탐식의 초기 단계를 시각화

요약

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 µm including zymosan and IgG-coated beads.

초록

포유류의 몸은 병원균의 침입으로부터 자신을 방어하는 데 도움이 메커니즘의 다양한 계층이 장착되어 있습니다. 이러한 호중구, 수지상 세포, 대 식세포 등 - - 면역 시스템의 전문 식세포 감지하고 식균 작용 ^(1)를 통해 이러한 침입하는 병원균을 취소 할 수있는 타고난 능력을 유지합니다. 식균 작용은 세포 표면 ^{2, 3에서} 막 개편과 액틴 리모델링의 안무 이벤트를 포함한다. 식세포가 성공적으로 내면화와 식균 작용의 모든 단계가 충족 된 경우에만 외국 분자를 근절. 이러한 단계는 인식 및 세포 표면에 존재하는 패턴 인식 수용체에 의한 병원균 (PRRS)의 결합을 포함 액틴 부화 막의 돌기 (pseudopods) 내지 식세포 컵의 형성은 미립자를 둘러싸하고 phagosome의 절단은 phagolysosome 성숙이어서 그 결과병원체 ^3,4- 사멸.

식균 작용의 다양한 단계의 이미징 및 정량이 세포 과정의 분자 메커니즘을 해명하기위한 수단이다. 본 원고는 식균 작용의 여러 단계를 공부하는 방법을보고합니다. 우리는 시각화하고 바인딩, 식세포 컵 형성을 정량화 할 수있는 현미경 기반의 접근 방식, 그리고 식세포에 의해 입자의 국제화에 대해 설명합니다. 식세포에 타고난 수용체가 더 큰 0.5 μm의, 우리는 여기에 제시 분석은 병원성 곰팡이 칸디다 알비 칸스 및 자이 모산과의 IgG 코팅 구슬과 같은 다른 입자의 사용을 포함하는 대상 입자에 리간드가 발생할 때 식균 작용이 발생있다.

서문

박테리아, 바이러스, 곰팡이 등 병원균에 지속적으로 노출에도 불구하고, 우리 몸에 잘 감염에 대한 보호를 제공하는 면역 메커니즘을 갖추고있다. 선천성 면역 시스템은 침입하는 병원체에 대한 방어의 첫 번째 줄과 인식 및 외국 목표를 내면화 식세포에 주로 의존한다.

식균 작용은 0.5 μm의보다 큰 원치 않는 미립자의 말림을 포함 진화론 보존 세포 과정이다. 대 식세포는 말림 ³ 종래 병원균에 존재하는 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs가)를 인식 할 수 있도록 세포 표면에서 (또한 패턴 인식 수용체 PRRS라고도 함) 면역 수용체의 넓은 범위를 표현한다. 병원체가 세포 표면 수용체 클러스터링 다음과 식세포 컵의 형성을 유발 바인딩. 이 주위에 돌출 굴지 중심의 막 리모델링 결과타겟은, 결국 감싸는와 핀치 오프하면 이산 phagosomal 액포 ^2,5-을 형성한다. phagosome는 성숙하고 phagolysosome ^(6)을 형성 후기 엔도 좀과 리소좀과 이후의 융합에 의해 산성화.

식균 작용은 수용체 - 매개 및 액틴 구동 이벤트로서 설명되어 있지만,이 프로세스는 또한 phosphoinositides (PI들) 및 스핑 고리 피드 ^{(7, 8)} 등의 세포막을 구성하는 지질의 시공간 변경에 의존한다. 액틴의 중합이 식세포 컵의 기지에서 phosphoinositol-4,5-biphosphate (PI (4,5) P _2)의 지방 축적에 의해 결정되지만, 굴지의 해중합은 (PI (4,5) P의 전환에 따라 달라집니다 ₂ phosphoinositol-3,4,5-biphosphate합니다 (PI (3,4,5) P) ^{_3, 9.} 모두 수정대상 주위 pseudopods 후자는 식세포 ^(10)의 세포질에 입자 침몰 가능의 성공적인 확장의 전 리드 필수입니다.

탐식하는 기능이 셀은 하나의 전문 식세포, 대 식세포 / 단핵 세포, 과립구 / 호중구 및 수지상 세포 또는 섬유 아세포 및 상피 세포에 ¹¹ 비전문 식세포, 등. 전문 식세포에 의해 수행 식세포가 병원체에 대한 타고난 및 적응 면역 반응의 조정을 담당하면서 모든 식세포에 의해 수행 식균 작용은 조직의 유지 보수 및 리모델링의 중심 역할을한다. 전문 식세포는 적응 면역 체계의 림프 세포에도 존재하는 항원을 삼켜과 병원균을 죽일,하지만하지 않습니다. 이 때문에 선도, 염증성 사이토 카인의 방출과 림프 세포의 결합에 기여감염 ^(12)의 성공적인 봉쇄.

기존의 생화학 적 기술은 번역 후 변형 단백질 사이의 다양한 높은 친 화성 협회 등의 식균 작용하는 동안 다른 세포 과정의 분자 메커니즘에 관한 지식을 얻는 수단이되고있다. 그러나, 종래의 생화학 적 방법을 이용하여 탐식 이벤트 시공간 동역학에 관한 정보를 얻는 것이 곤란하다. 라이브 세포 이미징뿐만 아니라 우리가 시간에 민감한 방식으로 세포 이벤트를 모니터링 할 수 있습니다뿐만 아니라, 단일 세포 수준에서 정보를 얻기 위해 우리가 할 수 있습니다. 여기서 우리는 식세포의 다른 단계를 조사하는 방법을 설명뿐만 아니라, 공 초점 현미경을 사용하여 시공간 전체 과정을 분석.

프로토콜

DC2.4 및 RAW 264.7 세포주 1. 준비

주 : 마크로파지 형 세포주 RAW 264.7 및 수지상 세포주 DC2.4 모두 뮤린 기원이며, 다음의 조건은 세포 성장을 위해 사용되었다.

1. 보충 된 DMEM에서 RAW 264.7 세포 (둘 베코 최소 이글 배지) 철 10 %, 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 가습 37 ℃에서 비활성화 된 태아 소 혈청 (FBS).
2. L 글루타민 대신 DMEM 보충 사용 RPMI (로스웰 파크 메모리얼 연구소) 매체를 제외하고, RAW 264.7 세포의 그것과 유사한 조건에서 DC2.4 세포를 성장.

2. 형광 공액 미립자의 제조 : C. albicans에, 자이 모산, IgG의 코팅 비즈

1. 칸디다 알비 칸스 성장
   1. 열린 우리당 (2 % 박토 - 펩톤, 1 %로 보충 YPD 25 ml의 냉동 글리세롤 재고에서 C. albicans에 스트레인 SC5314 접종효모 추출물, 2 % 글루코스 밤새 30 ° C에서 80 μg의 / ㎖의 우리 딘).
      참고 : OD (12)의 _600보다 더 칸디다 문화를 성장하지 마십시오.
   2. 알비 칸스 (C. albicans) 1 mL를 취하여 실온에서 5 분 동안 2000 × g으로 그것을 스핀 다운.
   3. 뜨는을 기음과 PBS 1 ml의와 펠렛을 다시 일시 중지합니다.
   4. 실온에서 5 분 동안 2000 × g으로 원심 분리하여 침전물을 수집한다.
   5. 단계를 반복 2.1.4.
   6. 식세포의 수와 관련하여 C. albicans에의 감염 (MOI)의 다양성을 계산하고 섹션 3. OD에 설명 된대로 1 _(600)하면 1ml를 당 2.5 × 10 ⁽⁷⁾ 칸디다 알비 칸스에 해당되는 식균 작용 분석을 진행합니다.
      주 : 칸디다-BFP의 발생 기준 ^(13)에 대하여 설명한다.
2. 자이 모산과의 IgG 코팅 구슬의 제조
   참고 : 자이 모산은 인 β 글루칸 함유사카로 마이 세스 세레 비지에서 파생 된 곰팡이 탄수화물 입자 준비. 자이 모산은 대 식세포 및 수지상 세포에서 염증성 신호를 불러 일으키는 것으로 알려져 있으며,이를 식균 작용 연구 ^{13, 14, 15에서} 광범위하게 사용되어왔다.
   1. 간단히 입자를 포함하는 튜브를 와동, 및 1.5 ㎖의 튜브에 실험에 충분한 양으로 나누어지는.
      참고 : 일반적으로 우리는 (하나의 셀에 대해, 10 모산 입자 또는 IgG를 코팅 구슬을 추가) 1시 10분 비율을 사용합니다.
   2. 얼음 차가운 PBS 1 ML을 추가, 10,000 x g에서 1 분간 원심 분리하여 입자를 수집합니다.
   3. 뜨는을 대기음 1 ml의 얼음처럼 차가운 PBS의 펠렛을 재현 탁.
   4. 단계를 반복 2.2.2-2.2.3
      참고 : 2.2.5 단계 또는 사용까지 4 ° C에서 튜브를 저장하기 위해 진행합니다.
   5. 을 방지하기 위해 초음파 욕조 초음파 처리기에서 10 초 미립자 (120 V, 50 ~ 60 kHz로)를 초음파 처리뉴욕 입자의 응집.

