Модель для периневральная инвазия в области головы и шеи карцинома роговых клеток

Резюме

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Аннотация

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Введение

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

протокол

1. Приготовление культуральной среды и блюда (10 мин)

1. Добавьте 100 мкл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в лунки V-образным дном 96-луночного.
2. Удалить предварительно аликвоты флакона приблизительно 100 мкл полужидкой матрицы из морозильной камеры 20 ° C и поместите его непосредственно на льду.
   Примечание: Сделайте это до дорзального корневого ганглия (DRG) урожай, потому что полутвердые матрица занимает около 30 минут, чтобы добраться до жидкого состояния на льду, которая необходима для последующих шагов. Неспособность держать полутвердые матрицы на льду в любое время приведет матрицу капельку некачественный.
3. Этикетка со стеклянным дном культуры плиты с несмываемыми чернилами, создавая уникальные идентификаторы в каждом из четырех углов на нижней поверхности пластины. Место пластин правой стороной вверх на льду для охлаждения поверхности пластины.
   Примечание: выходы Каждая мышь 32 - 40 DRG, поэтому маркировать их от 1 до 40. Не надо предварительно холодок пидомашнее животное советы, как и охлажденные советы будут согревать в течение размещения капель матрицы, потенциально вводя различия в матричной последовательности.

2. Препарирование крысиных DRG (45 мин)

1. Эвтаназии в бестимусных голых мышей в соответствии с конкретными лабораторных протоколов, например, путем использования СО ₂ камеры и торакотомии.
2. Настройте область рассечение и микроскоп. Используйте чистую, стерилизуют и плоскую нижнюю сторону полистирола контейнеров для 15- или 50-мл конические пробирки.
   Примечание: Кроме того, они пригодны для использования в качестве поверхности рассекает, поскольку они недороги, одноразовые, и позволяют фиксации позвоночника с помощью булавок или игл. Используйте только стерилизованные инструменты и иглы.
3. Под естественным зрением, сделать продольный разрез вдоль позвоночника от корня хвоста к голове мыши с парой прямых или изогнутых тонких ножниц.
4. Используйте те же ножницы, чтобы поперечно разделяй ниже SacrАль позвоночника. Рассеките обе стороны позвоночника вплоть до основания черепа, используя ножницы. На данный момент, убедитесь, что шейный отдел позвоночника перерезают краниальном, насколько это возможно с помощью ножниц.
5. Обратите внимание на цервикальный конец позвоночника под операционным микроскопом при низкой мощности. Белый спинного мозга проявляется в середине костным кольцом, которое окружено различными количествами параспинальных мышц и мягких тканей.
6. Отделить спинной или превосходящую аспект первых 2 - 3 тел позвонков с микроскопическими пружинными ножницами. Используя пружинящее действие ножниц, открыть этот первоначальный костистые вырезать, чтобы гарантировать, что позвоночный рассечение тела произошел в средней линии. Продолжить небольшими шагами по направлению к крестцового отдела позвоночника, а затем рассекают позвоночника, выполнив одинаковые разрезы на брюшной или нижней аспекте тел позвонков.
   Примечание: необеспечение средней линии рассечения костного позвоночника приведет к снижению выхода DRG.
7. В This точка, позвоночник делится на две половины. Поместите один полугидрата позвоночник в сторону, со спинным мозгом на месте и лицевой стороной вниз на стерильную тарелку.
   Примечание: Выход из спинного мозга в месте будет препятствовать ДРГ от высыхания, так как DRGs глубоко в спинной мозг.
8. Закрепите либо конец другого полугидрата позвоночника с двумя 18-калибровочных игл на полистирольной рассечения платформе. Начиная с шейки матки конца (что очевидно, так как позвоночник уже, КСГ ближе друг к другу, и есть ребро инсерций), осторожно отгибают спинной мозг от приблизительно 4 вертебральных уровней.
9. Обратите внимание на сенсорные нервы (обычно два), соединяющие DRG. В области, где нервы вставки к DRG, мягко понять окружающие фасции с микроскопическими щипцов. Проанализируйте и дифферента этот фасции и другие нервные ткани с микроскопическими пружинными ножницами, чтобы освободить DRG. Нежный втягивание принесет DRG из своей позиции в костяной позвоночника.
   Примечание: УвеличениеМикроскоп мощности на этом этапе является полезным. Размозжение к DRG существенно ограничит рост невритов. Чтобы избежать этого, никогда не захватывая DRG непосредственно, а скорее путем захвата окружающих фасции.
10. Обрежьте периферических нервов (The DRG обычно имеет один периферийный нерв, который глубоко по отношению к рассекает зрения) с микроскопическими пружинными ножницами, чтобы освободить DRG.
    Примечание: Это проще всего выяснить, где нервные окончания и DRG начинается в то время как по напряжению, так что делает это сокращение как можно ближе к DRG на данный момент является идеальным. После этого дистальной ветви вырезают, ближние ветви обрезают, а также.
11. Обрежьте DRG любых паразитных нервных волокон или фасциальным вложений с помощью микроскопических пружинных ножниц. После адекватной изоляции, поместите DRG в комнатной температуре среды в 96-луночного V-образным дном.
    Примечание: Размещение темный фон под пластина делает визуализируя суб-мм белый DRGs легче. Только поместите один DRG в EACч хорошо; Таким образом, они могут быть объяснены более легко в последующих стадиях.
12. Повторите этот процесс весь путь вниз один полугидрата позвоночника, а затем другой. Каждая сторона дает 16 - 20 ДРГ, на общую сумму 32 - 40.
    Примечание: Если есть меньше DRGs, чем это, рассечение позвоночника необходимо проводить дальнейшую цефально и / или каудально. В DRGs становятся все более менее хорошо определена как один идет каудально.

3. Получение полутвёрдые Matrix Капельки (<1 мин на пластину)

1. Удалить один стакан хорошо нижнюю пластину из льда и поместите его на блок со льдом под операционным микроскопом. Убедитесь, что аликвоты матрицы остается на льду во все времена.
2. Поместите капельку 1,5-мкл матрицы в каждом из четырех углов со стеклянным дном пластины с 2-х мкл или 10-мкл micropipetter, оставляя расстояние по крайней мере, столь же большой, как и сама капельке от края стекла скважины.
   1. Поместите кончик пипетки непосредственно настекло под углом 45 градусов. Медленно пипеткой матрицу. Медленно отойти от стеклянным дном после того, как матрица занимается на пластине.
      Примечание: поверхностное натяжение между матрицей и стеклом должны создать идеальный полушарии каждый раз.
   2. Прекратить пипеткой непосредственно перед верхушкой пуст, так как непреднамеренное нагнетание воздуха в матрицу капельке составляет диаметр матрицы капельке гораздо большей и трудно удалить.
      Примечание: Используя вторую руку, чтобы стабилизировать пипетирования руку способствует более точного размещения.

4. Вставка DRG в полутвёрдые Matrix Капельки (<2 мин на пластину)

1. Оставьте пластину с матричными капель на короткое время при комнатной температуре (~ 1 мин). Это слегка напрягается матрицу, что делает его более легким для точного размещения DRG.
2. Совок (не понимают) DRG мягко с закрытыми микроскопическими пинцетом в левой руке. Опять же, темный фон, на маленький, белыйDRG облегчает визуализацию. Перенести DRG на кончик 21 иглы калибра в правой руке. Эта передача будет оставить остаточный носитель на пинцетом.
3. Аккуратно вставьте DRG в середину капельке матрицы с использованием 21 калибра иглы (рисунок 1). Большую часть времени, то КСГ легко релиз в матрицу и затем могут быть расположены по центру с иглой.
   1. Если КСГ прилипает к игле, использовать микроскопические щипцов, чтобы подтолкнуть DRG от иглы и в матрицу капельке. Фитиль от избыточных средств массовой информации из микроскопических щипцов с лаборатории салфеткой.
      Примечание: Введение средств массовой информации к матрице будет изменять диаметр, объем и последовательность анализа. Льдины с цветом или цветного фона письменной форме обеспечивает контраст, что облегчает визуализацию этого сложного процесса.
4. После того, как пластина имеет все четыре ДРГ, выполнить окончательную проверку, чтобы убедиться, что КСГ находится в центре матрицы капельке. приспосабливатьсяпо мере необходимости с 21-GUAGE иглой.
5. Перенести заполненную пластину на 37 ° С инкубатор. Это позволит укрепить полутвердый матрицу и зафиксировать DRG в заданном положении.
6. Повторите этот процесс для всех КСГ. Поместите пустой капли матрицы без DRG в качестве отрицательного контроля.
7. Добавить 4 мл среды DMEM с 10% FBS сред для каждого стеклянным дном пластины после завершения всех пластин и подвергая их 37 ° C инкубаторе в течение не менее 3 мин. Поместите пластину под небольшим углом и медленно добавить среды, таким образом, что он постепенно вступает в контакт с частями матрицы-DRG.
   Примечание: Если среда добавляется слишком быстро или энергично, матрицу и / или DRG может стать выбили.
8. Хранить анализы в 37 ° C инкубаторе в течение следующих 48 - 72 ч.
   Примечание: Периодическое рассмотрение анализов покажут круговую разрастание нейритов в направлении матрицы края (рисунок 2). Когда невриты больше, чем три четверти пути к матрице, егоУместно высевания клеток.

5. Подготовка головы и шеи клеток рака

Примечание: кроме головы и шеи клетки карциномы сквамозных клеток линии могут быть использованы в этой экспериментальной конструкции.

1. Поддержание плоскоклеточного линии клеток карциномы клеток в DMEM с 10% FBS в предпочтительных колбах или чашках для культивирования в 37 ° С инкубатор. Для подготовки клеток для экспериментов, а также засасывания все среды из культуральной колбы или блюдо и мыть его дважды PBS. Суспендирования клеток путем добавления соответствующего количества 0,025% трипсина в течение 5 мин с последующим DMEM с добавлением 10% FBS. Пипетка 4 мл клеточной и средств массовой смеси в культуральных чашках 6-мл.
   Примечание: Культуру пластина 6-мл обеспечивает более чем достаточное количество клеток, даже при менее чем 50% сплошности.
2. Expose клеточных линий ПРГШ к различным условиям за 24 ч до окрашивания и высева на анализе DRG. Повторная доза состояние после того, как клетки высевали, чтобы поддерживать последовательную environmeнт.
   Примечание: Добавить антитела, факторы роста, цитокины или других молекул к посуде клеточных культур 1 - 2 дней после рассечения мыши и имплантации DRG в матрицу.
3. Добавить люминесцентные клеточные пятна 1 ч до посева клеток (2 - 3 дня после сбора DRG и имплантации в матрицу).
   Примечание: Конкретные пятна, используемые здесь свободно проходят через клеточную мембрану; Тем не менее, после того, как взаимодействовать с внутриклеточными тиоловых групп, пятно остается внутри клетки и передается дочерним клеткам. Окрашивания значительно облегчает визуализацию в анализах. Эти временные пятна идеально подходят для этих анализов, поскольку флуоресценции присутствует в течение 2 - 3 дней, что сроки проведения этих экспериментов. Он также позволяет использование множества различных цветов и устраняет необходимость в создании флуоресцентного белка-трансфекции клеточных линий.
   1. Готовят 10 мкМ раствора красителя путем смешивания 2 мкл 10 мМ пятна запас клеток в 2 мл не содержащей сыворотки DMEMдля каждого состояния клеток. Подогреть это до 37 ° C перед добавлением к клеткам.
   2. Удалите культуральную среду внутри пластины 6-мл, оставляя прилипшие ПРГШ клетки на пластине. Добавить 2 мл фосфатного буферного раствора (PBS) и удалить 2 мл 10 мкМ клеток пятно / бессывороточной DMEM добавляли к каждой пластине
   3. Возвращение культуральную пластину 6 мл с клеточным пятном на 37 ° C инкубаторе в течение 40 мин.
   4. Через 40 минут, аспирата среду. Добавляют 2 мл PBS, а затем аспирацию его. Добавить 1 мл 0,025% трипсина к каждой пластине, и заменить их на 37 ° С инкубатор.
   5. Добавьте 2 мл DMEM с добавлением 10% FBS после 3 - 5 мин и переносят суспендированных клеток в конической трубе 15 мл. Спин клетки и ресуспендировали их в 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS.
   6. Граф клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, а затем добавить DMEM с 10% FBS для создания конечной концентрации клеток 300000 клеток на мл.

6. Покрытие головы и NКлетки рака Eck

1. Удалите с прозрачным дном пластины с матрицей-DRG анализов из инкубатора.
   Примечание: Опять же, они уместны, когда невриты, по меньшей мере 75% пути к краю матрицы, как правило, происходит через 2 - 3 дней. Это лучше всего видно с использованием по меньшей мере, объектив 10X.
2. Аспирируйте среды внутри стеклянным дном тарелку. Полностью аспирата среды внутри стекла хорошо без удаления матрицы DRG единиц.
3. Оформи 200 мкл 300000 клеток / мл среды с использованием пипетки 200-мкл. Поместите две капли ячеек над каждым анализом матрицы-DRG. Выполните этот шаг для каждой матрицы капельке, создавая четыре повторения каждого состояния ячейки на одной пластине.
   Примечание: полусферическую форму матрицы позволяет клеткам располагаться в кольце по периферии анализа (рис 3а, 3b) На рис. Нахождение пипетку с гладкой спусковой крючок делает размещение равномерного капель намного легче.
4. Подтвердите аналогичные числа клеток и диstribution различных условий клеток при 4X микроскопии.
5. Поместите прозрачным дном листы в 37 ° C инкубаторе в течение примерно 60 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, есть только небольшой объем клеток и средств массовой информации (~ 150 мкл), анализы не высыхают до нескольких часов времени инкубатора не прошло.
6. Через 60 мин осторожно добавляют 4 мл среды DMEM с 10% FBS, вдоль боковой стенки со стеклянным дном тарелку.
   Примечание: В течение определенного периода времени, клетки частично прилипают к нижней пластине, и способ добавления среды не нарушает клетки. Различные типы клеток может занять больше или меньше времени, чтобы начать прилипать к стеклянным дном тарелку.
7. Заменить любые экзогенные препараты или факторы роста в это время, чтобы сохранить прежние уровни концентрации.
8. Возвращение анализов на 37 ° С инкубатор, за исключением того, когда они исследуют под микроскопом. Количественно результаты этого анализа с помощью микроскопического изображения. Если коротко, то рассчитывать пряди периневральным инвазиив четырех квадрантах с использованием 4X микроскопического изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: микроскоп с 4-кратным объективных и флуоресцентных возможностей достаточно для фото-документирующего анализов. Размер анализов прекрасно вписывается в поле объектива 4X, который подробно описан достаточно, чтобы захватить отдельные районы периневральным вторжения. Периневральная инвазия становится очевидным в течение 24 ч, а за 48 ч, целостность анализов начинает ослабевать, так как опухолевые клетки делятся по периферии матрицы и вторжению. За 48 часов, есть также существенный отлив фибробластов от DRG, который затеняет визуализацию с использованием микроскопии светлого. Поэтому желательно фото-документировать результаты с 4 - кратным микроскопом , по крайней мере в два раза в течение этого окна (например, через 24 и 48 ч после посева клеток опухоли). Помните, что эти 3-мерные анализы, и это трудно полностью изображению весь анализ. Большинство периневральная инвазия происходит в плоскости, из нижней части пластины, где Тон клетки встроены в матрицу немного выше нижней части пластины. Поскольку этот самолет находится близко к горизонтали, подавляющее большинство невриты с опухолевыми клетками захватываются в образе одноуровневой в 4 раза.

Результаты

После рассечения DRG и размещение в матрице капельке, появление анализа должно походить на рисунок 1. Обратите внимание , что DRG не является идеально круглым, но по центру внутри матрицы капельке. Это позволяет разрастание нейритов в 360 градусов, как показано час...

Обсуждение

Критические шаги в рамках Протокола

Наиболее важные шаги в рамках этого протокола являются точное рассечение и извлечение спинальных ганглиях. Правильное перерезка позвоночника и срединный-продольного деления на две Hemi-шипов имеют решающее значени?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F-12 50/50 Mix with L-glutamine & 15 mM HEPES	Corning Cellgro	10-090-CV	Manassas, VA
Fetal bovine serum	Atlanta biologicals	S11150	Flowery Branch, GA
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	Grand Island, NY
Phosphate buffered Saline 1x	Corning	21-040-CM	Manassas, VA
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
Gamma Irradiated 35 mm glass bottom culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 Operating Microscope	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	Thornwood, NY
Schott ACE I light source	Schott	A20500	Germany
CellTracker	Life Technologies Corporation	C2925	Carlsbad, CA
BD PrecisionGlide Needle 18 G and 21 G	BD	305195	Franklin Lakes, NJ
Premium Microdissecting Tweezer	Harvard Apparatus	60-3851	Holliston, MA
Premium Fine Operating Standard Scissors	Harvard Apparatus	52-2789	Holliston, MA
Premium Spring Scissors	Harvard Apparatus	60-3923	Holliston, MA
Dressing Forceps	Harvard Apparatus	72-8949	Holliston, MA
Athymic nude mice (002019)	Jackson Laboratory	002019	Bar Harbor, ME