Visualizzare le fasi iniziali della fagocitosi

Riepilogo

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Abstract

Il corpo dei mammiferi è dotata di vari strati di meccanismi che contribuiscono a difendersi dalle invasioni patogeni. Fagociti professionali del sistema immunitario - come i neutrofili, cellule dendritiche e macrofagi - mantengono la capacità innata di rilevare ed eliminare tali patogeni attraverso fagocitosi ^1. La fagocitosi coinvolge eventi coreografia di riorganizzazione della membrana e actina rimodellamento sulla superficie delle cellule ^{2, 3.} I fagociti interiorizzare con successo e sradicare molecole estranee solo quando sono soddisfatte tutte le fasi della fagocitosi. Questi passaggi includono il riconoscimento e vincolante del patogeno dai recettori pattern recognition (PRR) che risiede sulla superficie cellulare, formazione di tazza di fagocitosi attraverso actina-arricchito sporgenze membranose (pseudopodi) a circondare il particolato, e scissione della phagosome seguito da phagolysosome maturazione che risultati dellauccidendo del patogeno ^{3, 4.}

Imaging e quantificazione delle varie fasi della fagocitosi è strumentale per chiarire i meccanismi molecolari di questo processo cellulare. La presente manoscritto riporta metodi per studiare le diverse fasi della fagocitosi. Descriviamo un approccio microscopio-based per visualizzare e quantificare la formazione coppa fagocitica vincolante, e l'interiorizzazione di particolato dai fagociti. Come si verifica quando la fagocitosi recettori innate su fagociti incontrano ligandi su una particella bersaglio più grande di 0,5 micron, le analisi che presentiamo qui comprendono l'uso di patogeni funghi Candida albicans e altre particelle, come zymosan e perline IgG-rivestite.

Introduzione

Nonostante la continua esposizione agli agenti patogeni come batteri, virus e funghi, il nostro corpo è ben attrezzata con sistema immunitario che forniscono protezione contro le infezioni. Il sistema immunitario innato è la prima linea di difesa contro gli agenti patogeni invasori e si basa principalmente su fagociti che riconoscono e interiorizzano obiettivi stranieri.

La fagocitosi è un processo cellulare evolutivamente conservato che racchiude il engulfment di particelle indesiderate superiori a 0,5 micron. Fagociti esprimono una vasta gamma di recettori del sistema immunitario (noto anche come recettori pattern recognition, PRR) sulla superficie delle cellule che consentono loro di riconoscere i modelli molecolari associati ai patogeni (PAMPs) presenti sul patogeni prima di engulfment ^3. Il legame patogeni è seguito da recettore cluster sulla superficie cellulare e innesca la formazione di una tazza fagocitaria. Ciò si traduce in rimodellamento della membrana actina-driven che sporge in girol'obiettivo, alla fine avvolge e pizzicando-off per formare una discreta phagosomal vacuolo ^{2, 5.} Il phagosome matura poi e acidifica con la successiva fusione con ritardo endosomi e lisosomi che forma fagolisosoma ^6.

Anche se la fagocitosi è descritto come recettore-mediata e actina-event driven, questo processo si basa anche sulla modifica spazio-temporale dei lipidi che compongono la membrana plasmatica, come fosfoinositidi (PI) e sfingolipidi ^{7, 8.} Mentre polimerizzazione actina è dettato da un accumulo locale fosfoinositolo-4,5-bisfosfato (PI (4,5) P ₂₎ alla base della coppa fagocitica, actina depolimerizzazione dipende dalla conversione di (PI (4,5) P ₂ a fosfoinositolo-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P ₃₎ ^{3, 9.} Entrambe le modifichesono essenziali come la prima porta a un'estensione di successo del pseudopodi intorno al bersaglio e la Quest'ultimo consente affondamento di particelle nel citoplasma della fagocita ^10.

Le cellule che hanno la capacità di fagocitare sono o fagociti professionali, come macrofagi / monociti, granulociti neutrofili /, e le cellule dendritiche (DC) o fagociti non professionisti, come fibroblasti e cellule epiteliali ^11. Fagocitosi eseguita da tutti i fagociti svolge un ruolo centrale nel mantenimento dei tessuti e rimodellamento, mentre la fagocitosi eseguita da fagociti professionali è responsabile del coordinamento della risposta immunitaria innata e adattiva contro gli agenti patogeni. fagociti professionali non si limitano a fagocitare e uccidere l'agente patogeno, ma anche antigeni presenti alle cellule linfoidi del sistema immunitario adattativo. Ciò contribuisce al rilascio di citochine pro-infiammatorie e ad assunzione di cellule linfoidi, dunque ail successo blocco di infezione ^12.

tecniche biochimiche convenzionali sono state fondamentali per acquisire conoscenze per quanto riguarda il meccanismo molecolare di diversi processi cellulari durante la fagocitosi, come modificazioni post-traslazionali e varie associazioni ad alta affinità tra proteine. Tuttavia, è difficile ottenere informazioni sulle dinamiche spaziali e temporali di eventi fagocitarie utilizzando i metodi biochimici convenzionali. l'imaging cellulare dal vivo non solo ci consente di monitorare eventi cellulari in modo sensibile il tempo, ma anche ci permette di ottenere informazioni a livello di singola cellula. Qui si descrive un metodo per investigare le diverse fasi della fagocitosi, nonché di analizzare l'intero processo spatiotemporally usando la microscopia confocale.

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Protocollo

1. Preparazione di DC2.4 e RAW 264.7 cellule Lines

NOTA: La linea cellulare di macrofagi come RAW 264.7 e la linea di cellule dendritiche DC2.4 sono sia di origine murina, e le seguenti condizioni sono stati usati per far crescere le cellule.

1. Grow RAW 264.7 cellule in DMEM (Minimal mezzo di Eagle Dulbecco) supplementato con 10% inattivato siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in un incubatore umidificato con 5% di CO _2.
2. Crescere le cellule DC2.4 in condizioni simili a quello di RAW 264.7 cellule, tranne l'uso di media RPMI (Roswell Park Memorial Institute) integrata con L-glutammina, invece di DMEM.

2. Preparazione di coniugati fluorescenti Particolato: Beads C. albicans, Zymosan, IgG-rivestite

1. Crescere Candida albicans
   1. Seminare C. albicans ceppo SC5314 da uno stock di glicerolo congelato in 25 ml di YPD integrato con Uri (2% Bacto-peptone, 1%estratto di lievito, 2% di glucosio e 80 ug / ml di uridina) notte a 30 ° C.
      NOTA: Evitare che cresce la cultura Candida più di un OD ₆₀₀ del 12.
   2. Prendere 1 ml di C. albicans e spin giù a 2.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
   3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet con 1 ml di PBS.
   4. Raccogliere il pellet per centrifugazione a 2.000 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   5. Ripetere il punto 2.1.4.
   6. Calcolare la molteplicità di infezione (MOI) di C. albicans in relazione al numero dei fagociti e procedere con il test fagocitosi come descritto nella sezione 3. Una OD ₆₀₀ del 1 è equivalente a 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans per 1 ml.
      NOTA: Generazione di Candida-BFP è descritto in riferimento ^13.
2. Preparazione di Zymosan e perline IgG-rivestite
   NOTA: Zymosan è un β-glucano contenentifungine preparazione carboidrati particolato derivato da Saccharomyces cerevisiae. Zymosan è noto per evocare segnali infiammatori in macrofagi e cellule dendritiche, ed è stato ampiamente utilizzato in studi fagocitosi ^{13, 14, 15.}
   1. Brevemente vortice la provetta contenente il particolato, e un'aliquota una quantità sufficiente per un esperimento in una provetta da 1,5 ml.
      NOTA: in genere usiamo rapporto 1:10 (per una cella, aggiungere 10 particelle zymosan o perline IgG-rivestite).
   2. Aggiungere 1 ml di PBS freddo ghiaccio, e raccogliere le particelle mediante centrifugazione per 1 min a 10.000 x g.
   3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS ghiacciato.
   4. Ripetere i punti 2.2.2-2.2.3
      NOTA: Passare al punto 2.2.5 o conservare il tubo a 4 ° C fino al momento dell'uso.
   5. Sonicare particolato per 10 sec a ultrasuoni bagno sonicatore (120 V, 50-60 kHz) per evitare unaggregazione delle particelle NY.

3. fagocitosi

NOTA: La fagocitosi è un processo complesso che inizia con il legame delle particelle sulla superficie cellulare dei fagociti attraverso l'interazione di PRRs con ligandi sulla superficie della particella. Binding è seguito dal montaggio di actina e le sue proteine ​​associate al sito di contatto, e la formazione di una tazza fagocitaria. Il successivo smontaggio actina avviene al phagosome e provoca la engulfment completo del particolato. Di seguito si descrivono le varie fasi della fagocitosi.

1. binding Assay
   NOTA: Lo scopo di questo esperimento è quello di monitorare il primo passo di fagocitosi che coinvolge l'interazione tra i ligandi sulle particelle indicativi ei recettori sulle fagociti.
   1. Seme circa 5 x 10 ⁴ cellule in una diapositiva camera in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell'esperimento. Alterntivamente, le cellule piastra su vetrini (in 24 o formato a 12 pozzetti) o piastre a 96 pozzetti con fondo di vetro. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO _2.
      NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o una tecnica simile.
   2. Posizionare il vetrino camera (o piastra) a 10 ° C per 10 min.
   3. Rimuovere delicatamente il supporto da ciascun pozzetto con una pipetta o di aspirazione.
      ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio attentamente ciascun pozzetto di un sistema coprioggetti camerata è piccolo; è facile per perturbare le cellule con la punta di una pipetta o un forte flusso d'aria di un aspiratore.
   4. Mescolare le polveri fluorescente con un mezzo di coltura cellulare (preparato come descritto sopra). Aggiungere Candida -BFP (ad una MOI di 10), fluorescenza coniugato-zymosan o lattice perline-rabbit IgG-FITC (10 particelle per cella) alle cellule. Utilizzare un volume finale di 200 microlitri mezzi per una camera bene a garantire tutte le cellule sono coperti.
   5. Spin giù la diapositiva da camera presso 277xg per 3 min a 10 ° C.
      NOTA: Questo passaggio centrifugazione contribuisce ad aumentare il contatto tra le particelle e le cellule, e sincronizza il processo di associazione.
   6. Trasferire immediatamente il vetrino camera ad un incubatore umidificato a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 5 min.
   7. Rimuovere il vetrino da camera dal termostato e aspirare i media.
   8. Lavare le cellule 3 volte con PBS ghiacciato.
      NOTA: controllare la presenza di particelle non legate con un microscopio ottico e lavare più volte con PBS, se necessario. È essenziale per rimuovere le particelle non legate dal pozzo per minimizzare il rumore di fondo durante l'analisi.
   9. Fissare cellule aggiungendo 500 microlitri 4% paraformaldeide (PFA) diluito in PBS incubando per 30 minuti a temperatura ambiente.
      ATTENZIONE: Questo passaggio richiede l'utilizzo di PFA 4% che è altamente tossico, corrosivo, e il potenziale carcinogeno. Una corretta si deve usare cautela quando si usa questo liquido. Inoltre, proteggere i campioni dalla luce.
   10. Lavare le cellule con l'aggiunta di 500 ml di PBS nella camera e aspirare lentamente la soluzione.
   11. Ripetere 3.1.9 passo due volte.
       NOTA: A questo punto, riempire ogni flacone immediatamente dopo la rimozione della precedente PBS.
   12. Arrestare il fissaggio mediante incubazione con 500 pl di 50 mM NH ₄ Cl in PBS per 10 min.
   13. Lavare le cellule due volte con PBS come descritto al punto 3.1.10.
   14. Permeabilize cellule aggiungendo 250 microlitri tampone di legame (0,1% saponina, 0,2% BSA in PBS) per 30 min a temperatura ambiente.
   15. Stain F-actina aggiungendo fluorescente falloidina coniugato (diluito 1: 500 in tampone vincolante). Incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente.
   16. Lavare le cellule tre volte con PBS come descritto al punto 3.1.10.
   17. Catturare immagini utilizzando un microscopio confocale (obiettivo 63X e 402 nm e 488 nm laser) e analizzare le immagini utilizzando ImageJ ^16.
       NOTA: legame Una particella successo è caratterizzato dalla presenza di un cu fagocitariap nel luogo dove il contatto particolato cellula fagocitica (Figura 1). Vedere il punto 3.2.5.
2. Fagocitosi assorbimento Assay
   NOTA: Questo esperimento è stato progettato per monitorare l'internalizzazione completa di particelle etichettate fluorescenza dai fagociti utilizzando la microscopia confocale (Figura 2).
   1. Seme circa 5 x 10 ⁴ cellule in una diapositiva camera in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell'esperimento. In alternativa, le cellule piastra su vetrini (in 24 o formato a 12 pozzetti) o piastre a 96 pozzetti con fondo di vetro. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO _2.
      NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o una tecnica simile.
   2. Conservare le diapositive camera (o piastra) a 10 ° C per 10 min.
      NOTA: raffreddamento è necessario al fine di bloccare l'endocitosi e fagocitosi indesiderate, e successivamente ad una fagocitosi sincronizzato.
   3. Perfpassi ORM da 3.1.3 a 3.1.5
   4. Trasferire il vetrino camera ad una 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO _2, e incubare per diversi tempi. Fix cellule dopo l'infezione 30, 60 e 90 min dopo. Osservare C. albicans iniziano a formarsi ife a livello post infezione 60 min; fagociti cominciano a mostrare la morte cellulare (pyroptosis) dopo 90 min ^8.
      NOTA: Questa è una raccomandazione e ottimizzazione è essenziale a seconda del tipo di cellula e del particolato utilizzato.
   5. Eseguire i passaggi da 3.1.7 a 3.1.15. Analizzare le immagini utilizzando ImageJ ^16.
      NOTA: un assorbimento successo è caratterizzato da una interiorizzazione completa di particolato all'interno del citoplasma di un fagociti (Figura 2). Colorazione fagociti con pennarello superficie cellulare come falloidina contribuisce a delineare il contorno delle cellule. È anche essenziale per eseguire z-stack per determinare se il particolato è destinata a superficie cellulare o completely interiorizzato.
3. Immagini dal vivo della fagocitosi
   NOTA: In questo protocollo si descrive l'utilizzo di microscopia confocale per catturare le diverse fasi della fagocitosi utilizzando zymosan fluorescente coniugato. Usiamo la linea di cellule dendritiche DC2.4 che esprime stabilmente mCherry-tag F-actina ^8, un biosensore che mostra la distribuzione di actina filamentosa nelle cellule viventi. Poiché fagocitosi è un processo actina-driven vivo imaging in questa cella non solo permette di catturare il movimento e la dinamica di rete F-actina, ma anche di visualizzare i diversi eventi fagociti all'interno delle cellule viventi (Figura 3, Film 1).
   1. Seme circa 5 x 10 ⁴ cellule in una diapositiva camera ad una concentrazione in modo che siano il 60-70% confluenti al momento dell'esperimento. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C incubatore umidificato con 5% di CO _2.
      NOTA: Le cellule possono essere contate con emocitometro o untecnica simile.
   2. Mantenere i vetrini camera su ghiaccio per 10 min.
      NOTA: raffreddamento è necessario per bloccare l'assorbimento indesiderato, e di avere una fagocitosi sincronizzato.
   3. Eseguire i passaggi da 3.1.3 a 3.1.5
   4. Pre-riscaldare la fase di microscopio a 37 ° C ed equilibrare la camera con 5% di CO _2. Attendere 30-45 min per la temperatura e la CO ₂ si stabilizzi prima di iniziare l'imaging.
      NOTA: Poiché i CO ₂ e temperatura livelli sono critici per la fagocitosi, è importante accendere il riscaldamento del microscopio prima dell'esperimento per equilibrare la camera ambientale.
   5. Posizionare il vetrino camera contenente le cellule nel contenitore microscopio incubatore equilibrata a 37 ° C e 5% CO _2.
   6. Esibirsi dal vivo di immagini ^{17, 18.}
      NOTA: Le impostazioni per la potenza del laser (guadagno, pinhole, ecc) può variare a seconda del tipo di the microscopio e sonda fluorescente utilizzati. Pertanto, si consiglia di consultare il manuale del microscopio per la condizione ottimale per la vostra imaging dal vivo ^17,18.
      1. Utilizzare microscopio confocale a scansione laser (e il relativo software) per l'imaging dal vivo. Utilizzare obiettivo olio 63X 1.4NA con un foro stenopeico di 1-1.1 unità Airy.
      2. Per avviare l'imaging utilizzato il campo luminoso di trovare una regione rappresentante sul vetrino da camera. Avanti, selezionare il campo facendo clic sull'opzione Posizione sulla software. Per rilevare GFP nella pista 1 usato il set di filtri per 488 nm laser con un divisore di fascio a 582 nm, per rilevare le lunghezze d'onda tra 488 e 582 nm.
      3. In Pista 2 selezionare un filtro set ottimale per mCherry (RFP) utilizzando un divisore di fascio a 578 nm e rilevare le lunghezze d'onda tra 578 e 600 nm. Utilizzare 488 nm e 578 nm laser con il 50% di potenza laser e un'uscita guadagno di 600-700. Ottenere immagini ogni 30 secondi per un totale di 90 min.

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Risultati

Metodo Microscopio a base di monitorare le diverse fasi della fagocitosi è presentato. Vengono visualizzati i diversi eventi durante la fagocitosi delle varie particelle fluorescenti da parte delle cellule DC2.4. Utilizzando le tecniche qui descritte, abbiamo studiato il ruolo degli sfingolipidi nelle prime fasi della fagocitosi. A questo scopo, DC2.4 cellule dendritiche geneticamente carenti di Sptlc2, l'enzima che catalizza la prima e limitante passo nella via di biosintesi degli sfingolipidi, sono stati utilizza...

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Discussione

fagociti professionali, come i macrofagi e le cellule dendritiche, inghiottire e di eliminare gli agenti patogeni d'invasione rendendo quindi la fagocitosi una componente importante del sistema di difesa dell'ospite. Durante questo processo fagociti vengono sottoposti a riorganizzazione membrana e riarrangiamento citoscheletro alla loro superficie cellulare ^{8, 19, 20.} Per comprendere meglio questo processo dinamico, vis...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144