3. 탐식

참고 탐식이 입자의 표면 리간드와의 상호 작용을 통해 PRRS 식세포의 세포 표면 입자의 결합으로 시작하는 복잡한 과정이다. 결합은 액틴의 조립체와의 접촉 부위에서 관련 단백질 및 포식성 컵의 형성으로 이어진다. 후속 액틴 분해는 phagosome 발생 및 미립자의 전체 말림 초래한다. 우리는 식균 작용의 여러 단계를 설명 아래.

1. 바인딩 분석
   참고 : 본 실험의 목적은 대상 입자에 리간드와 식세포상의 수용체 사이의 상호 작용을 포함 식세포의 제 1 단계를 모니터링한다.
   1. 이들은 실험시 60-70% 합류되도록 챔버 슬라이드에 약 5 × ¹⁰⁴ 세포를 시드. Alternatively, 커버 슬립 접시에 세포 또는 유리 바닥 96 웰 플레이트 (24 또는 12 웰 형식). 밤새 5 % CO _2와 37 ° C 가습 인큐베이터에서 세포를 품어.
      주 : 혈구 세포 또는 이와 유사한 기술을 사용하여 계산 될 수있다.
   2. 10 분 동안 10 ° C에서 챔버 슬라이드 (또는 판)을 놓습니다.
   3. 조심스럽게 각 웰 피펫 또는 흡입기를 사용하여 매체를 제거합니다.
      주의 : 챔버의 coverglass 시스템의 각 웰이 작은주의로이 단계를 수행; 피펫의 팁 또는 흡입기의 강한 공기 흐름 세포를 교란하기 쉽습니다.
   4. 세포 배양 배지로 형광 표지 된 미립자를 혼합 (전술 한 바와 같이 제조 됨). 세포에, (10의 MOI에) 형광 접합 - 자이 모산 또는 라텍스 구슬 토끼의 IgG-FITC (셀 당 10 입자) 칸디다 -BFP를 추가합니다. 모든 셀이 포함되도록 잘 한 챔버 200 μL 미디어의 최종 볼륨을 사용합니다.
   5. 277에서 챔버 슬라이드를 스핀 다운10 ℃에서 3 분 XG.
      주 :이 원심 분리 공정은 미립자와 세포 사이의 접촉을 증가시키는 것을 돕고, 그 결합 과정을 동기화한다.
   6. 즉시 5 분 동안 5 % CO _2, 37 ℃, 가습 인큐베이터 챔버 슬라이드를 옮긴다.
   7. 인큐베이터에서 챔버 슬라이드를 제거하고 미디어를 대기음.
   8. 세포가 얼음처럼 차가운 PBS로 3 배 씻으십시오.
      참고 : 광학 현미경과 결합되지 않은 입자의 존재를 확인하고 필요한 경우 PBS로 여러 번 씻는다. 이 분석 동안에 배경 잡음을 최소화하는 웰로부터 비 결합 입자를 제거하는 것이 필수적이다.
   9. 실온에서 30 분 동안 배양하여 PBS에 희석 된 500 ㎕의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)을 첨가하여 세포를 고정한다.
      주의 :이 단계는 고도로 독성, 부식성 및 잠재적 인 발암 물질 4 % PFA의 사용을 필요로한다. 이 액체를 사용할 때 적절한주의를 기울여야합니다. 또한, 빛으로부터 샘플을 보호합니다.
   10. 챔버로 PBS 500 μl를 추가하여 세포를 씻으 부드럽게 솔루션을 대기음.
   11. 두 번 3.1.9 단계를 반복합니다.
       참고 :이 단계에서, 바로 이전의 PBS를 제거한 후 각각의 유리 병 리필.
   12. 10 분 동안 PBS에서 50 mM의 NH ₄ CL 500 μL와 함께 배양하여 고정을 중지합니다.
   13. 단계 3.1.10에 기술 된 바와 같이 PBS로 두 번 세포를 씻으십시오.
   14. 실온에서 30 분 동안 (PBS에 0.1 % 사포닌, 0.2 % BSA) 결합 완충액 250 μL를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면.
   15. 얼룩 (: 결합 버퍼 (500) 1 희석) 형광 접합 팔로이 딘을 추가하여 F는 액틴. 실온에서 1 시간 동안 세포를 인큐베이션.
   16. 단계 3.1.10에 기술 된 바와 같이 PBS로 세포를 세 번 씻는다.
   17. 공 초점 현미경 (63X 목표, 402 nm 내지 488 nm의 레이저)를 사용하여 이미지를 캡처하고 ImageJ에 ¹⁶ 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다.
       참고 : 성공적인 입자가 식세포 CU의 존재에 의해 특징 바인딩사이트에 페이지 위치 미립자 접촉 탐식 세포 (그림 1). 단계 3.2.5을 참조하십시오.
2. 식균 작용 통풍 관 분석
   주 :이 실험은 공 촛점 현미경 (도 2)를 이용하여 형광 표지 된 대 식세포에 의한 미립자의 완전한 내재화를 모니터링하도록 설계된다.
   1. 이들은 실험시 60-70% 합류되도록 챔버 슬라이드에 약 5 × ¹⁰⁴ 세포를 시드. 또한, 커버 슬립 접시에 세포 또는 유리 바닥 96 웰 플레이트 (24 또는 12 웰 형식). 밤새 5 % CO _2와 37 ° C 가습 인큐베이터에서 세포를 품어.
      주 : 혈구 세포 또는 이와 유사한 기술을 사용하여 계산 될 수있다.
   2. 10 분 동안 10 ° C에서 챔버 슬라이드 (또는 플레이트)를 유지한다.
      주 : 냉각 동기화 식균 작용을 갖고이어서 이입뿐만 아니라 불필요한 식균 작용을 차단하고,하기 위해 필요하다.
   3. 반환 한3.1.3에서 3.1.5로 ORM 단계
   4. 5 % CO _2와 37 ° C 가습 인큐베이터 챔버 슬라이드로 이동, 다른 시점 동안 품어. 30, 60, 90 분 후 감염 후 세포를 수정. C. 알비 칸스 60 분 후 감염에 균사를 형성하기 시작 관찰; 식세포는 90 분 ⁸ 후 세포 사멸 (pyroptosis)을 표시하기 시작합니다.
      주 :이 추천 및 최적화는 세포 종류와 입자에 따라 중요하다.
   5. 3.1.7에서 3.1.15로 단계를 수행합니다. ImageJ에 ^16을 사용하여 이미지를 분석 할 수 있습니다.
      참고 : 성공적으로 흡수가 식세포의 세포질 내의 입자의 완전한 국제화 특징으로한다 (그림 2). 이러한 팔로이 딘으로 세포 표면 마커 식세포 염색하여 세포의 윤곽을 묘사하도록 돕는다. 이는 입자가 세포 표면 또는 COMPL에 결합되어 있는지 여부를 확인하는 것도 위해 Z-스택을 수행하는 필수etely 내면화.
3. 탐식의 라이브 영상
   참고 :이 프로토콜에서 우리는 형광 접합 자이 모산을 사용하여 식균 작용의 다른 단계를 캡처하는 공 초점 현미경의 사용을 설명합니다. 우리는 안정적으로 mCherry - 태그 F - 굴지 ^8을 표현하는 수지상 세포 라인 DC2.4, 살아있는 세포에서 사상 굴지의 분포를 표시하는 바이오 센서를 사용합니다. 식세포는 액틴 구동 방법이기 때문에,이 셀의 라이브 영상을 F 액틴 네트워크의 이동 및 역학을 캡처 우릴 수뿐만 아니라 살아있는 세포 내의 다른 식세포 이벤트 (도 3, 영화 1)를 시각화 할뿐만 아니라.
   1. 이들은 실험시 60~70% 합류되도록 농도 챔버 슬라이드에서 약 5 × ¹⁰⁴ 세포를 시드. 밤새 5 % CO _2와 37 ° C 가습 인큐베이터에서 세포를 품어.
      참고 : 세포는 혈구 또는를 사용하여 계산 될 수있다유사한 기술.
   2. 10 분 동안 얼음에 챔버 슬라이드를 유지합니다.
      주 : 냉각 불필요한 흡수를 차단하고, 동기화 된 식균 작용을하기 위해 필요하다.
   3. 3.1.3에서 3.1.5로 단계를 수행
   4. 37 ° C에 현미경 스테이지를 사전 따뜻하게 5 % CO ₂ 챔버를 평형. 이미징을 시작하기 전에 안정 온도와 CO _2에 대한 30 ~ 45 분을 기다립니다.
      참고 : CO ₂ 및 온도 수준이 식균 작용에 중요하기 때문에, 그것은 환경 챔버를 평형 전에 실험 현미경 히터를 켜하는 것이 중요하다.
   5. 37 ° C, 5 % CO _2에서 평형 현미경 인큐베이터 인클로저에있는 세포를 포함하는 챔버 슬라이드를 놓습니다.
   6. 라이브 영상 ^{(17), (18)을 수행합니다.}
      주 : 레이저 파워 (게인, 핀홀 등)의 설정이 제의 종류에 따라 달라질 수있다전자 현미경과 형광 프로브를 사용합니다. 따라서, 우리는 라이브 영상 ^{(17, 18)에} 대한 최적의 조건을 현미경의 사용 설명서를 참고하시기 바랍니다.
      1. 공 초점 레이저 주사 현미경 (및 관련 소프트웨어) 라이브 이미징을 사용합니다. 1-1.1 에어리 단위의 핀홀과 63X 1.4NA 기름 목표를 사용합니다.
      2. 이미징을 시작하려면, 챔버 슬라이드의 대표 지역을 찾을 수있는 시야를 사용했습니다. 다음으로, 소프트웨어의 위치 옵션을 클릭하여 필드를 선택합니다. 488과 582 나노 미터 사이의 파장을 검출하기 위해, 582 nm의 빔 스플리터 488 nm의 레이저에 대한 필터 세트를 사용 트랙 1에 GFP를 검출한다.
      3. 트랙 2에서는 mCherry (RFP)를위한 최적의 설정 필터 578 nm에서 빔 스플리터를 사용 nm의 578 내지 600 파장을 검출을 선택합니다. 488 nm에서 50 %의 레이저 출력과 600-700의 이득 출력이 578 nm의 레이저를 사용한다. 90 분 총 이미지마다 30 초를 얻습니다.

결과

식균 작용의 다른 단계를 모니터링하는 현미경 기반 방법이 제공된다. DC2.4 세포에 의해 다양한 형광 입자의 식균 작용 동안 다른 이벤트가 표시됩니다. 여기에 설명 된 기술을 사용하여, 우리는 식세포 작용의 초기 단계에서 스핑 고리 피드의 역할을 조사 하였다. 이를 위해 Sptlc2는 스핑 고지 생합성 경로에서 제 속도 - 제한 단계를 촉매하는 효소의 유전자가 결핍 DC2.4 수지상 세포를 사용 하였다...

토론

대 식세포 및 수지상 세포와 같은 전문 식세포, 삼켜 때문에 병원균이 침입 숙주 방어 시스템의 중요한 요소 식균 작용을 제거한다. 이 과정에서 식세포는 세포 표면 ^{8, 19, 20에서} 광범위한 막 조직 개편과 세포 골격 재 배열을 받다. 더 나은이 역동적 인 과정을 이해하기 위해, 식균 작용의 다른 단계의 시각화는 필수적이다. 여...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
β-Mercaptoethanol	AppliChem	A1108
Bovine serum albumin (BSA)	Cell Signaling Technology	9998
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	ThermoFisher	D3571
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	BP-231-1
DMEM (Dulbecco’s Minimal Eagle’s medium)	Gibco	11965
PBS, 1x (Phosphate- Buffered Saline)	Corning cellgro	21-031-CV
Fetal Bovine serum	Sigma Aldrich	12003C
FITC-coupled IgG-coated latex beads	Cayman	500290
L-Glutamine 200 mM (100x)	ThermoFisher	25030081
Paraformaldehyde Solution (4% in PBS)	Affymetrix	19943 1 LT
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	ThermoFisher	15-140-122
Phalloidin-Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A12379
RAW 264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI (Roswell Park Memorial Institute)	Gibco	61870
Saponin	Sigma Aldrich	S7900
Trypan blue solution (0.4% (w/v) in PBS)	Corning cellgro	MT25900CI
Trypsin-EDTA (1x) (0.05%)	ThermoFisher	25300054
Tween 20 Surfact-Amps Detergent Solution	ThermoFisher	85114
Zymosan-Alexa Fluor 594	ThermoFisher	Z23374
Chambered 1.0 Borosilicate Coverglass system (8 chambers)	ThermoFisher	155361
Glasstic slide 10 with grids	Hycor	87144