Visualizando os estágios iniciais da fagocitose

Resumo

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Resumo

O corpo dos mamíferos está equipado com várias camadas de mecanismos que ajudam a defender de invasões de patógenos. Fagócitos profissionais do sistema imunitário - neutrófilos, tais como células dendríticas, macrófagos e - manter a capacidade inata para detectar e eliminar tais agentes patogénicos invasores através de fagocitose ^1. Fagocitose envolve eventos coreografia de reorganização da membrana e remodelação da actina na superfície da célula ^{2, 3.} Fagócitos internalizar com sucesso e erradicar moléculas estranhas somente quando todas as fases de fagocitose são cumpridas. Estas etapas incluem o reconhecimento e a ligação do patogénio pelos receptores de reconhecimento de padrões (SRRS) residem na superfície celular, formação de copo fagocítica através de saliências membranosas enriquecido-actina (pseudópodes) para envolver as partículas, e cisão do fagossoma seguida de maturação fagolisossomo que resulta namatando do patógeno ^{3, 4.}

Imagem e quantificação de vários estágios de fagocitose é instrumental para elucidar os mecanismos moleculares deste processo celular. O presente manuscrito relata métodos para estudar as diferentes fases de fagocitose. Nós descrevemos uma abordagem baseada em microscópio para visualizar e quantificar a, formação de copo fagocitária de ligação, ea internalização de partículas pelos fagócitos. Como fagocitose ocorre quando os receptores inatos em células fagocíticas encontrar ligandos-alvo numa partícula maior do que 0,5 fim, os ensaios aqui apresentados compreendem a utilização de fungos patogénicos Cândida albicans e outras partículas, tais como grânulos zimosano e IgG-revestidos.

Introdução

Apesar de a exposição contínua a agentes patogénicos, tais como bactérias, vírus e fungos, o corpo está bem equipado com o mecanismo imunitário que proporcionam protecção contra a infecção. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra agentes patogénicos invasores e baseia-se principalmente em células fagocíticas que reconhecem e internalizam alvos estranhos.

A fagocitose é um processo celular evolutivamente conservada que engloba o englobamento de partículas não desejadas superiores a 0,5 uM. As células fagocíticas expressar uma vasta gama de receptores imunes (também conhecidos como receptores de reconhecimento de padrões, PRRs) na superfície da célula que lhes permitam reconhecer padrões moleculares associados a agentes patogénicos (PAMPs) presentes sobre os agentes patogénicos anteriores para imersão ^3. A ligação patógeno é seguido por agrupamento de receptores na superfície da célula e desencadeia a formação de um copo fagocitária. Isso resulta em remodelação membrana impulsionado-actina que se projeta em torno deo alvo, eventualmente, envolvendo-o e beliscando-off para formar um vacúolo phagosomal discreta ^{2, 5.} O fagossomo então amadurece e acidifica por fusão posterior com endossomas tardios e lisossomas que formam fagolisossomo ^6.

Embora a fagocitose é descrito como um evento mediado por receptores e orientada para a actina, este processo também depende de modificação espacial-temporal de lípidos que compõem a membrana plasmática, como fosfoinositídeos (IPs) e esfingolipídeos ^{7, 8.} Embora a polimerização da actina é ditada por uma acumulação local de fosfoinositol-4,5-bifosfato (PI (4,5) P ₂₎ na base do copo fagocitária, actina despolimerização depende da conversão de (PI (4,5) P ₂ a fosfoinositol-3,4,5-bifosfato (PI (3,4,5) P ₃₎ ^{3, 9.} Ambas as modificaçõessão essenciais como os antigos leva a extensão bem sucedida de pseudopods ao redor do alvo e este último permite afundar de partículas no citosol da phagocyte ^10.

As células que possuem a capacidade de fagocitar ou são fagócitos profissionais, como macrófagos / monócitos, granulócitos neutrófilos, / e células dendríticas (CDs) ou os fagócitos não profissional, tais como fibroblastos e células epiteliais ^11. A fagocitose realizada por todos os fagócitos desempenha um papel central na manutenção e remodelação de tecidos, enquanto que a fagocitose realizada pelos fagócitos profissionais é responsável pela coordenação da resposta imune inata e adaptativa contra os agentes patogénicos. fagócitos profissionais que não apenas engolir e matar o patógeno, mas também apresentam antigénios às células linfóides do sistema imunitário adaptativo. Isso contribui para a liberação de citocinas pró-inflamatórias e ao envolvimento de células linfóides, portanto, levando ao bloqueio de sucesso de infecção ^{de 12.}

técnicas bioquímicas convencionais têm sido fundamentais para ganhar conhecimento sobre o mecanismo molecular de diferentes processos celulares durante a fagocitose, tais como modificações pós-translacionais e diversas associações de alta afinidade entre proteínas. No entanto, é difícil a obtenção de informações sobre as dinâmicas temporais e espaciais de eventos fagocíticas usando os métodos bioquímicos convencionais. imagens de células vivas não só nos permite monitorar eventos celulares de uma forma sensível tempo, mas também nos permite obter informações em um nível única célula. Descrevemos aqui um método para investigar os diferentes estágios de fagocitose, bem como para analisar todo o processo de espaço-temporalmente utilizando microscopia confocal.

Protocolo

1. Preparação de DC2.4 e RAW Lines 264,7 celulares

NOTA: A linha de células semelhantes a macrófagos RAW 264.7 e o DC2.4 linha de células dendríticas são tanto de origem murina, e as seguintes condições foram usadas para crescer as células.

1. Cultivar células RAW 264.7 em DMEM (meio de Eagle mínimo de Dulbecco) suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO _2.
2. Cultivar células DC2.4 em condições semelhantes com o de células RAW 264.7, excepto meio de utilização de RPMI (Roswell Park Memorial Institute) suplementado com L-glutamina em vez de DMEM.

2. Preparação de fluorescentes conjugados Partículas: Beads C. albicans, zimosano, IgG-revestidas

1. Crescer Candida albicans
   1. Inocular C. albicans estirpe SC5314 a partir de um stock de glicerol congelado em 25 ml de YPD suplementado com Uri (2% de Bacto-peptona, 1%extracto de levedura, 2% de glucose e 80 ug / ml de uridina) durante a noite a 30 ° C.
      NOTA: Evite a crescer a cultura Candida mais do que uma OD ₆₀₀ de 12.
   2. Tomar 1 ml da C. albicans e girá-lo para baixo a 2.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet com 1 ml de PBS.
   4. Recolhe-se o sedimento por centrifugação a 2000 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   5. Repita o passo 2.1.4.
   6. Calcula-se a multiplicidade de infecção (MOI) de C. albicans em relação ao número de fagócitos e prosseguir com o ensaio de fagocitose, como descrito na secção 3. um OD ₆₀₀ de 1 é equivalente a 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans por 1 ml.
      NOTA: Geração de Candida-BFP é descrito na referência ^13.
2. Preparação de Zymosan e grânulos de IgG-revestidas
   NOTA: Zymosan é um contendo β-glucana-preparação de hidratos de carbono em partículas fúngica que derivada a partir de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan é conhecido por provocar sinais inflamatórios em macrófagos e células dendríticas, e tem sido amplamente utilizado em estudos de fagocitose ^{13, 14, 15.}
   1. Resumidamente vortex do tubo que contém as partículas, e aliquotar numa quantidade suficiente para um experimento em um tubo de 1,5 ml.
      NOTA: Normalmente usamos 1:10 (para uma célula, adicionar 10 partículas de zimosan ou contas de IgG-revestidas).
   2. Adicionar 1 ml de PBS gelado, e recolher as partículas por centrifugação durante 1 min a 10.000 x g.
   3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em PBS 1 ml de gelo-frio.
   4. Repita os passos 2.2.2-2.2.3
      NOTA: Vá para a etapa 2.2.5 ou guarde o tubo a 4 ° C até o uso.
   5. Sonicar as partículas durante 10 s em sonicador de banho de ultra-sons (120 V, 50-60 kHz), a fim de evitar umaNY agregação das partículas.

3. A fagocitose

NOTA: A fagocitose é um processo complexo que começa com a ligação das partículas na superfície celular dos fagócitos através da interacção de PRRs com ligandos sobre a superfície da partícula. A ligação é seguida pela montagem de actina e das suas proteínas associadas na local de contacto, e a formação de um copo fagocitária. A desmontagem actina subsequente ocorre no fagossoma e resulta na imersão completa do particulado. Abaixo descrevemos as diferentes fases de fagocitose.

1. Ensaio de Ligação
   NOTA: O objectivo desta experiência é monitorar o primeiro passo de fagocitose que envolve a interacção entre os ligandos alvo nas partículas e os receptores nos fagócitos.
   1. Semente de cerca de 5 x 10 ⁴ células em uma lâmina de câmara de modo que eles são de 60-70% confluentes no momento da experiência. Alterntivamente, células da placa em lamelas (24 ou em formato de 12 poços) ou placas de 96 poços com fundo de vidro. Incubar as células durante a noite a 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO _2.
      NOTA: As células podem ser contadas usando hemocitômetro ou uma técnica semelhante.
   2. Colocar a lâmina da câmara (ou placa) a 10 ° C durante 10 min.
   3. Remova cuidadosamente o meio de cada poço com uma pipeta ou aspirador.
      ATENÇÃO: Execute esta etapa com cuidado como cada poço de um sistema lamela câmaras é pequeno; é fácil de perturbar as células com a ponta de uma pipeta ou um forte fluxo de ar de um aspirador.
   4. Misturar as partículas marcadas com fluorescência com um meio de cultura de células (preparado como descrito acima). Adicionar -BFP Cândida (a uma MOI de 10), fluorescentemente grânulos-coelho conjugado com zimosano ou látex de IgG-FITC (10 partículas por célula) das células. Utilizar um volume final de 200 ul de meios de comunicação uma câmara bem para garantir que todas as células são cobertas.
   5. Gire para baixo o slide câmara a 277xg durante 3 min a 10 ° C.
      NOTA: Este passo de centrifugação ajuda a aumentar o contato entre as partículas e as células, e sincroniza o processo de ligação.
   6. Imediatamente Transferir as lâminas para uma câmara incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante 5 min.
   7. Remover o slide câmara da incubadora e aspirar os meios de comunicação.
   8. Lavam-se as células 3x com PBS gelado.
      NOTA: Verifique a presença de partículas livres, com um microscópio de luz e lavar mais vezes com PBS, se necessário. É essencial para remover as partículas não ligadas a partir do bem para minimizar o ruído de fundo durante a análise.
   9. Fixar as células por adição de 500 ul de paraformaldeido a 4% (PFA) diluída em PBS, por incubação durante 30 min à temperatura ambiente.
      CUIDADO: Este passo requer o uso de PFA a 4%, que é altamente tóxico, corrosivo e potencial cancerígeno. cuidado apropriado deve ser tomado ao usar este líquido. Além disso, proteger as amostras da luz.
   10. Lavam-se as células por adição de 500 ul de PBS para dentro da câmara e aspirar a solução suavemente.
   11. Repita 3.1.9 etapa duas vezes.
       NOTA: Nesta etapa, encher cada frasco imediatamente após a remoção do PBS anterior.
   12. Pare a fixação por incubação com 500 ul de 50 mM de NH ₄ Cl em PBS, durante 10 min.
   13. Lavar as células duas vezes com PBS como descrito no passo 3.1.10.
   14. Permeabilizar as células por adição de 250 uL de tampão de ligação (0,1% de saponina, 0,2% de BSA em PBS) durante 30 min à temperatura ambiente.
   15. Mancha F-actina por adição de faloidina conjugada fluorescentemente (diluído 1: 500 em tampão de ligação). Incubar as células durante 1 h à temperatura ambiente.
   16. Lave as células três vezes com PBS como descrito no passo 3.1.10.
   17. Capturar imagens usando um microscópio confocal (objetiva 63X e 402 nm e 488 nm do laser) e analisar as imagens usando ImageJ ^16.
       NOTA: A ligação Uma partícula de sucesso é caracterizada pela presença de um cu fagocitáriap no local onde o contacto da célula fagocítica partículas (Figura 1). Veja o passo 3.2.5.
2. Fagocitose de Captação de Ensaio
   NOTA: Este experimento é projetado para monitorar a internalização completa das partículas marcadas fluorescentes pelos fagócitos meio de microscopia confocal (Figura 2).
   1. Semente de cerca de 5 x 10 ⁴ células em uma lâmina de câmara de modo que eles são de 60-70% confluentes no momento da experiência. Alternativamente, células da placa em lamelas (24 ou em formato de 12 poços) ou placas de 96 poços com fundo de vidro. Incubar as células durante a noite a 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO _2.
      NOTA: As células podem ser contadas usando hemocitômetro ou uma técnica semelhante.
   2. Manter as lâminas de câmara (ou placa) a 10 ° C durante 10 min.
      NOTA: Arrefecimento é necessário, a fim de bloquear a endocitose, bem como a fagocitose indesejados, e, subsequentemente, ter uma fagocitose sincronizado.
   3. perfpassos ORM de 3.1.3 a 3.1.5
   4. Transferir as lâminas para uma câmara de 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO _2, e incubar por diferentes pontos de tempo. Fix células após a infecção 30, 60 e 90 min post. Observe C. albicans começam a se formar hifas na infecção pós 60 min; fagócitos começam a mostrar a morte celular (pyroptosis) após 90 min ^8.
      NOTA: Este é uma recomendação, e optimização é essencial, dependendo do tipo de célula e as partículas usadas.
   5. Execute os passos a partir 3.1.7 a 3.1.15. Analisar imagens usando ImageJ ^16.
      NOTA: uma implantação bem sucedida é caracterizado por uma internalização completa de um material em partículas dentro do citoplasma de um fagócito (Figura 2). A coloração dos fagócitos com marcador da superfície celular, tais como faloidina ajuda a delinear o contorno das células. É também essencial para realizar z pilhas a fim de determinar se as partículas são obrigadas a superfície celular ou completely internalizado.
3. Imagens ao vivo da fagocitose
   NOTA: Neste protocolo, descrevem a utilização de microscopia confocal para capturar as diferentes fases de fagocitose usando zimosan conjugado fluorescente. Usamos a linha de células dendríticas DC2.4 que expressa estavelmente mCherry marcada com F-actina ^8, um biossensor que mostra a distribuição de actina filamentosa em células vivas. Desde a fagocitose é um processo orientado a actina a imagens ao vivo nesta célula não só nos permite captar o movimento ea dinâmica da rede de F-actina, mas também para visualizar os diferentes eventos fagocíticas no interior das células vivas (Figura 3, Movie 1).
   1. Semente de cerca de 5 x 10 ⁴ células em uma lâmina de câmara com uma concentração de modo que eles são de 60-70% confluentes no momento da experiência. Incubar as células durante a noite a 37 ° C incubadora humidificada com 5% de CO _2.
      NOTA: As células podem ser contadas usando hemocitômetro ou umtécnica similar.
   2. Manter as lâminas de câmara em gelo durante 10 min.
      NOTA: Arrefecimento é necessário, a fim de bloquear a absorção indesejável, e tem uma fagocitose sincronizado.
   3. Execute as etapas de 3.1.3 a 3.1.5
   4. Pré-aquecer o estágio de microscópio de 37 ° C e equilibrar a câmara com 5% de CO _2. Espera 30-45 min para a temperatura e o CO ₂ a estabilizar antes de iniciar a geração de imagens.
      NOTA: Uma vez que os CO ₂ e temperatura níveis são críticos para a fagocitose, é importante ligar o aquecedor do microscópio antes do experimento para equilibrar a câmara ambiental.
   5. Colocar a lâmina câmara contendo as células no recinto microscópio incubador equilibrado a 37 ° C e 5% de CO _2.
   6. Realizar imagem ao vivo ^{17, 18.}
      NOTA: As definições para a potência do laser (ganho, do furo de pino, etc.) podem variar, dependendo do tipo de the microscópio e sonda fluorescente usada. Portanto, recomendamos consultar o manual do microscópio para a condição ideal para a sua imagem ao vivo ^17,18.
      1. Use microscópio confocal de varredura a laser (eo software associado) para geração de imagens ao vivo. Use objectivo óleo 63X 1.4NA com um furo de 1-1,1 unidades arejado.
      2. Para iniciar a criação de imagens, utilizado o campo brilhante para encontrar uma região representativa no slide câmara. Em seguida, selecione o campo clicando na opção Posição sobre o software. Para detectar GFP na Pista 1 usado o conjunto de filtro para 488 nm do laser com um divisor de feixe de 582 nm, para detectar comprimentos de onda entre 488 e 582 nm.
      3. No Track 2 selecionar um conjunto de filtros ideal para mCherry (RFP), utilizando um divisor de feixe de 578 nm e detectar comprimentos de onda entre 578 e 600 nm. Use 488 nm e 578 nm lasers com potência de laser de 50% e uma saída de ganho de 600-700. Obtenção de imagens a cada 30 seg para um total de 90 min.

Resultados

método baseado em microscópio para monitorizar as diferentes fases da fagocitose é apresentada. Os diferentes eventos durante a fagocitose de várias partículas fluorescentes por células DC2.4 são mostrados. Utilizando as técnicas descritas aqui, foram investigados o papel de esfingolípidos nas fases iniciais de fagocitose. Para este fim, células dendríticas DC2.4 geneticamente deficientes em Sptlc2, a enzima que catalisa o primeiro e limitante da velocidade passo na via de biossíntese dos esfingolípidos, fo...

Discussão

fagócitos profissionais, tais como macrófagos e células dendríticas, engolir e eliminar agentes patogénicos invasores, portanto, fazer a fagocitose um componente importante do sistema de defesa do hospedeiro. Durante este processo de submeter a fagócitos extensa reorganização da membrana e o rearranjo do citoesqueleto na sua superfície celular ^{8, 19, 20.} Para entender melhor este processo dinâmico, a visualização da...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144