Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

Resumo

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Resumo

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Introdução

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

Protocolo

1. Preparação do Meio de Cultura e pratos (10 min)

1. Adicionar 100 uL de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com soro fetal bovino a 10% (FBS) aos poços de uma placa de 96 poços de fundo em V.
2. Remover um pré-aliquotadas-ampola de, aproximadamente, 100 mL de matriz semi-sólida a partir do congelador 20 ° C e colocá-lo directamente em gelo.
   NOTA: Para fazer isso, antes da colheita de gânglio da raiz dorsal (DRG), porque a matriz semi-sólido leva cerca de 30 minutos para atingir o estado líquido em gelo, a qual é necessária para os passos subsequentes. A falha em manter a matriz semi-sólida de gelo em todo o tempo vai resultar uma gotícula de matriz de má qualidade.
3. Etiqueta de vidro de fundo culturas placas com tinta permanente, criando identificadores únicos em cada um dos quatro cantos na superfície inferior da placa. Coloque as placas do lado direito para cima no gelo para esfriar a superfície da placa.
   NOTA: Rendimento de cada ratinho 32 - 40 DRG, assim classificá-los a partir de 1 a 40. Não é necessário pré-pi friopet dicas, como dicas refrigerados vai aquecer ao longo de colocação das gotículas de matriz, potencialmente introduzir diferenças de consistência da matriz.

2. Dissecção de Murino DRG (45 min)

1. Eutanásia um ratinho nu atímicos de acordo com protocolos laboratoriais específicos, tais como através da utilização de uma câmara de CO ₂ e uma toracotomia.
2. Definir a área de dissecção e microscópio. Use o lado limpo, esterilizado, e plana de recipientes de poliestireno para 15 ou tubos cônicos de 50 mL.
   NOTA: Para além disso, eles são adequados para utilização como superfície de dissecação, uma vez que são de baixo custo, descartável, e permitir a fixação da coluna vertebral utilizando pinos ou agulhas. Utilize apenas os instrumentos e agulhas esterilizadas.
3. Sob a visão natural, faça uma incisão longitudinal ao longo da coluna vertebral a partir da raiz da cauda para a cabeça do rato com um par de tesouras finas retas ou curvas.
4. Use as mesmas tesouras para dividir transversalmente abaixo do sacral espinha. Dissecar ambos os lados da coluna vertebral todo o caminho até à base do crânio usando a tesoura. Neste ponto, garantir que a coluna cervical é seccionado cranialmente, tanto quanto possível, com uma tesoura.
5. Observar a extremidade cervical da coluna vertebral sob o microscópio de operação a baixa potência. A medula espinhal branco é aparente no meio de um anel ósseo, que está rodeado por quantidades variáveis ​​de músculos paraespinhais e tecido mole.
6. Dividir a dorsal ou aspecto superior dos primeiros 2 - 3 corpos vertebrais com uma tesoura primavera microscópicas. Usando a acção de mola a tesoura, abrir esta óssea inicial corte para garantir que o corpo vertebral dissecção ocorreu na linha média. Continue em pequenos incrementos para a coluna sacral, e depois bissetriz a coluna vertebral através do preenchimento dos cortes idênticos no aspecto ventral ou inferior dos corpos vertebrais.
   Observação: A falha de assegurar a dissecção da linha média da coluna vertebral óssea irá resultar num rendimento mais baixo de DRG.
7. No this ponto, a coluna vertebral é dividido em duas metades. Coloque um hemi-espinha de lado, com a medula espinhal no lugar e virado para baixo em uma placa estéril.
   NOTA: Deixando a medula espinhal no local vai impedir que os DRGs de secar, como os DRGs são profundas para a medula espinhal.
8. Fixe cada extremidade da outra hemi-coluna, com duas agulhas 18-gauge na plataforma de poliestireno dissecando. Começando na extremidade cervical (que é evidente porque a coluna vertebral é mais estreita, o DRG estão mais próximos um do outro, e existem inserções RIB), suavemente descascar a medula espinal a partir de cerca de quatro níveis vertebrais.
9. Observe os nervos sensoriais (geralmente dois) que ligam o DRG. Na área onde os nervos inserir no DRG, suavemente agarrar as fascia circundantes com pinças microscópicas. Dissecar e aparar essa fáscia e outros tecidos nervosos com a tesoura primavera microscópicas para liberar o DRG. retração gentil trará o DRG fora de sua posição dentro da coluna vertebral óssea.
   NOTA: O aumento dapoder microscópio neste passo é benéfico. Lesão por esmagamento com o DRG vai limitar significativamente o crescimento de neurites. Isto é evitado por não compreender a DRG diretamente, mas sim segurando os fáscia circundantes.
10. Cortar o nervo periférico (DRG tem geralmente um nervo periférico, que é profundo em relação à visualização de dissecação) com a tesoura primavera microscópicos para libertar o DRG.
    NOTA: É mais fácil determinar onde as extremidades dos nervos e o DRG começa quando em tensão, tornando assim este corte o mais próximo possível para o DRG neste momento é o ideal. Uma vez que este ramo distal é cortado, os ramos são cortados proximais bem.
11. Apare o DRG de quaisquer fibras nervosas perdidas ou anexos fasciais com a tesoura primavera microscópicas. Após o isolamento adequado, colocar o DRG para o meio à temperatura ambiente no interior da placa de 96 poços de fundo em V.
    NOTA: Colocar um fundo escuro por baixo da placa faz visualizar o sub-mm DRGs brancos mais fácil. Apenas coloque um DRG em each bem; Desta forma, eles podem ser explicados mais facilmente nas etapas subsequentes.
12. Repita esse processo até o fim de um hemi-coluna e depois o outro. Cada lado resulta em 16 - 20 DRGs, num total de 32 - 40.
    NOTA: Se houver menos DRGs do que isso, a dissecção da coluna precisa ser realizada ainda mais cefálica e / ou caudal. Os DRGs se tornado cada vez menos bem definida como uma prossegue caudalmente.

3. Preparação de Queijos Matrix Gotas (<1 min por placa)

1. Remova uma placa de vidro bem inferior de gelo e coloque-o em um bloco de gelo sob o microscópio cirúrgico. Certifique-se a alíquota de matriz permanece em gelo em todos os momentos.
2. Coloque uma gota de 1,5 mL de matriz em cada um dos quatro cantos da placa de vidro de fundo com a 2 uL ou 10 uL micropipetter, deixando uma distância pelo menos tão grande como a própria gotícula a partir da borda do vidro bem.
   1. Colocar a ponta da pipeta directamente sobreo vidro a um ângulo de 45 graus. Lentamente pipeta da matriz. Lentamente, afastar-se do fundo de vidro após a matriz está envolvida na placa.
      NOTA: A tensão superficial entre a matriz de vidro e deve criar um hemisfério perfeito de cada vez.
   2. Pare pipetando pouco antes de a ponta está vazia, porque a injecção inadvertida de ar para dentro da gotícula da matriz faz com que o diâmetro da gotícula de matriz muito maior e é difícil de remover.
      NOTA: Usando uma segunda mão para estabilizar a mão pipetagem facilita a colocação mais precisa.

4. Inserção de DRG em semi-sólidas Matrix Gotas (<2 min por placa)

1. Deixar a placa com as gotículas de matriz rapidamente à temperatura ambiente (~ 1 min). Isto endurece ligeiramente a matriz, tornando-se mais fácil para o posicionamento preciso do DRG.
2. Colher (não entender) o DRG delicadamente com uma pinça microscópicas fechadas na mão esquerda. Mais uma vez, um fundo escuro contra o pequeno, brancoDRG facilita a visualização. Transferir o DRG para a ponta de uma agulha de calibre 21 com a mão direita. Esta transferência vai deixar meios residual sobre a pinça.
3. Suavemente inserir o DRG para o meio da gotícula da matriz, utilizando a agulha de calibre 21 (Figura 1). Na maioria das vezes, o DRG vai libertar facilmente na matriz e, em seguida, pode ser posicionada centralmente com a agulha.
   1. Se o DRG adere à agulha, utilizar a pinça microscópicas para empurrar o DRG fora da agulha e para dentro da gota de matriz. Wick media o excesso de pinças microscópicas com um laboratório de limpar.
      NOTA: Apresentando mídia para a matriz irá alterar o diâmetro, volume e consistência do ensaio. Um bloco de gelo com cor ou escrita colorido proporciona um contraste de fundo, o que facilita a visualização deste processo delicado.
4. Depois de a placa tem todos os quatro DRGs, efectuar uma inspecção final para garantir que o DRG está no centro da gota de matriz. fazer ajustesconforme necessário, com a agulha 21-gauge.
5. Transferir a placa preenchido para uma temperatura de 37 ° C incubadora. Isso vai solidificar a matriz semi-sólida e corrigir o DRG na posição.
6. Repita esse processo para todos os DRGs. Coloque gotículas de matriz em branco sem um DRG, como controlo negativo.
7. Adicionar 4 ml de DMEM com 10% de meio FBS a cada placa com fundo de vidro depois de completar todas as placas e expondo-os a 37 ° C incubadora durante pelo menos 3 min. Coloque a placa em um ângulo ligeiro e adicionar lentamente o meio, de tal modo que, gradualmente, entra em contato com as unidades de matriz de DRG.
   NOTA: Se o meio é adicionado demasiado depressa ou vigorosamente, a matriz e / ou DRG pode tornar-se desalojado.
8. Armazenar os ensaios in a 37 ° C incubadora para a próxima 48-72 h.
   NOTA: exame periódico dos ensaios mostrará excrescência de neurites circunferencial na direcção da extremidade da matriz (Figura 2). Quando as neurites são maiores do que três quartos do caminho para a matriz, eleé apropriado para a chapa das células.

5. Preparação da Cabeça e Pescoço Cancer Cells

NOTA: outros do que a cabeça e as células carcinoma de células escamosas do pescoço As linhas celulares podem ser usados ​​neste projeto experimental.

1. Manter linhas de carcinoma de células escamosas de células em DMEM com 10% de FBS em frascos preferidos ou pratos de cultura num banho a 37 ° C incubadora. Para preparar as células para a experimentação, a aspiração todo o meio do frasco de cultura ou prato e lavá-lo duas vezes com PBS. Suspender as células por adição de uma quantidade apropriada de 0,025% de tripsina durante 5 minutos, seguido por DMEM com FBS a 10%. Pipeta 4 mL da mistura de células e meios de cultura em placas de 6 mL.
   NOTA: uma placa de cultura de 6 mL fornece mais do que suficiente de células, mesmo quando menos de 50% confluente.
2. Expor as linhas de células de carcinoma epidermóide para diferentes condições de 24 h antes da coloração e plaqueamento em ensaio DRG. Re-dosear a condição uma vez que as células são plaqueadas a manter uma environme consistentent.
   NOTA: Adicionar anticorpos, factores de crescimento, citoquinas, ou outras moléculas para as placas de cultura de célula de 1 - 2 dias após dissecção ratinho e implantação do DRG na matriz.
3. Adicionar manchas de células fluorescentes 1 h antes de plaqueamento das células (2 - 3 dias após a colheita e DRG implantação na matriz).
   NOTA: As manchas particulares utilizados aqui passar livremente através da membrana celular; No entanto, depois de reagir com grupos tiol intracelular, a mancha permanece no interior da célula e é passado para as células filhas. A coloração facilita grandemente visualização dentro dos ensaios. Estas manchas temporárias são ideais para estes ensaios, porque a fluorescência está presente durante 2 - 3 dias, que é o prazo destas experiências. Também permite o uso de muitas cores diferentes e obvia a necessidade para a criação de linhas de células transfectadas com proteínas fluorescentes.
   1. Preparar 10 uM de solução de corante por mistura de 2 ul de 10 mM de manchas de células estoque em 2 mL de DMEM isento de soropara cada condição de celular. Aquecer esta a 37 ° C antes de adicionar às células.
   2. Remover o meio de cultura no interior da placa de 6 ml, deixando as células aderentes CECP na placa. Adicionar 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 2 ml de remover a mancha de células DMEM 10 uM / isento de soro, adicionado a cada placa
   3. Retorno da placa de cultura de 6 ml com a mancha de células para a temperatura de 37 ° C incubadora durante 40 min.
   4. Após 40 min, aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e depois aspirar-lo. Adicionar 1 mL de 0.025% de tripsina a cada placa e substitui-los na temperatura de 37 ° C incubadora.
   5. Adicionar 2 ml de DMEM com FBS a 10% após 3-5 minutos e transferir as células em suspensão para um tubo cónico de 15 ml. Rodar as células e ressuspenderam-se-lhes em 1 mL de meio DMEM com FBS a 10%.
   6. Contar as células com um hemocitómetro ou contador de células automatizado, e, em seguida, adicionar DMEM com FBS a 10% para criar uma concentração celular final de 300.000 culas por mL.

