Baş ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu içinde perinöral invazyon İçin Bir Model

Özet

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Özet

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Giriş

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

Protokol

1. Kültür Orta hazırlanması ve Yemekleri (10 dk)

1. 100 uL, 96 oyuklu V-tabanlı plaka oyuklarına,% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) ilave edin.
2. 20 ° C dondurucu yarı katı matris yaklaşık 100 uL önceden bölünüp-vial kaldırma ve buz üzerine yerleştirin.
   NOT: Yarı katı matris sonraki adımlar için gerekli olan buz, sıvı duruma ulaşması için yaklaşık 30 dakika sürer, çünkü bu önceden dorsal kök ganglion (DRG) hasat yapın. her zaman buz üzerinde yan katı matris tutmak için başarısızlık bir düşük kaliteli matris damlacık neden olur.
3. Etiket cam alt kalıcı mürekkep ile kültürler plakalar, plaka alt yüzeyinde dört bir köşesinden her benzersiz tanımlayıcılar oluşturma. plaka yüzeyini soğutmak için buz üzerinde plakaları sağ tarafını yukarı yerleştirin.
   NOT: Her fare verimleri 32-40 DRG, so-soğuk ön pi gerekli değildir 40'a 1'den etiketlemeksoğutulmuş ipuçları potansiyel matris damlacıklarının yerleştirerek matris tutarlılık farklılıkları tanıtan gidişatını üzerinde sıcak olacak gibi ipuçları pet.

Fare DRG 2. Diseksiyon (45 dk)

1. Böyle bir _CO2 odası ve bir torakotomi aracılığıyla belirli laboratuar protokoller uyarınca bir atimik çıplak fare öldürülür.
2. Diseksiyon alanı ve mikroskop ayarlayın. 15- veya 50-ml konik borular polistiren kapları steril, temiz ve düz alt kullanın.
   Not: Buna ek olarak, bunlar tek ve ucuz olarak, kesme yüzeyi olarak kullanım için uygun olan ve iğne veya iğne kullanılarak omurga tespiti için verir. Sadece sterilize aletler ve iğneler kullanın.
3. Doğal vizyon altında, düz ya da eğri ince bir makasla ile fare başkanı kuyruk kökünden omurga boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak.
4. SACR altında enine bölünmeden aynı makas kullanınal omurga. tüm yol makas kullanarak kafa tabanına kadar omurganın her iki tarafını teşrih. Bu noktada, servikal vertebra makas ile mümkün olduğunca cranially kadarıyla transeksiyon olduğundan emin olun.
5. düşük güçte çalışma mikroskop altında omurganın servikal ucunu gözlemleyin. beyaz omurilik paraspinal kaslar ve yumuşak doku değişken miktarlarda çevrili bir kemikli halka ortasında açıktır.
6. mikroskobik yaylı makas ile 3 vertebra gövdeleri - ilk 2 dorsal veya üstün yönü bölün. makas yay eylemini kullanarak, vertebral gövde diseksiyon orta hatta meydana sağlamak için kesilen bu ilk kemikli açın. sakral omurganın doğru küçük artışlarla devam edin ve sonra omurların ventral ya da alt yönü üzerinde aynı kesim tamamlayarak omurga bisect.
   NOT: Daha düşük TİG verimi neden olacaktır kemikli omurganın orta hat diseksiyonu sağlamak için başarısızlık.
7. at this noktası, omurga iki yarıya ayrılmıştır. yerinde ve steril bir plaka üzerinde aşağı bakacak omurilik ile, bir kenara bir hemi-omurga yerleştirin.
   NOT: yerinde omurilik bırakmak DRG omuriliğe derin olarak, kurumasını DRG'ler önleyecektir.
8. polistiren diseksiyon platform üzerinde iki adet 18-gauge iğne ile diğer hemi-omurganın her iki ucunu sabitleyin. Servikal sonunda başlayarak yavaşça yaklaşık 4 vertebra seviyelerinden omurilik geri soyma, (omurga dar olduğu için açıktır, DRG birbirine yakın olan ve kaburga ekleme vardır).
9. DRG bağlayan duyu sinirleri (genellikle iki) dikkat edin. sinirler DRG için eklemek alanda, nazikçe mikroskobik forseps ile çevreleyen fasya kavramak. Incelemek ve DRG boşaltmak için mikroskopik yaylı makas ile bu fasya ve diğer sinir dokusunu kırpın. Nazik geri çekme kemik omurga içindeki konumunun dışına DRG getirecektir.
   NOT: ArtanBu aşamada mikroskop gücü faydalıdır. önemli ölçüde neurites büyümesini sınırlayacaktır DRG için ezilme yaralanması. Bu asla doğrudan DRG tutarak kaçınılmalıdır değil, çevredeki fasya tutarak edilir.
10. Periferik sinir DRG serbest bırakmak için mikroskopik yaylı makas ile (DRG genellikle diseksiyon görünümüne derin göreceli bir çevresel sinir, vardır) kesin.
    NOT: sinir uçları ve DRG yüzden bu noktada DRG mümkün olduğunca yakın bu kesim yaparak, gerginlik sırasında başlayan idealdir olduğu tespit etmek kolay değildir. Bu uzak şube kesilir sonra, proksimal dallar da kesilmiş.
11. mikroskobik yaylı makas ile herhangi bir sokak sinir lifleri veya fasiyal ekleri DRG Trim. Yeterli izole edildikten sonra, 96-gözlü V-dipli levhanın içinde oda sıcaklık ortamına DRG yerleştirin.
    NOT: levha beyaz DRG kolay alt mm görselleştirme yapar altında karanlık bir arka plan yerleştirilmesi. Sadece EAC bir DRG yerh iyi; Bu şekilde, daha kolay daha sonraki adımlarda açıklanabilir.
12. bir hemi-omurga ve daha sonra diğer aşağı Bu işlemi tüm yol tekrarlayın. 40 - 32 toplam 20 DRG'ler, - Her iki taraf 16 verir.
    Not: Bu daha az DRG'ler varsa, omurga diseksiyon sefalad ve / veya kaudal gerçekleştirilebilir gerekmektedir. DRG bir kaudal ilerledikçe giderek daha az iyi tanımlanmış olur.

Yarı Katı Matris Damlacıkların 3. Hazırlama (

1. buz bir bardak iyi alt plakasını çıkarın ve ameliyat mikroskobu altında bir buz bloğu üzerine yerleştirin. Emin matris kısım her zaman buz üzerinde kalır emin olun.
2. de camın kenarından damlacık kendisi en az büyük bir mesafe bırakarak, bir 2-uL ya da 10-uL Mikropipet cam-alt plaka dört köşesinin her birinde matrisin 1.5 uL damlacık yerleştirin.
   1. doğrudan üzerine pipet ucu yerleştirin45 derecelik bir açıyla cam. Yavaşça matrisi pipetlemeyin. matris plaka üzerinde devreye girer sonra yavaş yavaş cam alt uzaklaşın.
      NOT: matris ve cam arasındaki yüzey gerilimi mükemmel bir hemisfer her zaman oluşturmanız gerekir.
   2. matris damlacık içine istenmeyen hava enjeksiyon matrisi damlacık çok daha büyük çapı yapar ve kaldırmak zor, çünkü ucu, boş hemen önce pipetleme durdurun.
      NOT: pipetleme el stabilize etmek için bir ikinci el kullanarak daha doğru yerleştirilmesini kolaylaştırır.

Yarı sert Matrix damlacıklar halinde DRG 4. Yerleştirme (

1. kısaca oda sıcaklığında (~ 1 dk) matris damlacıkları ile plaka bırakın. Bu biraz DRG kesin yerleştirilmesi için daha kolay hale matris sertleştiği.
2. Scoop (kavramak değil) DRG yavaşça sol elinde kapalı mikroskobik forseps ile. Yine, küçük karşı koyu bir arka plan, beyazDRG görüntülenmesini kolaylaştırır. sağ elinde bir 21-gauge iğne ucuna DRG aktarın. Bu transfer forseps üzerinde kalan medyayı bırakacaktır.
3. Yavaşça 21 gauge iğne (Şekil 1) kullanılarak matris damlacığının ortasına DRG yerleştirin. Çoğu zaman, DRG kolayca matrise yayınlayacak ve iğne ile merkezi olarak yerleştirilmiş olabilir.
   1. DRG iğne sopa varsa, iğne kapalı ve matris damlacık içine DRG itmek için mikroskobik forseps kullanabilir. Bir laboratuvar ile mikroskobik forseps Wick uzak aşırı medya silin.
      NOT: matrise medyayı Tanıtımı tahlil çapı, hacmi ve tutarlılık değiştirecektir. renk veya renkli yazı ile bir buz bloğu bu hassas sürecin görselleştirme kolaylaştırır arka plan kontrast sağlar.
4. Plaka dört DRG'ler sahip sonra, DRG matris damlacık merkezinde olduğundan emin olmak için son bir kontrol yapın. ayarlamalar yapın21-guage iğne ile gerektiği gibi.
5. 37 ° C inkübatör tamamlanmış plaka aktarın. Bu yarı katı matris kuvvetlendirmek ve konumda DRG çözecektir.
6. DRG'ler tümü için bu işlemi tekrarlayın. Negatif kontrol olarak bir DRG olmadan boş matriks damlacıkları yerleştirin.
7. Tüm levhalar tamamlayan ve en az 3 dakika süreyle 37 ° C inkübatör maruz bırakılmasından sonra, her cam alt plakaya% 10 FBS ortamı ile DMEM 4 ml. hafif bir açıyla plaka koyun ve yavaş yavaş yavaş yavaş matris DRG birimleri ile temas şekilde, orta ekleyin.
   NOT: orta, çok hızlı ya da güçlü bir şekilde matrisi ve / veya DRG eklenirse yerinden olabilir.
8. - 72 saat sonraki 48 ve 37 ° C inkübatör tahlilleri saklayın.
   NOT: testlerin periyodik muayene matrisi kenarı (Şekil 2) doğru neurites çevresel akıbet gösterecektir. neurites matrise yol dörtte üçü daha büyük olduğunda, onuhücreler plaka uygundur.

Baş ve Boyun Kanserleri Hücrelerinin 5. Hazırlık

Not: baş ve boyun yassı hücreli karsinom hücreleri dışındaki hücre hatları, bu deney tasarımında kullanılabilir.

1. 37 ° C kuluçka makinesi içinde tercih edilen şişeler veya kültür tabaklarında,% 10 FBS DMEM skuamöz hücreli karsinoma hücre çizgileri koruyun. tüm orta kültürü şişesi veya çanak deney, emme hücreleri hazırlamak ve PBS ile iki kez yıkayın. % 10 FBS DMEM, ardından 5 dakika için% 0.025 tripsin, uygun bir miktarda eklenerek hücrelerin süspansiyonu. 6 ml kültür tabaklarında içine hücre ve ortam karışımı pipetle 4 mi.
   NOT: 6-ml kültür plakası fazlasıyla hücreler de sağlar, hatta en az% 50 konfluent.
2. boyama ve DRG deneyi üzerinde kaplama 24 saat önce farklı koşullara HNSCC hücre hatları Açığa. Yeniden doz hücre tutarlı environme korumak için kaplama bir kez durumnt.
   Not: Hücre kültür tabaklarına 1 antikorları, büyüme faktörleri, sitokinler, ya da diğer moleküllerin ekleyin - Fare diseksiyon ve matrise DRG yerleştirilmesinden 2 gün.
3. (- 3 gün matris içine DRG hasat ve implantasyon sonrası 2) hücreleri kaplama önce floresan hücre lekeleri 1 saat ekleyin.
   NOT: hücre zarından serbestçe geçmesine burada kullanılan özel lekeler; Bununla birlikte, hücre içi tiol grupları ile reaksiyona sokularak, leke hücre içinde kalır ve yavru hücrelere de geçirilir. boyama büyük deneylerde görüntülenmesini kolaylaştırır. Bu deneylerin zaman aralığı 3 gün, - floresans 2 mevcut olduğu için, bu, geçici lekeler Bu tahliller için idealdir. Aynı zamanda, pek çok farklı renk kullanımına izin verir ve floresan protein transfekte hücre çizgileri oluşturmak için ihtiyacı ortadan kaldırmaktadır.
   1. serumsuz DMEM 2 mL 2 uL 10 mM stok, hücre lekeleri karıştırılarak boya çözeltisi 10 um hazırlanmasıHer hücre durumu için. hücrelere eklenmeden önce 37 ° C'ye kadar, bu ısıtın.
   2. plaka üzerinde yapışık HNSCC hücreleri bırakarak, 6 mL plaka içinde kültür ortamı çıkarın. 10 uM hücresi leke / serumsuz DMEM mL fosfat tamponlu tuz (PBS) 2 ml ilave edilir ve 2 çıkarın her bir plakaya ilave
   3. 40 dakika için 37 ° C inkübatör hücre leke ile 6 ml kültür plakası döner.
   4. 40 dakika sonra, ortam aspire. 2 mL PBS ekleyin ve sonra aspire. Her bir plaka için% 0.025 tripsin 1 ml ilave edilir ve 37 ° C inkübatör değiştirin.
   5. 3 sonra% 10 FBS ile DMEM 2 mL ekleyin - 5 dakika ve 15 ml konik tüp askıya hücreleri aktarın. hücreleri Spin ve% 10 FBS DMEM 1 mL bunları yeniden askıya alınmıştır.
   6. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayımı ve ml başına 300.000 hücre nihai hücre konsantrasyonu oluşturmak için,% 10 FBS bulunan DMEM ekleyin.

6. Kaplama Başkanı ve Neck Kanser Hücreleri

1. inkübatör matris-DRG deneyleri ile cam alt plakaları sökün.
   Not: - 3 gün, nevritlerin genellikle 2 sonra ortaya çıkan matris, kenarına bir şekilde en az% 75 olduğu zaman yine, uygun bulunmaktadır. Bu en iyi, en azından bir 10X objektif kullanılarak görülüyor.
2. Cam alt plaka içinde ortamı aspire. Tamamen iyi matris-DRG üniteleri çıkarmadan camın içinde orta aspire.
3. 200 mcL pipet kullanarak 300.000 hücre / mL ortamı 200 uL hazırlayın. Her matris-DRG tahlil üzerinde hücrelerin iki damla yerleştirin. bir plaka üzerinde her hücre durumunun dört tekrarlar oluşturarak her matris damlacık için bu adımı gerçekleştirin.
   Not: matris Şekillerde yanm-küresel hücrelerin deneyi (Şekil 3a, Şekil 3b) çevresi boyunca halka yerleşmeye izin verir. pürüzsüz tetikleyici ile bir pipet bulma üniforma yerleştirme çok daha kolay düşer hale getirir.
4. Benzer hücre sayıları ve di onaylamak4X mikroskopta çeşitli hücre koşullarının PAZARLAMA.
5. Yaklaşık 60 dakika boyunca 37 ° C inkübatör içine cam alt tabak yerleştirin. Not: hücreler ve ortam (~ 150 mL) arasında sadece küçük bir hacim olsa da kuluçka süresi birkaç saat geçtikten kadar deneyler kuru değildir.
6. 60 dakika sonra, yumuşak cam alt plakanın yan duvar boyunca,% 10 FBS DMEM 4 ml.
   Not: bir süre içinde, hücreler, kısmen levha alt ve hücrelerin rahatsız etmez ortam ilave yöntemine uygun. Farklı hücre tipleri cam alt plakaya bağlı başlaması fazla veya daha az bir zaman alır olun.
7. Bir önceki konsantrasyon seviyesini korumak için şu anda herhangi bir eksojen ilaçlar veya büyüme faktörleri değiştirin.
8. onlar mikroskopik olarak incelenir dışında, 37 ° C inkübatör deneyleri dönün. mikroskopik görüntüleme ile bu tayinin sonuçları ölçmek. Kısaca, ile perinöral invazyon ipliklerini saymakdört çeyrek daireye 4X mikroskobik görüntü kullanılarak.
   NOT: 4X objektif ve floresan yetenekleri ile bir mikroskop fotoğrafı-belgeleyen deneyleri için yeterlidir. tahlillerin boyutu perinöral invazyon bireysel alanlarda yakalamak için yeterince detaylı bir 4X objektif, alanında güzel uyuyor. Perinöral invazyon 24 saat içinde belirgin hale gelir, ancak 48 saat ötesinde, tahlillerin bütünlüğü tümör hücreleri matris çevresi boyunca bölmek ve işgal gibi zayıflatmak başlar. 48 saat ötesinde, aynı zamanda aydınlık mikroskopi kullanılarak görselleştirme gizler DRG gelen fibroblast önemli efflux vardır. Bu nedenle, bu pencerede sırasında en az iki kez fotoğraf belge 4X mikroskobu ile sonuçları tavsiye edilir (örneğin, tümör hücreleri kaplama sonra 24 ve 48 saatte). Bu 3 boyutlu analizler, ve tamamen görüntü tüm tahlil zor olduğunu dikkatli olun. Çoğu perinöral invazyon plakanın alt t bir düzlemde gerçekleşiro hücreler hafifçe plakanın alt yukarıdaki matriks içinde gömülürler. Bu düzlem, yatay yakın olduğu için, tümör hücreleri ile neurites büyük çoğunluğu 4X tek bir düzey görüntü yakalanır.

Sonuçlar

DRG diseksiyonu ve matris damlacık içinde yerleştirildikten sonra, testin görünüş DRG mükemmel yuvarlak olmadığı Şekil 1. Not benzer olmalıdır, ancak matris damlacık içinde ortalanır. Bu, Şekil 2'de kısmen gösterilen 360 derece nöritlerin büyümesinin, sağlar. DRG belirli kısımları ise genellikle efferent ve afferent sinir dalları girdi ve sırasıyla DRG çıkıldı nerede karşılık, diğerlerinden daha hızlı ve daha f...

Tartışmalar

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

Bu protokol kapsamında en önemli adımlar hassas diseksiyon ve dorsal kök gangliyon çıkarma vardır. İki hemi-dikenler içine omurga ve orta hat-boyuna bölünme uygun transseksiyon DRG çok sayıda elde etmek önemlidir. Bireysel TİG'lerin diseksiyonu sırasında, ganglion doğrudan ele asla, daha ziyade çevredeki fasya mikroskobik forseps ile kavranabilir olmalıdır. Bunu yapmak için başarısızlık olasılığı neuri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Fetal bovine serum	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Phosphate buffered Saline 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operating Microscope	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Schott ACE I light source	Schott	A20500	Germany
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard Apparatus	60-3923	Holliston, MA
Dressing Forceps	Harvard Apparatus	72-8949	Holliston, MA
Athymic nude mice (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME