Un modelo para la invasión perineural en cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas

Resumen

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Resumen

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Introducción

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

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Protocolo

1. Preparación del medio de cultivo y platos (10 min)

1. Añadir 100 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo en V.
2. Retirar un pre-alícuotas-vial de aproximadamente 100 l de matriz semisólida del congelador 20 ° C y colocarlo directamente en hielo.
   NOTA: Para ello, antes de la ganglio de la raíz dorsal de la cosecha (DRG) porque la matriz semisólida tarda aproximadamente 30 min para alcanzar el estado líquido en el hielo, que es necesaria para las etapas ulteriores. Si no se mantiene la matriz semisólida en hielo en todo momento, el resultado es la matriz de gotitas de mala calidad.
3. culturas placas con tinta indeleble etiqueta de fondo de vidrio, la creación de identificadores únicos en cada una de las cuatro esquinas de la parte inferior de la placa. Colocar las placas del lado derecho hacia arriba en hielo para enfriar la superficie de la placa.
   NOTA: los rendimientos de cada ratón 32 - 40 DRG, por lo etiquetarlos de 1 a 40. No es necesario pre-enfriamiento del pimascotas consejos, como consejos refrigerados se calentará durante el transcurso de la colocación de las gotitas de la matriz, lo que podría introducir diferencias en la consistencia de la matriz.

2. Disección de murino DRG (45 min)

1. La eutanasia a un ratón nude atímicos como por protocolos de laboratorio específicas, tales como mediante el uso de una cámara de CO ₂ y una toracotomía.
2. Configurar el área de la disección y el microscopio. Utilice la parte inferior limpia, se esteriliza, y plano de contenedores de poliestireno de 15 ó tubos cónicos de 50 ml.
   NOTA: Además, son adecuados para uso como la superficie de disección, ya que son de bajo costo, desechables, y permitir la fijación de la columna vertebral utilizando agujas o alfileres. Sólo utilice los instrumentos y agujas esterilizadas.
3. Bajo la visión natural, hacer una incisión longitudinal a lo largo de la columna vertebral de la raíz de la cola a la cabeza del ratón con un par de tijeras finas rectas o curvas.
4. Use las mismas tijeras para dividir transversalmente por debajo de la sacral columna vertebral. Diseccionar ambos lados de la columna vertebral de todo el camino hasta la base del cráneo con las tijeras. En este punto, asegúrese de que la columna vertebral cervical se secciona cranealmente medida de lo posible con unas tijeras.
5. Observe el extremo cervical de la columna vertebral en el microscopio de operación a baja potencia. La médula espinal blanco es evidente en el medio de un anillo óseo, que está rodeado por cantidades variables de los músculos paraespinales y tejido blando.
6. Dividir el dorsal o aspecto superior de los primeros 2 - 3 cuerpos vertebrales con tijeras de primavera microscópicas. El uso de la acción de resorte de las tijeras, abrir este ósea inicial cortado para asegurar que la disección del cuerpo vertebral se produjo en la línea media. Continuar en pequeños incrementos hacia la columna vertebral sacro, y luego dividir en dos la columna vertebral, completando los cortes idénticos en el aspecto ventral o inferior de los cuerpos vertebrales.
   NOTA: Si no se garantiza la disección de la línea media de la columna vertebral ósea dará lugar a un rendimiento inferior DRG.
7. en Thipunto s, la columna vertebral se divide en dos mitades. Coloque una hemi-columna vertebral a un lado, con la médula espinal en su lugar y hacia abajo en una placa estéril.
   NOTA: Al salir de la médula espinal en su lugar evitará que los GRD se sequen, ya que los GRD son profundos a la médula espinal.
8. Asegure cada extremo de la otra hemi-espina dorsal con dos agujas de calibre 18 en la plataforma de poliestireno de disección. Comenzando en el extremo cervical (que es evidente porque la espina dorsal es más estrecha, el DRG están más cerca el uno al otro, y hay inserciones RIB), suavemente remueva la médula espinal de alrededor de 4 niveles vertebrales.
9. Observar los nervios sensoriales (generalmente dos) que conectan la DRG. En el área donde los nervios se insertan a la DRG, agarre suavemente la fascia circundantes con unas pinzas microscópicas. Diseccionar y recortar esta fascia y otros tejidos nerviosos con las tijeras de primavera microscópicas para liberar el GRD. la retracción suave traerá el DRG fuera de su posición dentro de la columna ósea.
   NOTA: El aumento de lapoder microscopio en este paso es beneficioso. Lesión por aplastamiento a la DRG limitará de forma significativa el crecimiento de neuritas. Esto se evita que nunca agarrando el DRG directamente, sino más bien agarrando la fascia de los alrededores.
10. Cortar el nervio periférico (DRG generalmente tiene un nervio periférico, que es profunda relación a la vista de disección) con las tijeras de primavera microscópicas para liberar el DRG.
    NOTA: Es más fácil de determinar, donde los extremos de los nervios y los GRD se inicia mientras está en tensión, por lo que hacer este corte lo más cerca posible a la GRD en este momento es ideal. Una vez que se corta esta rama distal, las ramas proximales se recortan también.
11. Recorte el DRG de las fibras nerviosas callejeros o uniones fasciales con las tijeras de primavera microscópicas. Después de un aislamiento adecuado, coloque el DRG en el medio a temperatura ambiente dentro de la placa de 96 pocillos de fondo en V.
    NOTA: La colocación de un fondo oscuro debajo de la placa hace que la visualización de la sub-mm GRD blanco más fácil. Instale solamente un GRD en el EACh así; de esta manera, que puede explicarse más fácilmente en las etapas subsiguientes.
12. Repita este proceso hasta el fondo de un hemi-espina dorsal y después el otro. Cada lado se obtiene 16 - 20 GRD, un total de 32 - 40.
    NOTA: Si hay menos GRD que esto, la disección de la columna vertebral debe ser llevado a cabo más cefálica y / o en sentido caudal. Los GRD se vuelven cada vez menos bien definida como se procede en sentido caudal.

3. Preparación de la matriz semiduros Las gotitas (<1 min por placa)

1. Retire una placa de vidrio pocillos de fondo de hielo y colocarlo en un bloque de hielo debajo del microscopio quirúrgico. Asegúrese de que la parte alícuota de la matriz se mantiene en hielo en todo momento.
2. Coloque una gota de 1,5 l de matriz en cada una de las cuatro esquinas de la placa con fondo de vidrio con un 2-l o micropipeta de 10 l, dejando una distancia al menos tan grande como la propia gota desde el borde de la copa también.
   1. Coloque la punta de la pipeta directamente sobreel vidrio en un ángulo de 45 grados. pipeta lentamente la matriz. Poco a poco alejarse de la parte inferior de vidrio después de la matriz se dedica en la placa.
      NOTA: La tensión superficial entre la matriz y el vidrio debe crear un hemisferio perfecto cada vez.
   2. Deja de pipeteado justo antes de la punta está vacío, porque inyección inadvertida de aire en la gotita matriz hace que el diámetro de la gotita de matriz mucho mayor y es difícil de eliminar.
      NOTA: El uso de una segunda mano para estabilizar la mano de pipeteado facilita la colocación más precisa.

4. La inserción de DRG en semiduros Matrix Las gotitas (<2 min por placa)

1. Deje el plato con las gotitas de matriz brevemente a temperatura ambiente (~ 1 min). Esto endurece ligeramente la matriz, por lo que es más fácil para la colocación precisa de la DRG.
2. Cucharada (no la sujete) el DRG suavemente con fórceps microscópicas cerradas en la mano izquierda. Una vez más, un fondo oscuro contra el pequeño, blancoDRG facilita la visualización. La transferencia de la DRG a la punta de una aguja de calibre 21 en la mano derecha. Esta transferencia dejará medios residual sobre los fórceps.
3. Introduzca suavemente el DRG en el medio de la gotita de matriz, usando la aguja de calibre 21 (Figura 1). La mayor parte del tiempo, el DRG se suelte fácilmente en la matriz y luego se puede colocar en el centro con la aguja.
   1. Si el DRG se pega a la aguja, utilice el fórceps microscópicas para empujar el DRG fuera de la aguja y en la gota de matriz. Wick el exceso de medios de las pinzas microscópicos con un paño de laboratorio.
      NOTA: La introducción de medios de comunicación a la matriz alterará el diámetro, el volumen y la consistencia del ensayo. Un bloque de hielo con el color o la escritura de color proporciona un contraste de fondo, lo que facilita la visualización de este delicado proceso.
4. Después de que la placa tiene las cuatro GRD, lleve a cabo una inspección final para asegurar que el DRG está en el centro de la gotita de matriz. Hacer ajustessegún sea necesario con la aguja 21 de calibre.
5. Colocar la placa completada a una incubadora a 37ºC. Esto se solidificará la matriz semisólida y fijar la DRG en su posición.
6. Repita este procedimiento para todos los GRD. Coloque gotitas de matriz en blanco sin una DRG como el control negativo.
7. Añadir 4 ml de DMEM con 10% FBS a cada placa con fondo de vidrio después de completar todas las placas y exponiéndolos a la incubadora a 37ºC durante al menos 3 min. Colocar la placa en un ligero ángulo y se añade lentamente el medio, de manera que se trata poco a poco en contacto con las unidades de matriz-DRG.
   NOTA: Si se añade el medio demasiado rápido o con vigor, la matriz y / o DRG puede desalojarse.
8. Almacenar los ensayos en la incubadora a 37ºC durante las siguientes 48 - 72 h.
   NOTA: el examen periódico de los ensayos mostrará excrecencia circunferencial de neuritas hacia el borde de la matriz (Figura 2). Cuando las neuritas son mayores que las tres cuartas partes de la forma de la matriz, sees adecuado para la placa de las células.

5. Preparación de la Cabeza y Cuello células de cáncer

NOTA: Las líneas celulares distintas de la cabeza y las células de carcinoma de células escamosas de cuello se pueden utilizar en este diseño experimental.

1. Mantener las líneas celulares de carcinoma de células escamosas en DMEM con 10% de FBS en matraces o placas de cultivo preferidos en una incubadora a 37ºC. Para preparar células para la experimentación, la succión de todo el medio del matraz de cultivo o un plato y se lava dos veces con PBS. Suspender las células mediante la adición de una cantidad apropiada de 0,025% de tripsina durante 5 min, seguido de DMEM con 10% de FBS. Pipetear 4 ml de la mezcla de células y medios de comunicación en placas de cultivo de 6 ml.
   NOTA: Una placa de cultivo de 6 ml proporciona más que suficientes células, incluso cuando menos de 50% de confluencia.
2. Exponer las líneas celulares HNSCC a diferentes condiciones de 24 h antes de la tinción y placas en el ensayo DRG. Re-dosificar la condición una vez que las células se colocan para mantener un environme consistenteNuevo Testamento.
   NOTA: Añadir anticuerpos, factores de crecimiento, citoquinas, u otras moléculas a las placas de cultivo celular de 1 - 2 días después de la disección del ratón y la implantación del DRG en la matriz.
3. Añadir manchas de células fluorescentes 1 h antes en placas de las células (2 - 3 días después de la cosecha DRG y la implantación en la matriz).
   NOTA: Las manchas particulares usados ​​aquí pasar libremente a través de la membrana celular; sin embargo, después de reaccionar con los grupos tiol intracelulares, la mancha permanece dentro de la célula y se transmite a las células hijas. La tinción facilita en gran medida la visualización dentro de los ensayos. Estas manchas temporales son ideales para estos ensayos ya que la fluorescencia está presente durante 2 - 3 días, que es el período de tiempo de estos experimentos. También permite el uso de muchos colores diferentes y evita la necesidad de la creación de líneas celulares de proteína transfectadas fluorescentes.
   1. Preparar 10 M de solución de colorante mediante la mezcla de 2 l de 10 mM manchas de células de valores en 2 ml de DMEM libre de sueropara cada condición de la celda. Calentar este a 37 ° C antes de añadir a las células.
   2. Retire el medio de cultivo dentro de la placa de 6 ml, dejando las células adherentes CECC en el plato. Añadir 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y retire 2 ml de DMEM 10 M tinción celular / sin suero añadieron a cada placa
   3. Devolver la placa de cultivo de 6 ml con la mancha de células a la 37 ° C incubadora durante 40 min.
   4. Después de 40 minutos, aspirar el medio. Añadir 2 ml de PBS y luego aspirar él. Añadir 1 ml de tripsina al 0,025% a cada placa y volver a colocarlas en la incubadora a 37ºC.
   5. Añadir 2 ml de DMEM con 10% FBS después de 3-5 min y transferir las células suspendidas a un tubo cónico de 15 ml. Girar las células y les volvió a suspender en 1 ml de DMEM con 10% de SFB.
   6. Contar las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado, y luego añadir DMEM con 10% de FBS para crear una concentración final de células de 300.000 células por ml.

