellungen für die Laserleistung (Verstärkung, pinhole, etc.) kann in Abhängigkeit von der Art der th variierene Mikroskop und Fluoreszenzsonde verwendet. Daher empfehlen wir die Beratung in der Bedienungsanleitung des Mikroskops für eine optimale Voraussetzung für Ihre Live - Bildgebung ^17,18.
      1. Verwenden der konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop (und die dazugehörige Software) für die Live-Darstellung. Verwenden Sie 63X 1.4NA Öl-Objektiv mit einer Loch von 1-1,1 Airy-Einheiten.
      2. Um die Bildgebung zu starten, verwendet, um das Hellfeld einen repräsentativen Bereich auf der Kammer Folie zu finden. Als nächstes wählen Sie das Feld, indem Sie auf die Software, um die Option für die Position klicken. Zum Nachweis von GFP in Spur 1 der Filtersatz bei 582 nm für 488-nm-Laser mit einem Strahlteiler verwendet, zu erfassen, Wellenlängen zwischen 488 und 582 nm.
      3. In Track 2 wählen einen Filter optimal für mCherry (RFP) einen Strahlteiler bei 578 nm und Wellenlängen zwischen 578 und 600 nm zu erkennen. Verwenden 488 nm und 578 nm-Laser mit 50% Laserleistung und einem Verstärkungsleistung von 600-700. Erhalten Sie Bilder alle 30 Sekunden für insgesamt 90 min.

Ergebnisse

Mikroskopbasierten Verfahren die verschiedenen Phasen der Phagozytose zu überwachen dargestellt. Die verschiedenen Veranstaltungen während der Phagozytose von verschiedenen fluoreszierenden Partikeln durch DC2.4 Zellen gezeigt. Unter Verwendung der Techniken, die hier beschrieben ist, untersuchten wir die Rolle von Sphingolipiden in den frühen Stadien der Phagozytose. Hierzu DC2.4 dendritischen Zellen genetisch defizient in Sptlc2, das Enzym, das den ersten und geschwindigkeitsbegrenzenden Schritt in dem Sphingolipid...

Diskussion

Professionelle Phagozyten, wie Makrophagen und dendritischen Zellen, verschlingen und zu beseitigen Krankheitserreger daher macht Phagozytose ein wichtiger Bestandteil des Abwehrsystems eindringen. Während dieses Prozesses durchlaufen Phagozyten umfangreiche Membran Reorganisation und Zytoskelett Umlagerung an ihrer Zelloberfläche ^{8, 19, 20.} Um diesem dynamischen Prozess zu verstehen, die Visualisierung der verschiedenen Phas...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144