6. Galvanização Cabeça e NAs células cancerosas eck

1. Remover as placas de vidro de fundo com os ensaios de matriz-DRG da incubadora.
   NOTA: Mais uma vez, eles são adequados quando as neurites é pelo menos 75% da forma para a aresta da matriz, o que geralmente ocorre depois de 2 - 3 dias. Isto é melhor visto usando pelo menos uma objectiva 10X.
2. Aspirar o meio dentro da placa com fundo de vidro. Completamente aspirar o meio no interior do vidro bem sem remover as unidades de matriz de DRG.
3. Elaborar 200 mL da 300.000 células / mL de meio usando uma pipeta de 200 mL. Coloque duas gotas de células em cada ensaio de matriz de DRG. Execute esta etapa para cada gotícula matriz, criando quatro repetições de cada condição de células em um prato.
   NOTA: A forma hemisférica da matriz permite que as células se instalar um anel ao longo da periferia do ensaio (Figura 3-A, Figura 3b). Encontrar uma pipeta com um gatilho lisa torna a colocação do uniforme cai muito mais fácil.
4. Confirmar o número de células semelhantes e Distribution das várias condições célula sob microscopia de 4X.
5. Coloque as placas com fundo de vidro para a 37 ° C incubadora por aproximadamente 60 min. Nota: Embora haja apenas um pequeno volume de células e meios de informação (~ 150 mL), os ensaios não sequem até várias horas de tempo incubadora ter decorrido.
6. Após 60 min, adicionar cuidadosamente 4 ml de DMEM com 10% de FBS ao longo da parede lateral da placa de vidro de fundo.
   NOTA: Ao longo de um período de tempo, as células parcialmente aderir ao fundo da placa, e o método de adição do meio de não perturbar as células. Diferentes tipos de células faz demorar mais ou menos tempo para começar a aderir à placa de vidro de fundo.
7. Substitua todas as drogas exógenas ou fatores de crescimento neste momento para manter os níveis de concentração anteriores.
8. Devolver os ensaios para a 37 ° C incubadora, excepto quando são examinadas ao microscópio. Quantificar os resultados deste ensaio por imagem microscópica. Resumidamente, conte os fios de invasão perineural comem quatro quadrantes utilizando uma imagem microscópica 4X.
   NOTA: Um microscópio com um 4X capacidades objetivas e de fluorescência é adequada para a foto-documentação dos ensaios. O tamanho dos ensaios se encaixa muito bem dentro do campo de um objetivo 4X, que está detalhado o suficiente para capturar as áreas individuais de invasão perineural. perineural torna-se evidente dentro de 24 h, mas para além de 48 h, a integridade dos ensaios começa a enfraquecer, como as células tumorais dividir ao longo da periferia da matriz e invadir. Para além de 48 h, existe também o efluxo substancial de fibroblastos a partir do DRG, que obscurece a visualização utilizando microscopia de campo claro. Portanto, é aconselhável foto-documento os resultados com microscopia de 4X, pelo menos, duas vezes durante esta janela (por exemplo, às 24 e 48 h após o plaqueamento das células tumorais). Estar consciente de que estes são os ensaios 3-dimensionais, e é difícil de imagem completamente o ensaio de todo. Mais perineural ocorre num plano da parte inferior da placa, em que tele células estão incorporadas na matriz ligeiramente acima do fundo da placa. Porque este plano está perto de horizontal, a grande maioria das neurites com células tumorais são capturados em uma imagem de nível único em 4x.

Resultados

Após a dissecção do DRG e a colocação dentro da gotícula de matriz, a aparência do ensaio deve assemelhar-se a Figura 1. Note-se que o DRG não é perfeitamente redondos, mas que é centrado no interior da gotícula de matriz. Isto permite o crescimento de neurites em 360 graus, mostrado parcialmente na Figura 2. Esteja ciente de que certas partes do DRG enviar neurites mais rápido e em maior número do que outros, correspondendo tipicamente a on...

Discussão

Passos críticos dentro do Protocolo

Os passos mais importantes dentro deste protocolo são a dissecção e extração do gânglio da raiz dorsal preciso. transecção adequada da coluna vertebral e uma divisão da linha média longitudinal em duas-hemi-espinhas são essenciais para a obtenção de grandes números de DRG. Durante a dissecação de DRGs individuais, o gânglio nunca devem ser tratados diretamente, mas sim os fáscia circundantes deve ser agarrada com as pin?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Fetal bovine serum	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Phosphate buffered Saline 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operating Microscope	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Schott ACE I light source	Schott	A20500	Germany
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard Apparatus	60-3923	Holliston, MA
Dressing Forceps	Harvard Apparatus	72-8949	Holliston, MA
Athymic nude mice (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME