Un modèle pour périneural Invasion en tête et du cou Carcinome épidermoïde

Résumé

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Résumé

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Introduction

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

Protocole

1. Préparation du milieu de culture et de plats (10 min)

1. Ajouter 100 ul de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum de fœtus bovin (FBS) dans les puits d'une plaque à fond en V à 96 puits.
2. Suppression d'un pré-aliquotés-flacon d'environ 100 pi de la matrice semi-solide du congélateur 20 ° C et le placer directement sur la glace.
   NOTE: Pour ce faire, avant le ganglion de la racine dorsale (DRG) récolte parce que la matrice semi-dure environ 30 minutes pour atteindre l'état liquide sur la glace, ce qui est nécessaire pour les étapes ultérieures. Défaut de conserver la matrice semi-solide sur la glace en tout temps se traduira par une matrice de gouttelettes de mauvaise qualité.
3. Étiquette à fond de verre cultures plaques avec l'encre indélébile, en créant des identificateurs uniques dans chacun des quatre coins de la surface inférieure de la plaque. Placez les plaques de droite sur la glace pour refroidir la surface de la plaque.
   REMARQUE: les rendements Chaque souris 32 - 40 DRG, afin de les étiqueter de 1 à 40. Il est nécessaire de pré-refroidissement pipet conseils, comme des conseils réfrigérés chaufferont au cours de placer les gouttelettes de la matrice, ce qui pourrait introduire des différences dans la cohérence de la matrice.

2. Dissection de Murine DRG (45 min)

1. Euthanize une souris nude athymiques selon des protocoles spécifiques de laboratoire, tels que par l'utilisation d'une chambre de CO ₂ et une thoracotomie.
2. Mettre en place la zone de dissection et microscope. Utilisez le dessous propre, stérilisé, et plat des récipients en polystyrène pour 15- ou 50-ml tubes coniques.
   NOTE: En outre, ils sont appropriés pour une utilisation en tant que surface de dissection, car ils sont peu coûteux, jetable, et à permettre la fixation de la colonne vertébrale en utilisant des épingles ou des aiguilles. Utilisez uniquement des instruments et des aiguilles stérilisées.
3. En vertu de la vision naturelle, faire une incision longitudinale le long de la colonne vertébrale de la racine de la queue à la tête de la souris avec une paire de ciseaux fins droites ou courbes.
4. Utilisez les mêmes ciseaux pour diviser transversalement en dessous du sacrépine al. Disséquer les deux côtés de la colonne vertébrale tout le chemin jusqu'à la base du crâne à l'aide des ciseaux. À ce stade, faire en sorte que la colonne cervicale est sectionnée crânialement autant que possible avec des ciseaux.
5. Observer la fin cervicale de la colonne vertébrale sous le microscope opératoire à faible puissance. La moelle épinière blanche apparaît au milieu d'un anneau osseux, qui est entouré par des quantités variables de muscles spinaux et des tissus mous.
6. Diviser la dorsale ou face supérieure des 2 premiers - 3 organes vertébrales avec des ciseaux de printemps microscopiques. Utilisation de l'action du ressort des ciseaux, ouvrir cette osseuse initiale coupé à veiller à ce que la dissection du corps vertébral a eu lieu sur la ligne médiane. Continuer par petits incréments vers la colonne vertébrale du sacrum, puis coupera la colonne en effectuant des coupes identiques sur la face ventrale ou inférieure des corps vertébraux.
   REMARQUE: Ne pas assurer la dissection médiane de la colonne vertébrale osseuse se traduira par un rendement de DRG inférieur.
7. À this le point, la colonne vertébrale est divisée en deux moitiés. Placez une hémi-colonne vertébrale de côté, avec la moelle épinière en place et vers le bas sur une plaque stérile.
   NOTE: En sortant de la moelle épinière en place permettra d'éviter les DRG de se dessécher, les DRG sont profondes à la moelle épinière.
8. Fixer chaque extrémité de l'autre hémi-colonne avec deux aiguilles de calibre 18 sur le polystyrène disséquer la plate-forme. À partir de la fin du col utérin (ce qui est apparent parce que la colonne vertébrale est plus étroite, le DRG sont plus proches les uns des autres, et il y a des insertions des côtes), peler doucement la moelle épinière d'environ 4 niveaux vertébraux.
9. Observer les nerfs sensoriels (généralement deux) reliant la DRG. Dans la zone où les nerfs insérer le DRG, saisir délicatement les fascia environnantes avec des pinces microscopiques. Disséquer et couper ce fascia et d'autres tissus nerveux avec les ciseaux de printemps microscopiques pour libérer le DRG. rétraction douce apportera la DRG hors de sa position au sein de la colonne vertébrale osseuse.
   NOTE: L'augmentation de lapuissance de microscope à cette étape est bénéfique. Crush blessures à la DRG limitera considérablement la croissance des neurites. Ceci est évité en ne saisissant directement le DRG, mais plutôt en saisissant les fascia environnantes.
10. Couper le nerf périphérique (le DRG a généralement un nerf périphérique, qui est profonde par rapport à la vue de dissection) avec les ciseaux de printemps microscopiques pour libérer le DRG.
    NOTE: Il est plus facile de déterminer où les extrémités nerveuses et DRG commence alors sur la tension, rendant ainsi cette coupe aussi près que possible de la DRG à ce point est idéal. Une fois que cette branche distale est coupée, les branches proximales sont taillés aussi bien.
11. Coupez le DRG de toutes les fibres nerveuses errants ou des pièces jointes aponévrotique avec les ciseaux à ressort microscopiques. Après isolement adéquat, placer le DRG dans le milieu à température ambiante à l'intérieur de la plaque de fond en V à 96 puits.
    NOTE: Placer un fond sombre sous la plaque permet de visualiser le sous-mm DRG blanc plus facile. Seulement placer un DRG dans each bien; De cette façon, ils peuvent être pris en compte plus facilement dans les étapes suivantes.
12. Répétez ce processus tout le long d'un hémi-colonne vertébrale et puis l'autre. Chaque côté donne 16 - 20 DRG, totalisant 32 - 40.
    NOTE: S'il y a moins de DRG que cela, la dissection de la colonne vertébrale doit être effectué plus céphalique et / ou caudale. Les DRG deviennent de moins en moins bien défini que l'on procède caudale.

3. Préparation de la matrice semi-solides Droplets (<1 min par plaque)

1. Retirer une plaque de verre bien-fond de la glace et le placer sur un bloc de glace sous le microscope opératoire. Assurez-vous que l'aliquote de la matrice reste sur la glace en tout temps.
2. Placer une goutte de 1,5 pi de matrice dans chacun des quatre coins de la plaque en verre à fond avec un 2-ul ou 10 ul micropipette, en laissant une distance au moins aussi grande que la goutte elle-même à partir du bord du verre puits.
   1. Placez la pointe de la pipette directement surle verre à un angle de 45 degrés. pipeter lentement la matrice. Déplacez lentement à partir du fond de verre après la matrice est engagée sur la plaque.
      NOTE: La tension superficielle entre la matrice et le verre devrait créer un hémisphère parfait à chaque fois.
   2. Arrêtez pipetage juste avant la pointe est vide, car l'injection accidentelle d'air dans la gouttelette de matrice fait le diamètre de la gouttelette de matrice beaucoup plus grande et il est difficile à enlever.
      REMARQUE: L'utilisation d'une seconde main pour stabiliser la main de pipetage facilite un positionnement plus précis.

4. Insertion de DRG en demi-dur Matrice Droplets (<2 min par plaque)

1. Laissez la plaque avec les gouttelettes de la matrice brièvement à la température ambiante (~ 1 min). Cette raidit légèrement la matrice, ce qui rend plus facile pour le placement précis de la DRG.
2. Scoop (ne pas saisir) le DRG délicatement avec une pince microscopiques fermées dans la main gauche. Encore une fois, un fond sombre contre le petit, blancDRG facilite la visualisation. Transférer le DRG à la pointe d'une aiguille de calibre 21 dans la main droite. Ce transfert laissera médias résiduel sur la pince.
3. Insérez délicatement le DRG dans le milieu de la gouttelette de la matrice en utilisant l'aiguille de calibre 21 (Figure 1). La plupart du temps, la DRG se libérer facilement dans la matrice et peut être placé au centre avec l'aiguille.
   1. Si le DRG colle à l'aiguille, utilisez la pince microscopiques pour pousser le DRG hors de l'aiguille et dans la gouttelette de la matrice. Wick l'excès de médias de la pince microscopiques avec un laboratoire essuyer.
      REMARQUE: L'introduction des médias à la matrice va modifier le diamètre, le volume et la consistance de l'essai. Un bloc de glace avec la couleur ou l'écriture de couleur fournit contraste de fond, ce qui facilite la visualisation de ce processus délicat.
4. Après que la plaque comporte quatre DRG, effectuer une inspection finale pour garantir que le DRG se trouve au centre de la gouttelette de la matrice. Faire des ajustementsau besoin avec l'aiguille 21 jauge.
5. Transférer la plaque terminée à un incubateur à 37 °. Cela va se solidifier la matrice semi-solide et fixer la DRG en position.
6. Répétez ce processus pour tous les DRG. Placez des gouttelettes d'échantillon à blanc sans DRG comme témoin négatif.
7. Ajouter 4 ml de DMEM avec 10% de FBS à chaque plaque de verre à fond après avoir terminé toutes les plaques et en les exposant à la 37 ° C incubateur pendant au moins 3 min. Placer la plaque à un léger angle et ajouter lentement le milieu, de telle sorte qu'il vient progressivement en contact avec les unités matrice-DRG.
   NOTE: Si le milieu est ajouté trop rapidement ou avec vigueur, la matrice et / ou DRG peut se détacher.
8. Stocker les essais dans le 37 ° C incubateur pour la prochaine 48-72 h.
   NOTE: Examen périodique des essais montrera excroissance périphérique de neurites vers le bord de la matrice (figure 2). Lorsque les axones sont supérieures aux trois quarts du chemin de la matrice, ilest appropriée à la plaque les cellules.

5. Préparation de la tête et du cou cellules cancéreuses

NOTE: Les lignées cellulaires autres que la tête et les cellules de carcinome des cellules squameuses du cou peuvent être utilisés dans cette conception expérimentale.

1. Maintenir les lignes de carcinome spino cellulaires de cellules dans du DMEM avec 10% de FBS dans des flacons préférés ou des boîtes de culture dans un incubateur à 37 °. Pour préparer des cellules pour l'expérimentation, l'aspiration de tout le fluide à partir du flacon de culture ou un plat et le laver deux fois avec du PBS. Les cellules en suspension par addition d'une quantité appropriée de 0,025% de trypsine pendant 5 minutes, suivi par du DMEM avec 10% de FBS. Introduire à la pipette 4 ml du mélange de cellules et de support dans des boîtes de culture de 6 ml.
   NOTE: Une plaque de culture de 6 mL fournit plus qu'assez des cellules, même si moins de 50% de confluence.
2. Exposer les lignées cellulaires de différentes conditions HNSCC 24 heures avant la coloration et le placage sur le dosage des DRG. Re-doser l'état une fois que les cellules sont étalées à maintenir une environme cohérenteNT.
   REMARQUE: Ajouter des anticorps, des facteurs de croissance, cytokines, ou d'autres molécules pour les boîtes de culture cellulaire 1 - 2 jours après la dissection de la souris et l'implantation de la DRG dans la matrice.
3. Ajouter les taches de cellules fluorescentes 1 h avant l'étalement des cellules (2 - 3 jours après la récolte du DRG et l'implantation dans la matrice).
   NOTE: Les taches particulières utilisées ici passer librement à travers la membrane cellulaire; Cependant, après avoir fait réagir avec des groupes thiol intracellulaire, la tache persiste dans la cellule et est transmis aux cellules filles. La coloration facilite grandement la visualisation dans les dosages. Ces taches temporaires sont idéales pour ces essais, car la fluorescence est présente pour 2 - 3 jours, ce qui est le calendrier de ces expériences. Elle permet aussi l'utilisation de plusieurs couleurs différentes, et qui évite la nécessité de créer des lignées de cellules transfectées avec des protéines fluorescentes.
   1. 10 uM de préparer une solution de colorant en mélangeant 2 ul de 10 mM de taches banque de cellules dans 2 ml de DMEM exempt de sérum,pour chaque état de la cellule. Chauffer ce à 37 ° C avant de l'ajouter aux cellules.
   2. Retirer le milieu de culture au sein de la plaque de 6 ml, en laissant les cellules adhérentes HNSCC sur la plaque. Ajouter 2 ml de tampon phosphate salin (PBS) et enlever 2 mL de la / DMEM exempt de sérum 10 pM cellule colorant ajouté à chaque plaque
   3. Retourner la plaque de culture de 6 mL avec la tache de cellule à l'étuve 37 ° C pendant 40 min.
   4. Au bout de 40 min, aspirer le milieu. Ajouter 2 mL de PBS, puis l'aspirer. Ajouter 1 mL de 0,025% de trypsine à chaque plaque et les remplacer dans le 37 ° C incubateur.
   5. Ajouter 2 mL de DMEM avec 10% de SBF, après 3 à 5 minutes et transférer les cellules en suspension dans un tube conique de 15 ml. Faire tourner les cellules et les remises en suspension dans 1 ml de DMEM avec 10% de FBS.
   6. Compter les cellules avec un hémocytomètre ou un compteur de cellules automatique, puis ajouter du DMEM avec 10% de FBS pour obtenir une concentration cellulaire finale de 300.000 cellules par ml.

6. Placage Head et NLes cellules cancéreuses eck

1. Retirez les plaques de verre à fond avec les tests matrice-DRG de l'incubateur.
   NOTE: Encore une fois, ils sont appropriés lorsque neurites sont au moins 75% du chemin vers le bord de la matrice, qui se produit généralement après 2 - 3 jours. Ceci est mieux visible en utilisant au moins un objectif 10X.
2. Aspirer le milieu dans la plaque de fond de verre. Complètement aspirer le milieu dans le verre bien sans retirer les unités matrice-DRG.
3. Dresser 200 ul du 300.000 cellules / ml de milieu à l'aide d'une pipette de 200 pi. Placez deux gouttes de cellules sur chaque essai matrice-DRG. Effectuez cette étape pour chaque gouttelette de la matrice, la création de quatre répétitions de chaque condition de cellules sur une plaque.
   Remarque: la forme hémisphérique de la matrice permet aux cellules de se déposer dans un anneau le long de la périphérie de l'essai (figure 3a, la figure 3b). Trouver une pipette avec un déclencheur lisse rend le placement uniforme tombe beaucoup plus facile.
4. Confirmer le nombre de cellules similaires et distribution des différentes conditions cellulaires sous 4X microscopie.
5. Placer les plaques de verre à fond dans l'incubateur à 37 ° C pendant environ 60 min. NOTE: Bien qu'il n'y ait qu'un petit volume des cellules et des médias (~ 150 pi), les essais ne se dessèchent pas avant plusieurs heures de temps d'incubation se sont écoulés.
6. Au bout de 60 min, ajouter doucement 4 mL de DMEM avec 10% de FBS le long de la paroi latérale de la plaque de verre inférieure.
   Remarque: Au cours d'une période de temps, les cellules adhèrent partiellement au fond de la plaque, et le procédé d'addition du milieu ne perturbe pas les cellules. Différents types de cellules font prendre plus ou moins de temps pour commencer à adhérer à la plaque de fond de verre.
7. Remplacer tous les médicaments exogènes ou facteurs de croissance à ce moment pour maintenir les niveaux de concentration précédents.
8. Remettre les essais à la 37 ° C incubateur, sauf quand ils sont examinés au microscope. Quantifier les résultats de cette analyse par imagerie microscopique. En bref, compter les brins d'invasion périneural avecen quatre quadrants en utilisant une image microscopique 4X.
   NOTE: Un microscope avec 4X capacités objectives et de fluorescence est adéquate pour la photo-documentation des tests. La taille des essais intègre parfaitement dans le champ d'un objectif 4X, qui est suffisamment détaillée pour capturer les différents domaines de l'invasion périneural. périneural invasion apparaît dans un délai de 24 heures, mais au-delà de 48 h, l'intégrité des essais commence à se fragiliser, comme les cellules tumorales se divisent le long de la périphérie de la matrice et envahissent. Au-delà de 48 h, il y a aussi efflux substantielle des fibroblastes provenant DRG, qui obscurcit la visualisation en utilisant la microscopie en fond clair. Par conséquent, il est conseillé de photo-document , les résultats avec la microscopie 4X au moins deux fois au cours de cette fenêtre (par exemple 24 et 48 heures après l' étalement des cellules tumorales). Soyez conscient que ce sont des essais en 3 dimensions, et il est difficile de complètement l'image l'ensemble du test. La plupart périneural invasion se produit dans un plan du fond du plateau, où til les cellules sont noyées dans la matrice légèrement au-dessus du fond de la plaque. Parce que ce plan est proche de l'horizontale, la grande majorité des neurites avec des cellules tumorales sont capturés dans une image à un seul niveau à 4X.

Résultats

Après la dissection du DRG et le placement des gouttelettes au sein de la matrice, l'apparition de l'essai doit ressembler à la figure 1. On notera que la DRG ne sont pas tout à fait rond, mais il est centré à l' intérieur des gouttelettes de matrice. Ceci permet l'excroissance de neurites dans les 360 degrés, représenté partiellement sur la figure 2. Soyez conscient que certaines parties de la DRG envoient des neurites plus rapi...

Discussion

Étapes critiques dans le Protocole

Les étapes les plus importantes dans ce protocole sont la dissection et l'extraction des ganglions de la racine dorsale précise. transection appropriée de la colonne vertébrale et une division médiane longitudinale en deux hémi-épines sont essentielles à l'obtention d'un grand nombre de DRG. Au cours de la dissection des DRG individuels, le ganglion ne doit jamais être traitée directement, mais plutôt les fascia ento...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Fetal bovine serum	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Phosphate buffered Saline 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operating Microscope	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Schott ACE I light source	Schott	A20500	Germany
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard Apparatus	60-3923	Holliston, MA
Dressing Forceps	Harvard Apparatus	72-8949	Holliston, MA
Athymic nude mice (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME