Visualiser les premiers stades de la phagocytose

Résumé

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

Résumé

Le corps d'un mammifère est équipé de diverses couches de mécanismes qui aident à se défendre contre les invasions de pathogènes. Phagocytes professionnels du système immunitaire - telles que les neutrophiles, les cellules dendritiques et les macrophages - conservent la capacité innée à détecter et à éliminer les pathogènes envahissants par phagocytose ^1. Phagocytose implique des événements chorégraphiés de réorganisation de la membrane et l' actine remodelage à la surface des cellules ^{2, 3.} Phagocytes internaliser avec succès et éliminer les molécules étrangères que lorsque toutes les étapes de la phagocytose sont remplies. Ces étapes comprennent la reconnaissance et la liaison de l'agent pathogène par les récepteurs de reconnaissance des formes (PRR) demeurant à la surface cellulaire, la formation de la coupe phagocytaire par actine enrichi protubérances membranaires (de pseudopodes) pour entourer les particules, et la scission du phagosome suivie par phagolysosome maturation qui les résultats dans letuant de l'agent pathogène ^{3, 4.}

L'imagerie et la quantification des différentes étapes de la phagocytose joue un rôle déterminant pour l'élucidation des mécanismes moléculaires de ce processus cellulaire. Le présent manuscrit rapporte des méthodes pour étudier les différentes phases de la phagocytose. Nous décrivons une approche basée sur un microscope à visualiser et de quantifier la liaison, la formation de tasse phagocytaire, et l'internalisation des particules par les phagocytes. Phagocytose se produit lorsque les récepteurs des cellules phagocytaires innées rencontrent des ligands sur une particule cible supérieure à 0,5 um, les essais présentés ici comprennent l'utilisation de champignons pathogènes de Candida albicans et d' autres particules telles que des billes zymosan et recouvertes d' IgG.

Introduction

En dépit de l'exposition continue à des agents pathogènes tels que les bactéries, les virus et les champignons, notre corps est bien équipé avec un mécanisme immunitaire qui offrent une protection contre l'infection. Le système immunitaire inné est la première ligne de défense contre les agents pathogènes envahisseurs et repose principalement sur les cellules phagocytaires qui reconnaissent et internalisent des cibles étrangères.

La phagocytose est un processus cellulaire évolutivement conservée qui englobe l'engloutissement de particules indésirables supérieures à 0,5 um. Les cellules phagocytaires expriment un large éventail de récepteurs immunitaires (également appelés récepteurs de reconnaissance des formes, PRR) à la surface des cellules qui leur permettent de reconnaître des modèles moléculaires associés à des pathogènes (PAMP) présents sur les agents pathogènes avant engloutissement ^3. La liaison pathogène est suivie par le regroupement des récepteurs à la surface des cellules et provoque la formation d'une coupelle phagocytaire. Cela se traduit par le remodelage de la membrane entraînée actine qui fait saillie versla cible, éventuellement enveloppant et pincer-off pour former un phagosome discret vacuole ^{2, 5.} Phagosome et mûrit ensuite acidifie par fusion ultérieure avec les endosomes tardifs et les lysosomes qui forme phagolysosome ^6.

Bien que la phagocytose est décrite comme événement médié par le récepteur et entraîné actine, ce procédé repose également sur la modification spatio-temporelle des lipides composant la membrane plasmique, tels que les phosphoinositides (PI) et de sphingolipides ^{7, 8.} Alors que la polymérisation de l' actine est dictée par une accumulation locale de phosphoinositol-4,5-bisphosphate (PI (4,5) _P2) à la base de la coupelle de phagocytose, l' actine dépolymérisation dépend de la conversion de (PI (4,5) P ₂ à phospho-3,4,5-biphosphate (PI (3,4,5) P ₃₎ ^{3, 9.} Les deux modificationssont essentiels comme les anciens conduit à l' extension réussie de pseudopodes autour de la cible et celle - ci permet d' amortissement de particules dans le cytosol du phagocyte ^10.

Les cellules qui ont la capacité de phagocytose sont soit des phagocytes professionnels, comme les macrophages / monocytes, les granulocytes neutrophiles et / cellules dendritiques (CD) ou les phagocytes non professionnels, tels que les fibroblastes et les cellules epitheliales ^11. Phagocytose effectué par tous les phagocytes joue un rôle central dans l'entretien des tissus et le remodelage, tandis que la phagocytose effectuée par phagocytes professionnels est responsable de la coordination de la réponse immunitaire innée et adaptative contre les pathogènes. phagocytes professionnels ne phagocytent pas seulement et tuer l'agent pathogène, mais aussi des antigènes présents sur les cellules lymphoïdes du système immunitaire adaptatif. Cela contribue à la libération de cytokines pro-inflammatoires et à l'engagement des cellules lymphoïdes, conduisant donc àle blocus succès de l' infection ^12.

techniques biochimiques classiques ont contribué à l'acquisition de connaissances en ce qui concerne le mécanisme moléculaire de différents processus cellulaires au cours de la phagocytose, telles que des modifications post-traductionnelles et diverses associations de haute affinité entre les protéines. Cependant, il est difficile d'obtenir des informations sur la dynamique spatiale et temporelle des événements phagocytaires en utilisant les méthodes biochimiques classiques. imagerie cellulaire en direct non seulement nous permet de suivre les événements cellulaires d'une manière sensible à la fois, mais aussi nous permet d'obtenir de l'information au niveau de la cellule unique. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier les différents stades de la phagocytose, ainsi que d'analyser l'ensemble du processus spatio-temporelle en utilisant la microscopie confocale.

Protocole

1. Préparation de DC2.4 et RAW 264,7 lignées cellulaires

NOTE: La lignée cellulaire macrophage RAW 264.7 et dendritique DC2.4 lignée cellulaire sont à la fois origine murine, et les conditions suivantes ont été utilisées pour cultiver les cellules.

1. Cultiver des cellules RAW 264.7 dans du DMEM (milieu de Eagle minimal de Dulbecco) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal inactivé (FBS) à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO _2.
2. Cultiver les cellules DC2.4 dans des conditions similaires avec celle des cellules RAW 264.7, sauf l'utilisation RPMI (Roswell Park Memorial Institute) supplémenté avec de la L-glutamine au lieu de DMEM.

2. Préparation des fluorescents Conjugués Particules: Perles C. albicans, zymosan, recouvertes d' IgG

1. Growing Candida albicans
   1. Inoculer souche C. albicans SC5314 à partir d' un stock de glycérol congelé dans 25 ml de YPD supplémenté avec Uri (2% de Bacto-peptone, 1%extrait de levure, 2% de glucose et 80 pg / ml d'uridine) pendant une nuit à 30 ° C.
      REMARQUE: Évitez de plus en plus la culture Candida plus d'une DO ₆₀₀ de 12.
   2. Prendre 1 ml du C. albicans et de tourner vers le bas à 2000 xg pendant 5 min à température ambiante.
   3. Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 1 ml de PBS.
   4. Recueillir le culot par centrifugation à 2000 g pendant 5 min à température ambiante.
   5. Répétez l'étape 2.1.4.
   6. Calculer la multiplicité d'infection (MOI) de C. albicans par rapport au nombre de phagocytes et procéder à l'essai de phagocytose telle que décrite dans la section 3. Une _DO600 de 1 équivaut à 2,5 x 10 ⁷ Candida albicans par 1 ml.
      NOTE: La génération de Candida-BFP est décrite dans la référence ^13.
2. Préparation de zymosan et perles recouvertes d' IgG
   NOTE: zymosan est un contenant β-glucanepréparation d' hydrate de carbone particulaire fongique qui provient de Saccharomyces cerevisiae. Zymosan est connu pour évoquer des signaux inflammatoires dans les macrophages et les cellules dendritiques, et il a été largement utilisé dans les études de phagocytose ^{13, 14, 15.}
   1. En bref vortex le tube qui contient la matière particulaire et aliquoter une quantité suffisante pour une expérience dans un tube de 1,5 ml.
      NOTE: En règle générale, nous utilisons un rapport de 1:10 (pour une cellule, ajouter 10 particules de zymosan ou des billes recouvertes d'IgG).
   2. Ajouter 1 ml de PBS glacé, et collecter les particules par centrifugation pendant 1 min à 10 000 x g.
   3. Aspirer le surnageant et resuspendre le culot dans du PBS 1 ml glacée.
   4. Répétez les étapes 2.2.2-2.2.3
      REMARQUE: Passez à l'étape 2.2.5 ou stocker le tube à 4 ° C jusqu'à utilisation.
   5. Soniquer les particules pendant 10 secondes en ultrasons sonicateur de bain (120 V, 50-60 kHz) afin d'éviter unel'agrégation des particules ny.

3. phagocytose

REMARQUE: La phagocytose est un processus complexe qui commence avec la fixation des particules sur la surface cellulaire des phagocytes par l'interaction du SDRP avec des ligands sur la surface de la particule. La liaison est suivie par l'assemblage de l'actine et ses protéines associées au site de contact, et la formation d'une tasse phagocytaire. Le démontage ultérieur a lieu à l'actine phagosome et aboutit à l'engloutissement complet de la matière particulaire. Ci-dessous, nous décrivons les différentes étapes de la phagocytose.

1. Essai de liaison
   NOTE: Le but de cette expérience est de surveiller la première étape de la phagocytose qui implique l'interaction entre les ligands sur les particules cibles et les récepteurs sur les phagocytes.
   1. Ensemencer environ 5 x 10 ⁴ cellules dans une glissière de la chambre afin qu'elles soient confluentes à 60 à 70% au moment de l'expérience. Alterntivement, les cellules de la plaque sur les bordereaux de couverture (en 24- ou en format 12 puits) ou plaques à 96 puits à fond de verre. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO _2.
      NOTE: Les cellules peuvent être comptées en utilisant un hémocytomètre ou une technique similaire.
   2. Placer la lame de la chambre (ou une plaque) à 10 ° C pendant 10 min.
   3. Retirez délicatement le milieu de chaque puits à l'aide d'une pipette ou aspirateur.
      ATTENTION: Effectuez cette étape soigneusement que chaque puits d'un système de coverglass chambré est petit; il est facile de perturber les cellules avec la pointe d'une pipette ou d'un fort flux d'air d'un aspirateur.
   4. Mélanger les particules marquées par fluorescence avec un milieu de culture cellulaire (préparée comme décrit ci-dessus). Ajouter Candida -BFP (à une MOI de 10), par fluorescence des perles-lapin conjugué-zymosan ou de latex IgG-FITC (10 particules par cellule) dans les cellules. Utiliser un volume final de 200 ul médias pour une chambre bien à assurer que toutes les cellules sont couvertes.
   5. Isoler la glissière de chambre à 277xg pendant 3 min à 10 ° C.
      NOTE: Cette étape de centrifugation permet d'augmenter le contact entre les particules et les cellules, et il synchronise le processus de liaison.
   6. Transférer immédiatement le tiroir de la chambre à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO ₂ pendant 5 min.
   7. Retirer la lame de la chambre de l'incubateur et aspirer les médias.
   8. Laver les cellules 3x avec PBS glacé.
      NOTE: Vérifier la présence de particules non liées avec un microscope optique et laver plusieurs fois avec PBS si nécessaire. Il est essentiel d'éliminer les particules non liées au puits pour minimiser le bruit de fond lors de l'analyse.
   9. Fixer les cellules par addition de 500 pi de paraformaldehyde à 4% (PFA) dilué dans du PBS par incubation pendant 30 min à température ambiante.
      ATTENTION: Cette étape nécessite l'utilisation de 4% PFA qui est très toxique, corrosif et potentiellement cancérigène. la prudence appropriée devrait être prise lors de l'utilisation de ce liquide. En outre, protéger les échantillons de la lumière.
   10. Laver les cellules en ajoutant 500 pi de PBS dans la chambre et aspirer doucement la solution.
   11. Répétez 3.1.9 étape deux fois.
       NOTE: A cette étape, remplir chaque flacon immédiatement après avoir retiré la précédente PBS.
   12. Arrêter la fixation par incubation avec 500 ul de 50 mM de NH ₄ Cl dans du PBS pendant 10 min.
   13. Laver les cellules deux fois avec du PBS comme décrit à l'étape 3.1.10.
   14. Perméabiliser les cellules par addition de 250 pi de tampon de liaison (0,1% de saponine, 0,2% de BSA dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante.
   15. Stain F-actine en ajoutant phalloidin conjugué fluorescent (dilué 1: 500 dans du tampon de liaison). Incuber les cellules pendant 1 heure à température ambiante.
   16. Laver les cellules trois fois avec du PBS comme décrit à l'étape 3.1.10.
   17. Capture d' images à l' aide d' un microscope confocal (objectif 63X, et 402 nm et 488 nm laser) et d' analyser des images en utilisant ImageJ ^16.
       Remarque: Une particule réussie liaison est caractérisée par la présence d'un cu phagocytairep à l'endroit où le contact de particules , la cellule phagocytaire (figure 1). Voir l'étape 3.2.5.
2. Phagocytose Uptake Assay
   NOTE: Cette expérience est conçue pour surveiller l'internalisation complète des particules marquées par fluorescence par les phagocytes en utilisant la microscopie confocale (figure 2).
   1. Ensemencer environ 5 x 10 ⁴ cellules dans une glissière de la chambre afin qu'elles soient confluentes à 60 à 70% au moment de l'expérience. Alternativement, les cellules de la plaque sur les bordereaux de couverture (en 24- ou en format 12 puits) ou plaques à 96 puits à fond de verre. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO _2.
      NOTE: Les cellules peuvent être comptées en utilisant un hémocytomètre ou une technique similaire.
   2. Gardez les lames de la chambre (ou plaque) à 10 ° C pendant 10 min.
      REMARQUE: refroidissement est nécessaire afin de bloquer l'endocytose, ainsi que la phagocytose non désirée, et par la suite d'avoir une phagocytose synchronisée.
   3. PerfORM étapes de 3.1.3 à 3.1.5
   4. Transférer le chariot de la chambre à 37 ° C , un incubateur humidifié avec 5% de CO _2, et laisser incuber pendant différents temps. Fixer les cellules après l'infection 30, 60 et 90 min après. Observer C. albicans commencent à se former hyphes après l'infection de 60 min; phagocytes commencent à montrer la mort cellulaire (pyroptosis) après 90 min ^8.
      NOTE: Ceci est une recommandation, et l'optimisation est essentielle en fonction du type cellulaire et les particules utilisées.
   5. Effectuer les étapes de 3.1.7 à 3.1.15. Analyser les images en utilisant ImageJ ^16.
      REMARQUE: une absorption réussie est caractérisée par une intériorisation complète d'une matière particulaire à l' intérieur du cytoplasme d'un phagocyte (figure 2). Tacher les phagocytes avec le marqueur de surface cellulaire tels que la phalloïdine contribue à délimiter le contour des cellules. Il est également essentiel d'effectuer z-piles afin de déterminer si les particules est lié à la surface cellulaire ou completely intériorisé.
3. Imagerie en direct de phagocytose
   NOTE: Dans ce protocole, nous décrivons l'utilisation de la microscopie confocale pour capturer les différentes étapes de la phagocytose en utilisant zymosan fluorescence conjugué. Nous utilisons la lignée cellulaire dendritique DC2.4 qui exprime de manière stable mCherry marqués F-actine ^8, un biocapteur qui montre la distribution de l' actine filamenteuse dans les cellules vivantes. Depuis phagocytose est un processus axé sur l' actine l'imagerie en direct dans cette cellule nous permet non seulement de capturer le mouvement et la dynamique du réseau F-actine, mais aussi de visualiser les différents événements phagocytaires dans les cellules vivantes (Figure 3, film 1).
   1. Ensemencer environ 5 x 10 ⁴ cellules dans une lame de chambre à une concentration , de sorte qu'ils sont 60 à 70% de confluence au moment de l'expérience. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C incubateur humidifié avec 5% de CO _2.
      NOTE: Les cellules peuvent être comptées en utilisant un hémocytomètre outechnique similaire.
   2. Gardez les diapositives de la chambre sur la glace pendant 10 min.
      REMARQUE: refroidissement est nécessaire afin de bloquer l'absorption non désirée, et d'avoir une phagocytose synchronisée.
   3. Effectuer les étapes de 3.1.3 à 3.1.5
   4. Préchauffer la platine du microscope à 37 ° C et à équilibrer la chambre avec 5% de CO _2. Attendre 30 à 45 min pour la température et le CO ₂ se stabilise avant de commencer la formation d' image.
      NOTE: Étant donné que les CO ₂ et des niveaux de température sont critiques pour la phagocytose, il est important de se tourner sur le chauffe-microscope avant l'expérience pour équilibrer la chambre environnementale.
   5. Placer la lame de la chambre contenant les cellules dans l'enceinte microscope incubateur équilibré à 37 ° C et 5% de CO _2.
   6. Effectuer l' imagerie en direct ^{17, 18.}
      REMARQUE: Les paramètres de la puissance du laser (gain, sténopé, etc.) peuvent varier en fonction du type d'ee microscope et sonde fluorescente utilisés. Par conséquent, nous vous recommandons de consulter le manuel du microscope pour connaître l' état optimal pour votre imagerie en direct ^17,18.
      1. Utiliser microscope confocal à balayage laser (et le logiciel associé) pour l'imagerie en temps réel. Utilisez objectif d'huile 63X 1.4NA avec un sténopé de 1-1,1 unités Airy.
      2. Pour démarrer l'imagerie, utilisé le champ lumineux pour trouver une région représentative sur la lame de la chambre. Ensuite, sélectionnez le champ en cliquant sur l'option de position sur le logiciel. Pour détecter la GFP dans la voie 1 a utilisé le jeu de filtres pour 488 nm laser avec un diviseur de faisceau à 582 nm, pour détecter des longueurs d'onde entre 488 et 582 nm.
      3. Dans Track 2 sélectionner un filtre défini optimal pour mCherry (DP) en utilisant un diviseur de faisceau à 578 nm et la détection de longueurs d'onde entre 578 et 600 nm. Utiliser 488 nm et 578 nm avec des lasers à 50% de la puissance laser et une sortie de gain de 600-700. Obtenir des images toutes les 30 secondes pour un total de 90 min.

Résultats

Procédé à base de microscope pour contrôler les différentes étapes de la phagocytose est présentée. Les différents événements au cours de la phagocytose des diverses particules fluorescentes par des cellules DC2.4 sont présentés. En utilisant les techniques décrites ici, nous avons étudié le rôle des sphingolipides dans les premiers stades de la phagocytose. A cet effet, DC2.4 cellules dendritiques génétiquement déficientes en Sptlc2, l'enzyme qui catalyse la première et l'étape limitant la...

Discussion

phagocytes professionnels, tels que les macrophages et les cellules dendritiques, engloutir et d'éliminer les pathogènes envahisseurs rendant ainsi la phagocytose une composante importante du système de défense de l'hôte. Au cours de ce processus phagocytes subissent une réorganisation de la membrane et le réarrangement du cytosquelette à leur surface cellulaire ^{8, 19, 20.} Pour mieux comprendre ce processus dyna...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144