6. Revestimiento del Jefe y NLas células del cáncer Eck

1. Retire las placas con fondo de cristal con los ensayos de matriz-DRG de la incubadora.
   NOTA: Una vez más, que son pertinentes cuando neuritas son al menos 75% del camino hacia el borde de la matriz, que se produce generalmente después de 2 - 3 días. Esto se ve mejor utilizando al menos un objetivo de 10X.
2. Aspirar el medio dentro de la placa con fondo de vidrio. Completamente aspirar el medio dentro del vidrio bien sin la eliminación de las unidades de matriz-DRG.
3. Elaborar 200 l de las 300.000 células / ml de medio utilizando una pipeta de 200 l. Colocar dos gotas de las células sobre cada ensayo de matriz-DRG. Realice este paso para cada gotita matriz, creando cuatro repeticiones de cada condición de células en un plato.
   NOTA: La forma hemisférica de la matriz permite que las células se asientan en un anillo a lo largo de la periferia del ensayo (Figura 3a, Figura 3b). Encontrar una pipeta con un gatillo suave hace que la colocación de uniforme cae muy fácil.
4. Confirmar el número de células similares y distribution de las diversas condiciones de las celdas bajo microscopía de 4X.
5. Colocar las placas con fondo de vidrio en la incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 60 minutos. NOTA: A pesar de que sólo hay un pequeño volumen de las células y los medios de comunicación (~ 150 ml), los ensayos no se sequen hasta que hayan transcurrido varias horas de tiempo incubadora.
6. Después de 60 min, añadir con cuidado 4 ml de DMEM con 10% FBS a lo largo de la pared lateral de la placa de fondo de vidrio.
   NOTA: Durante un período de tiempo, las células se adhieren parcialmente a la placa inferior, y el método de añadir el medio no perturbar las células. Diferentes tipos de células pueden tardar más o menos tiempo para comenzar a adherirse a la placa con fondo de vidrio.
7. Reemplazar cualquier droga exógenos o factores de crecimiento en este momento para mantener los niveles de concentración anteriores.
8. Devolver los ensayos para la incubadora a 37ºC, excepto cuando se examinan al microscopio. Cuantificar los resultados de este ensayo de imágenes microscópicas. En pocas palabras, contar las hebras de la invasión perineural conen cuatro cuadrantes utilizando una imagen microscópica 4X.
   NOTA: un microscopio con una 4X capacidades objetivas y de fluorescencia es adecuada para la foto-documentación de los ensayos. El tamaño de los ensayos se adapta muy bien dentro del campo de un objetivo 4X, que se detalla lo suficiente para capturar las áreas individuales de la invasión perineural. La invasión perineural se hace evidente dentro de las 24 h, pero más allá de 48 h, la integridad de los ensayos comienza a debilitarse, ya que las células tumorales se dividen a lo largo de la periferia de la matriz e invaden. Más allá de 48 h, hay también flujo de salida sustancial de los fibroblastos de la DRG, que oscurece la visualización mediante microscopía de campo claro. Por lo tanto, es aconsejable foto-documento los resultados con microscopia 4X al menos dos veces durante esta ventana (por ejemplo, a las 24 y 48 h después de la siembra las células tumorales). Tener en cuenta que estos son ensayos de 3 dimensiones, y es difícil por completo la imagen de todo el ensayo. La mayoría invasión perineural se produce en un plano de la parte inferior de la placa, donde tque células están incrustadas en la matriz ligeramente por encima de la parte inferior de la placa. Debido a que este plano es cerca de la horizontal, la gran mayoría de las neuritas con las células tumorales se capturan una imagen de un solo nivel en 4X en.

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Resultados

Después de la disección de la DRG y la colocación dentro de la gotita de matriz, la aparición del ensayo debe parecerse a la Figura 1. Obsérvese que el DRG no es perfectamente redonda, pero se centra dentro de la gotita de matriz. Esto permite la excrecencia de neuritas en 360 grados, que se muestra parcialmente en la figura 2. Tenga en cuenta que ciertas partes de la DRG envían axones más rápido y en mayor número que los demás, por lo general ...

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Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Los pasos más importantes dentro de este protocolo son la disección precisa y extracción de los ganglios de la raíz dorsal. transección adecuado de la columna vertebral y una división de la línea media longitudinal en dos-hemi-espinas son críticos para la obtención de un gran número de DRG. Durante la disección de los GRD individuales, el ganglio nunca debe ser manejado directamente, sino más bien los que rodean la fascia ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Fetal bovine serum	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Phosphate buffered Saline 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operating Microscope	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Schott ACE I light source	Schott	A20500	Germany
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard Apparatus	60-3923	Holliston, MA
Dressing Forceps	Harvard Apparatus	72-8949	Holliston, MA
Athymic nude mice (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME