Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Resumen

Este protocolo permite un investigador aislar y caracterizar tejido residente macrófagos en varios sello inflamado los tejidos extraídos de modelos inducida por la dieta de los trastornos metabólicos.

Resumen

La obesidad promueve un estado inflamatorio crónico que es en gran parte mediado por los macrófagos residentes de tejido como macrófagos derivados de monocitos. Obesidad inducida por dieta (DIO) es un modelo valioso en el estudio del papel de la heterogeneidad del macrófago; sin embargo, aislamientos adecuados macrófago son difíciles de adquirir los tejidos inflamados. En este protocolo, describiremos los pasos de aislamiento y pautas necesarias de solución de problemas derivadas de nuestros estudios para la obtención de una adecuada población de macrófagos residentes de tejido de los ratones tras 18 semanas de alto contenido de grasa (HFD) o () alta-grasa/colesterol Intervención de la dieta HFHCD). Este protocolo se centra en tres tejidos de sello estudiados en obesidad y aterosclerosis, incluyendo la aorta, el hígado y tejido adiposo blanco (WAT). Destacamos cómo dualista uso del flujo cytometry puede alcanzar una nueva dimensión de aislamiento y caracterización de los macrófagos residentes de tejido. Una parte fundamental de este protocolo aborda las complejidades subyacentes a digestiones enzimáticas específicas de tejido y macrófagos aislamiento y subsecuente anticuerpo de superficie de la célula de tinción para análisis cytometric del flujo. Este protocolo de direcciones existentes complejidades subyacentes célula fluorescente activada (FACS) de clasificación y presenta aclaraciones a estas complejidades con el fin de obtener la caracterización amplia gama de poblaciones celulares adecuadamente ordenados. Métodos de enriquecimiento alternativo se incluyen para la clasificación de las células, como el hígado denso, lo que permite flexibilidad y manejo de tiempos cuando se trabaja con FACS. En Resumen, este protocolo ayuda al investigador para evaluar la heterogeneidad de macrófago de una multitud de los tejidos inflamados en un determinado estudio y proporciona interesantes consejos para solucionar problemas que han tenido éxito para la caracterización y aislamiento celular favorable de células inmunes en la inflamación mediada por DIO.

Introducción

Modelos de ratón se han utilizado para estudiar la dinámica de enfermedades humanas. Correcto aislamiento de las células residentes del tejido de los ratones en un estado enfermo puede proporcionar una plataforma para la comprensión de las contribuciones moleculares y celulares en la patogenia de una enfermedad¹. Un trastorno que es de vital importancia es la obesidad. La incidencia de la obesidad sigue aumentando en todo el mundo en paralelo con la resistencia a la insulina y tipo 2 mellitus de la diabetes, enfermedad cardiovascular y enfermedad del hígado graso^2,3. Consumo excesivo de nutrientes es más sesgado por disminución de la actividad física provocando señales alteradas provenientes del tejido adiposo, que puede alterar el medio celular de otros tejidos periféricos como el hígado y aorta⁴. Tal interrupción de la homeostasis metabólica resulta en una inflamación sistémica crónica de bajo grado del⁵.

Activación clásica del residente a la aorta y el hígado, así como su contratación al tejido adiposo blanco (WAT) de macrófagos ha demostrado no sólo iniciar el dysregulation de señales metabólicas sino también sostener la inflamación^6,7. La heterogeneidad fenotípica y funcional de los macrófagos está fuertemente asociada con la patogénesis de la obesidad relacionada con comorbilidades⁷. La plasticidad dinámica de polarización macrófagos permite para que estas células exhiben una variedad de fenotipos activados que coordinan la progresión y resolución de⁸de la inflamación. Mientras que clásico activados macrófagos (M1) están implicados en la propagación de la inflamación, macrófagos alternativamente activados (M2) se han asociado con resolución y el tejido de reparación^9,10.

Como el cuerpo somete a estrés metabólico, tejido adiposo blanco se acumula anormalmente. El tejido adiposo ampliado atrae y retiene las células inflamatorias que alteran profundamente la función del adipocito normal para promover la resistencia a la insulina, hiperglucemia y diabetes mellitus tipo 2 en última instancia, resistencia a la insulina o hiperglucemia^{11, 12}. En paralelo, remodelaciones de tejido adiposo blanco en respuesta a señales inflamatorias por infiltran clásico activado macrófagos (cajeros automáticos) de tejido adiposo (M1) de^13,14. Este órgano multicelular ejerce una cascada de señales que hace descarrilar la función normal de otros órganos del cuerpo tales como la aorta y el hígado⁴.

El hígado es una potencia metabólica que se adapta en respuesta a estímulos procedentes de cerca dysregulated WAT¹⁵. Macrófagos hepáticos o células de Kupffer, en respuesta a cambios metabólicos, secretan citoquinas inflamatorias que transforman tanto parénquima y fenotipo de la célula no parenquimales y promoción la remodelación tisular. Acumulación de lípidos hepáticos, inflamación, depósitos de matriz extracelular excesivo, necrosis y función eventual pérdida sigue los insultos inflamatorios contribuyendo a la amplia gama de daño hepático asociados con enfermedad del hígado graso no alcohólico ^1617,de^,18.

En paralelo a WAT comprometido y función hepática, arterias grandes acumulan lípidos dentro de la pared arterial como el cuerpo somete a estrés metabólico crónico¹⁹. Acumulación lipídica arterial desencadena la secreción de quimioquinas por las células endoteliales activadas y posterior reclutamiento de monocitos²⁰. Una vez reclutados, monocitos proliferan, diferencian, ingieren las lipoproteínas y se convierten en células espumosas. Aterogénesis es iniciada y sostenida por la actividad proinflamatoria de reclutados y macrófagos cargados de lípidos residente de tejido. Sucumbir a las señales de estrés extracelular e intracelular transmitidas en este microambiente aterogénico, estos macrófagos participan luego en una cascada de señalización de apoptosis. Como estas células espumosas mueren, contribuyen a su contenido de lípidos que llena a la base necrótica de la lesión, que entonces conduce a ruptura de placa, infarto de miocardio y accidente cerebrovascular.

Colectivamente, la heterogeneidad de los fenotipos de macrófagos organiza en parte la obesidad inducida por cambios inflamatorios en los tejidos normales como WAT, hígado y aorta^8,21. Caracterización de reclutados y macrófagos residentes pueden proporcionar la penetración en posibles dianas moleculares que manipulan macrófago fenotipo¹. Para caracterizar eficazmente los macrófagos de los tejidos inflamados inducida por la obesidad, una suspensión unicelular se puede obtener a través de la digestión enzimática. Tales protocolos de disociación deben ser eficaces en degradar suficientemente tejido conectivo mientras que minimiza la muerte celular inmune y proporciona rendimiento óptimo de la célula. La mezcla de la enzima es dependiente en el tipo de tejido y su maquillaje estructural. Tejidos resistentes como la aorta requiere mayor actividad enzimática, en comparación con el hígado y el WAT, para lograr la disociación del tejido. De la suspensión de la célula, macrófagos residentes pueden ser inequívocamente caracterizados o aislados para mayores análisis aguas abajo como perfilamiento transcripcional.

Aquí se describe un protocolo específico de tejido que utiliza tejido dependiente de colagenasa digestión y citometría de flujo policromáticos efectivamente aislar y caracterizar macrófagos residentes de tejido obtenidos de la dieta tradicional inducida por obesidad, ateroesclerosis, esteatosis simple y esteatohepatitis modelos de ratón. Simultánea de marcadores de superficie celular con anticuerpos contra leucocitos (CD45 o CD11b) y macrófagos - antígenos específicos (F4/80) es de uso frecuente para identificar a las poblaciones de macrófagos²². Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación es una estrategia poderosa que se utiliza para ordenar estas poblaciones identificadas en alta pureza. La población clasificada puede evaluarse entonces perfiles de gen específico fenotipo mediante análisis molecular aguas abajo (por ejemplo, reacción en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real)²³. Aunque citometría de flujo estándar y clasificación de celda basados en citometría de flujo son herramientas poderosas en la distinción de macrófagos dentro de una suspensión sumamente heterogéneos, los protocolos anteriores deben optimizarse para asegurar la salida exitosa. En este estudio, se describen los protocolos que efectivamente aislaran y caracterizan los macrófagos específicos de tejido viable; más importante aún, este estudio proporciona penetración crucial en cuestiones técnicas que a menudo se presentan, así como de estrategias proactivas y solución de problemas para evitar o resolver.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales (secciones 1, 1.2 y 1.3) fueron aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) Universidad Estatal de Pensilvania.

Tejido	Preparación de Buffers de disociación	Volumen final	Almacenamiento de información
Tejido adiposo blanco (WAT)	Almacenador intermediario de la disociación: 2,5% HEPES, 10 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA), 3 mg/mL (0.3%) Colagenasa tipo II en de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) con glucosa de 4.5 g/L sin L-glutamina y sodio piruvato	500 mL	menos 80° C (alícuotas de 10 mL)
Hígado	25 x perfusión Tampón concentrado (PBC): 3.55 M NaCl, KCl, de 168 mM 240 mM HEPES, 150 mM NaOH en agua destilada desionizada H2O	500 mL	menos 20° C (alícuotas de 40 mL)
	Solución de preservación (PRB): 1% de BSA 1 x Buffer de perfusión	1 L	4 ° C
	Almacenador intermediario de la disociación: 1 x Buffer de perfusión complementado con 4,76 mM CaCl2 y 72 U/mL colagenasa tipo IV	50 mL (por ratón)	Preparar inmediatamente antes de su uso
Aorta	Almacenador intermediario de la disociación: 125 U/mL colagenasa tipo XI, 60 de U/mL hialuronidasa tipo I, 60 U/mL DNasa I, 450 de U/mL colagenasa tipo I, 20 mM HEPES 1 x de tampón de fosfato salino (PBS)	500 mL	menos 80° C (alícuotas de 10 mL)

Tabla 1: Recetas de búfer tejido perfusión específico.

1. disociación y aislamiento de tejido

1. Disociación y aislamiento de WAT
   1. Preparar los buffers de tejidos específicos según la tabla 1y guardarlos como se describe.
   2. Se preparan los siguientes reactivos.
      1. Preparar el buffer de digestión por descongelar el volumen adecuado de WAT disociación tampón y conservar a 4 ° C hasta su uso. Inmediatamente antes del uso, caliente la solución a 37 ° C. Preparar el tampón FACS preparando 1 x de tampón fosfato salino (PBS) que contiene 2% de suero bovino fetal (FBS).
   3. Aislamiento de WAT
      1. Eutanasia a una ratón en un dióxido de carbono (CO₂) llenada de cámara. Compruebe la efectividad antes de continuar a la etapa de disección.
      2. Sumerja el ratón eutanasia brevemente en un vaso de precipitados que contiene etanol al 70% hasta completamente empapado y cubierto con el etanol. Coloque la superficie ventral del ratón arriba en la etapa de disección y sujete el ratón adelante y las patas traseras a la Junta de disección utilizando una aguja de 21 G.
      3. Use pinzas de punta de medio punto para agarrar la piel abdominal anterior a la abertura uretral, luego use tijeras disección agudas para hacer un nick en la piel del abdomen simples.
      4. Inserte la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y haga una incisión lateral del abdomen a la caja torácica.
      5. Suavemente jale hacia atrás la piel para exponer la cavidad peritoneal intacta y haga una incisión lateral a través del peritoneo y tampoco doblar la membrana transparente o suprimir el tejido para exponer el WAT abdominal.
      6. Recoger las almohadillas de grasa perigonadal como se describe en Mann et al. ²⁴
         1. Las almohadillas de grasa perigonadal en ratones machos están ligadas al epidídimo y los testículos. En primer lugar localizar los testículos con medio punto de pinzas, sujete la mano de la cabeza del epidídimo y tire suavemente.
         2. Utilizando unas tijeras afiladas de disección, suprimir cada almohadilla grasa Epididimal por corte a lo largo de la superficie del epidídimo (cabeza, cuerpo y cola) y los testículos.
         3. Con pinzas, tire de la almohadilla de grasa mientras que corte a través del tejido conectivo ligado directamente a la estructura de epidídimo.
         4. Usando las pinzas, sujete firmemente el extremo de la almohadilla de grasa proximal al epidídimo y suavemente Retire la almohadilla de grasa de las gónadas
         5. En ratones hembra, los cojines de grasa perigonadal son libremente en el cuerpo del útero y el cuerno uterino.
         6. Con unas pinzas de punto medio, agarre el tejido de grasa perigonadal y tire suavemente el tejido del cuerpo del útero y el cuerno uterino.
         7. Suprimir cada cojín gordo cortando a lo largo del cuerpo de útero y el cuerno uterino con tijeras de disección agudas.
      7. Coloque la grasa en un plato de petri lleno de PBS y conservar en hielo para mantener el tejido húmedo.
   4. Disociación de WAT en suspensiones celulares solo
      1. Quitar exceso PBS de la caja Petri y utilice una cuchilla de filo único para finito el WAT abdominal en trozos pequeños.
      2. Con el borde afilado de la hoja de afeitar, raspar suavemente el picado WAT abdominal en un tubo de polipropileno colección etiquetada 15 mL que contiene 2 mL del tampón de disociación WAT.
      3. Incubar esta mezcla de tampón de digestión de tejido bajo lenta rotación continua a 37 ° C por 45 min.
      4. Filtrar el tejido digerido a través de un tamiz celular de 70 μm en un tubo de 50 mL la colección mientras se mueve el pistón de goma de un émbolo en un movimiento circular y continuará la suspensión de células del tamiz a través del filtro.
      5. Pipeta 2 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) a un tubo de la colección de 15 mL, pipetee suavemente arriba y abajo y lavar el filtro con la suspensión unicelular.
      6. Lave el filtro dos veces más con DMEM frío y colocar la suspensión de células individuales en el hielo.
      7. Centrifugue la suspensión de células a 300 x g a 4 ° C durante 8 minutos.
      8. Utilice un aspirador de vacío para extraer cuidadosamente adipocitos flotantes (primero) y queda sobrenadante. Asegúrese de no perturbar la fracción vascular estromal pildorada (SVF).
      9. Con una pipeta de 1000 μl, suavemente Resuspender el pellet en buffer de cloruro de amonio y potasio (ACK) para lisar eritrocitos según las instrucciones del fabricante.
      10. Diluir la suspensión anterior con DMEM y Centrifugue la suspensión de células a 300 g a 4 ° C durante 8 minutos.
      11. Resuspenda las células en PBS frío con un 2% FBS (tampón FACS) y contar las células en una cámara de Bürker/hemocitómetro.
      12. Transferencia de 1 x 10⁶ células (por citometría de flujo básico) o la suspensión de toda la célula (por FACS) para etiquetado 5 mL tubos de poliestireno fondo redondo. Seguir sección 2 para protocolo de tinción de citometría de flujo.
2. Disociación y aislamiento de tejido del hígado
   Nota: Este protocolo fue adaptado de Smedsrød²⁵.
   1. Preparar los buffers de tejidos específicos según la tabla 1 y guardarlos como se describe.
   2. Se preparan los siguientes reactivos.
      1. Preparar 1 x Buffer de perfusión (PB), diluyendo 40 ml de PBC en 960 mL ultrapura H₂O. pre-caliente una jeringa llena con 50 mL de PB a 37 ° C, justo antes de la perfusión se inicia. Eliminar burbujas de aire presentes.
         1. Para eliminar las burbujas de aire, invierta la jeringa en la punta de la cerradura de leur quede apuntando hacia arriba. Toque o mueva la jeringa hasta que las burbujas de aire al pf superior la jeringa. Empuje suavemente el émbolo para expulsar el aire
      2. Preparar el buffer de digestión diluyendo 0.5 mL de solución de CaCl₂ de 476 mM49,5 ml 1 x buffer de perfusión. Añadir 3600U de colagenasa tipo IV a lo 4,76 mM CaCl₂ – solución de PB. Caliente previamente una jeringa llenada con 50 mL de tampón de digestión a 37 ° C antes de la perfusión se inicia. Eliminar burbujas de aire presentes como se describe en el paso 1.2.2.1.1.
      3. Preparar la preservación Buffer (PRB) disolver 2,5 g albúmina de suero bovino (BSA) en tampón de perfusión de 1 x 250 mL. Almacenar a 4 ° C o no en hielo hasta su uso.
      4. Preparar el tampón FACS con 1 x PBS y el 2% de SBF.
   3. Aislamiento de tejido del hígado
      1. Eutanasia a un ratón por CO₂ asfixia, saturar ratón con etanol al 70% para prevenir la contaminación de los órganos intraabdominales con la piel.
      2. Posición el ratón ventral hacia arriba en un poliestireno espuma tablero de disección y garantizar el ratón y posteriores patas a la Junta de disección utilizando una aguja de 21 G.
      3. Para exponer la pared torácica y la cavidad peritoneal, agarre la piel abdominal cerca de la abertura uretral utilizando unas pinzas de punta de medio punto. Utilice unas tijeras de disección aguda para crear una pequeña incisión en la piel abdominal comprendida.
      4. Inserte la hoja inferior de las tijeras en la incisión entre la piel y el peritoneo y hacer una incisión lateral desde la ingle a la barbilla.
      5. Suavemente jale hacia atrás la piel para exponer la cavidad peritoneal intacta y la pared torácica, hacer una incisión lateral a través del peritoneo y suprimir la membrana.
      6. Levantar el esternón y con cuidado haga una incisión en el diafragma, asegúrese de no molestar a la vena cava inferior (IVC). Mover los órganos gastrointestinales para el lado y ubicar la vena cava inferior subhepático. Use pinzas hemostáticas para las suprahepáticas IVC mantener perfusión localizada de la abrazadera.
         Nota: La acumulación excesiva de tejido adiposo blanco visceral a menudo puede enmascarar la vena cava inferior. Para visualizar mejor esta nave, una pequeña zona de tejido adiposo junto a la vena cava inferior puede ser suprimida. La ventana Incisa en el tejido adiposo flexible se puede colocar luego sobre la vena cava inferior para exponer la nave para la canulación.
      7. Conectar la jeringa llenada de PB precalentado al conjunto colección e infusión de sangre 23 G. Empuje suavemente el émbolo hasta que el tubo y la aguja están llenos de PB.
      8. Inserte la aguja de 23 G, paralela al nivel de la vena cava inferior subhepático. Fije la aguja en su lugar utilizando una pinza hemostática de 4 cm.
         Nota: La canulación de la Subhepática que IVC es preferido en los ratones alimentados con dieta en que la vena cava inferior puede ser mejor visualizada y canulado dentro de la cavidad llena de grasa.
      9. Empuje suavemente el émbolo para iniciar la perfusión, color se lave rápidamente del hígado (lóbulo de derecho primero) si la aguja está colocada adecuadamente en el vaso. La ampliación de los lóbulos también es visible si la aguja está insertada correctamente en el IVC subhepático.
      10. Rápidamente cortar la vena porta para permitir que el PB fluya libremente a través del hígado.
      11. Perfusión del hígado hasta que la sangre no es visible. Masajes en ocasiones suavemente los lóbulos hepáticos entre fore-dedo y el pulgar para facilitar la perfusión.
          Nota: Es importante usar herramientas de filo embotados no serrado para manejar el hígado para evitar daños en los tejidos.
      12. Cuando dentro de la jeringa de 5 mL de PB, cambiar a la jeringa llenada con tampón de disociación precalentado. No perturbe la posición de la aguja asegurada durante este tiempo.
          Nota: Ampliada significativamente superior a 1,5 g debe ser inundada con un mayor volumen de buffer de digestión precalentado para garantizar éxito disociación hígada hígados.
      13. Perfusión del hígado hasta completamente digerido. Masajee suavemente los lóbulos de hígado para facilitar la perfusión.
          Nota: Separación de la cápsula de Glisson del parénquima es observable en un hígado con éxito digerido. Para evaluar esto, utilice el borde romo de un par de pinzas, presionar suavemente en el lóbulo lateral izquierdo. La impresión debe aparecer en la superficie y la muesca debe llenar lentamente una vez retirado el fórceps.
      14. Retire la aguja de la vena cava inferior subhepático. No retire las pinzas hemostáticas suprahepáticas vena cava inferior de sujeción.
      15. Suprimir el hígado entero cortando con cuidado a través de la conexión de ligamentos usando una cuchilla recta corta tijeras de disección y para extirpar la vesícula biliar.
      16. Colocar el hígado entero en un plato de petri de 10 cm conteniendo 10 mL Buffer de conservación helada y almacenar a 4 ^оC hasta listo para liberar a las células.
   4. Disociación de la célula del hígado
      1. El hígado la transferencia a un plato de 10 cm conteniendo 10 mL DMEM helada.
      2. Agarre la suprahepática cercenada que IVC al hígado suprimido usando un fórceps dentado. Utilice pinzas de punto medio para liberar las células de la cápsula de Glisson mediante la aplicación de rápido movimiento frotando ligeramente a cada lóbulo.
      3. Pasar el DMEM saturado a través de un tamiz de célula μm 70 conectada a un tubo de colección de 50 mL.
      4. Pipeta 10 mL de helado DMEM al plato de petri de 10 cm y repita los pasos 1.2.4.1 a 1.2.4.3 hasta que ya no se observa la saturación de los medios de comunicación. Lugar la suspensión de células en hielo o a 4 ° C.
      5. Mezclar suavemente la suspensión de células por inversión del tubo de colección y luego centrifugar a 54 x g durante 2 min a 4 ° C.
      6. Recoger el sobrenadante en un tubo de recogida limpia de 50 mL. Luego Centrifugue la suspensión de células a 54 x g durante 2 min a 4 ° C.
      7. Repita el paso 1.2.4.6 dos veces más antes de proceder al paso 1.2.4.8.
      8. Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio 50 mL-colección y Centrifugue la suspensión de células a 300 x g durante 10 min a 4 ° C.
      9. Resuspenda el precipitado de células no parenquimatosas en tampón FACS y contarlas en una cámara de Bürker/hemocitómetro.
      10. Transferencia de 1 x 10⁶ células (por citometría de flujo básico) o 15 x 10⁶ - 20 x 10⁶ células (FACS) para etiquetado tubos de poliestireno de fondo redondo 5 mL. Seguir sección 2 para protocolo de tinción de citometría de flujo.
3. Disociación y aislamiento de la aorta
   Nota: Este protocolo fue adaptado de carniceroet al.²⁶
   1. Preparar los buffers de tejidos específicos basados en las recetas que se proporciona en la tabla 1 y guardarlos como se describe.
   2. Se preparan los siguientes reactivos.
      1. Preparar el buffer de digestión por descongelar el volumen adecuado de WAT disociación tampón y conservar a 4 ° C hasta su uso. Inmediatamente antes del uso, caliente la solución a 37 ° C.
      2. Preparar una solución de heparina 10 x disolviendo heparina sal sódica en PBS 1 x a una concentración de 200 U/mL. Diluir 10 x solución con 1 x PBS para preparar una solución 1 x heparina heparina. Almacenar el x 10 y 1 x soluciones de heparina a 4 ° C hasta su uso.
      3. Preparar el tampón FACS con PBS 1 x con un 2% FBS.
   3. Disección de aorta
      1. Eutanasia a un ratón en una cámara llenada de dióxido de carbono y enjuagar con etanol al 70%.
      2. Coloque el lado ventral del ratón arriba en la etapa de disección, extender el ratón adelante y las patas traseras y sujételos a la Junta de disección utilizando una aguja de 21 G.
      3. Inmediatamente después de euthanizing el ratón, realizar punción cardiaca. Consulte los pasos 1.3.3.4 a 1.3.3.9, si es necesario.
      4. Localizar el proceso xifoides en el extremo inferior del esternón
      5. Para ello, coloque un punto medio del dedo a lo largo de la anchura del cuello del animal. Rastro a lo largo de la línea media ventral del cuello en el extremo caudal del esternón hasta que sienta una extensión cartilaginosa.
      6. Usar pinzas de punto medio para captar la extensión cartilaginosa y si es necesario marcar el lugar del proceso del xiphoid retirando el parche de pelo o la piel en la zona.
      7. Parcialmente, introduzca una aguja de 26 G debajo del proceso xifoides en ángulo de 20-30°.
      8. Suavemente aplicar presión negativa en la jeringa, retirando lentamente el émbolo, luego insertar la aguja más en la cavidad hasta que la sangre fluye.
      9. Si el flujo sanguíneo se detiene, lentamente gire la aguja o mover ligeramente en y hacia fuera.
      10. Uso el par de pinzas para asir el asimiento de la piel abdominal anterior uretral abrir y usar un par de tijeras de disección agudas para cortar a lo largo de la línea media ventral a través del peritoneo de la ingle a la barbilla.
      11. Tire hacia atrás la piel para exponer órganos abdominales y las costillas con los dedos o pinzas embotadas suavemente mover órganos abdominales hacia el lado.
      12. Uso las pinzas para asir el asimiento del proceso del xiphoid, levantar el esternón y practique una incisión en el diafragma.
      13. Usando las tijeras de disección, corte en las nervaduras laterales en ambos lados. Agarre el esternón, tapa de la caja torácica hacia arriba y cortar a través de la conexión base. Retirar las costillas, exponiendo los órganos torácicos subyacentes.
      14. Inundar la aorta con una aguja de calibre 26 a una 10 mL-jeringa llena con solución de heparina 1 x inyectando 1-2 mL de solución en el ventrículo izquierdo (LV) del corazón.
          Nota: Asegúrese de perfusión a un ritmo lento con poca presión para lesiones aórticas ateroscleróticas intactas.
      15. Impuestos especiales, el timo, los pulmones y tejido conectivo. Consulte los pasos 1.3.3.16 y 1.3.3.17, si es necesario.
          1. Anterior el corazón Localice el blanco bi-lóbulos (o en forma de mariposa) órgano y firmemente sostenga de gancho agarrador del timo con el fórceps. Tire hacia arriba de ambos lóbulos de la cavidad y corte en la base con las tijeras.
          2. Para extraer los pulmones, pellizcar un lóbulo pulmonar con el fórceps, tire del tejido de la cavidad torácica y corte en la base. Repita para cada lóbulo restante.
      16. Usar un microscopio de disección disección micro herramientas y recoger que la aorta arco (incluyendo la arteria innominada, arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda), ascendente, descendente, aorta torácica y abdominal.
          1. Localizar la aorta ascendente en el ventrículo izquierdo del corazón.
          2. Con un par de curvas 0.07 x 0,04 m-punta Pinzas suavemente Sujete la porción de la aorta ascendente emerge del ventrículo izquierdo.
             Nota: En comparación con el tejido adiposo circundante teñida de amarillo, la aorta será un vaso blanco brillante procedentes de LV cuando suficientemente enjuagarse con la solución de heparina.
             1. Si la aorta no fue limpiada correctamente por la perfusión cardiaca, purgue la aorta otra vez cuando la aorta está conectada a la cavidad. Para ello, corte cerca de la ensambladura de corazón aorta, quitar el corazón y cortan horizontalmente a través del extremo inferior de la aorta abdominal. Introduzca una aguja de 26 G en el orificio de la aorta ascendente y lave suavemente la aorta con el 1 x solución de heparina.
             2. Jale suavemente la aorta ascendente a discriminar mejor entre el tejido graso y la aorta incrustado.
             3. Todavía suavemente tirando de la aorta ascendente, utilice la punta del resorte cerrado tijeras de disección para eliminar la grasa que encapsula la aorta ascendente y arco aórtico. Para ello, el tejido adiposo con la punta de las hojas de la tijera cerrada rasgar lejos la grasa conexión del movimiento.
                Nota: Abstenerse de suprimir cualquier tejido graso mediante la reducción de hasta la aorta ascendente y arco pueden visualizarse claramente. Esto es para evitar cortar la aorta.
             4. Si la aorta ascendente y arco pueden delinearse claramente desde el tejido adiposo envolvente, utilice el resorte de tijera de disección para suprimir el exceso de grasa.
             5. Agarra suavemente asimiento del arco aórtico con el fórceps. Otra vez usando la punta de la tijera de resorte, movimiento en la grasa a lo largo de la longitud de la aorta descendente, torácica y abdominal en el extremo caudal de la aorta abdominal, hacerlo en el lado derecho de la manga de la grasa.
             6. Seguir captar a lo largo de la aorta al rasgar lejos la grasa. Asegúrese de hacer tan suavemente para evitar dañar la aorta.
             7. Tire suavemente de la aorta ascendente hacia el microscopio para que la grasa se coloca ahora detrás de la aorta.
             8. Introduzca las hojas de la tijera cerrada entre la interfaz de grasa-aorta cerca del extremo anterior de la aorta descendente, grave accesorio del tejido graso a la superficie de la aorta sin rodeos, usando un movimiento de barrido.
                Nota: Fondo quitando exceso de grasa y tejido de conexión mientras que la aorta está todavía dentro de la cavidad se recomiendan.
             9. Suprimir el corazón y cortar transversalmente en el extremo caudal de la aorta abdominal. Retire la aorta entera.
             10. La aorta en un plato de 35 mm y fastidiar a cualquier exceso de grasa en la aorta usando dos agujas de calibre 21. Coloque la aorta suprimida en tubo de microcentrífuga de 1,7 mL de hielo.
   4. Disociación de la Aorta en suspensiones celulares solo
      1. Buffer de disociación de aorta pipeta 0.2 mL al tubo que contiene la aorta. Introduzca las hojas de la tijera de primavera hacia el extremo afilado del tubo y rápidamente pique la aorta para facilitar la digestión enzimática.
      2. Transferir la mezcla de tejido-solución a un 15 mL colección tubo y pipeta 1,8 mL aorta disociación de tampón para un volumen total de 2 mL.
         Nota: Para facilitar la transferencia de la suspensión de tejido, corte 1 cm el extremo afilado de una punta de pipeta de 1000 μl estándar. Use la extremidad acortada para transferir la suspensión con una micropipeta.
      3. Incubar la aorta picada en el búfer de disociación de la aorta durante 55 minutos a 37 ° C, agitación a 220 rpm (0.514 x g).
      4. Pasar la suspensión a través de tamiz de célula de 50 μm en un tubo de polipropileno colección de 15 mL. Usar el pistón de goma del émbolo de la jeringa para facilitar el filtrado.
      5. Enjuagar el tubo de la colección de 15 mL con buffer 1 mL FACS, recoger la suspensión y pasan por el tamiz de la célula.
      6. Lave el filtro de célula μm 50 dos veces más con 1 mL de tampón de FACS.
      7. Sedimenten las células por centrifugación a 300 x g durante 5 min a 4 ° C. Resuspenda las células en frío tampón FACS. Contar las células en una cámara de Bürker/hemocitómetro.
      8. Transferencia de células 1 x 10⁶ (por citometría de flujo básico) o la suspensión de toda la célula (por FACS) a un tubos de poliestireno etiquetados 5 mL fondo redondo. Seguir sección 2 para protocolo de tinción de citometría de flujo.

2. flujo Cytometry y la coloración de la FACS

Fluoróforo	R-ficoeritrina (PE)	PE/Cianina (Cy) 7	PE/Cianina (Cy) 5	Azul Pacífico (PB)
Láser (nm)	Azul (488 nm) / amarillo (561-570 nm) - verde (532 nm)	Azul (488 nm) / amarillo (561-570 nm) - verde (532 nm)	Azul (488 nm) / amarillo (561-570 nm) - verde (532 nm)	Violeta (405 nm)
Excitaciónmáxima (nm)	496	496	496	401
Emisiónmáxima (nm)	578	785	667	455
Marcador fenotípico	F4/80	CD11c	CD11b	CD45
	EMR1, Ly71	ΑX integrina, integrina αX cadena, CR4, p150, ITGAX	ΑM integrina, Mac-1 Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM	T200, Ly-5, ACV
Tipo de célula específica	Macrófagos residentes	Macrófagos activados clásico (M1)	Monocitos / macrófagos	Leucocitos (macrófagos / monocitos, linfocitos y granulocitos)
	Subconjunto de células dendríticas	Las células dendríticas, células NK, células T activadas y un subconjunto de linfocitos intestinales intraepiteliales (IEL)	Granulocitos, células dendríticas, células NK y subconjuntos de células T y B
Factor de dilución	1:50	1: 100	1: 100	1: 100
Controles de isotipo	PE rata IgG2a	PE/Cy7 hámster armenio IgG	PE/Cy5 Rat IgG2b	IgG2c rata azul Pacífico

Tabla 2: Lista de fluoróforo etiquetado anticuerpos específicos para discriminar los macrófagos residentes.

1. Reunir y preparar los siguientes elementos: tubos de poliestireno de FACS Buffer 5 mL fondo redondo, receptor CD16/32 Fc de anti-ratón bloqueo de anticuerpos, fluoróforo conjugada o no conjugada a anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios conjugados fluoróforo (if es necesario), 1 x solución salina tamponada con fosfato (PBS).
   Nota: Para la tinción de grandes cantidades de células, concentración de anticuerpos es más crítico en lugar de número de celular. Por ejemplo, si el volumen de tampón de tinción de las células de la tinción 10 x 10⁶ y concentración de anticuerpos debe ser el mismo como si coloración 1.0 x 10⁶ células en volumen de 100 μl tampón. Para la tinción de 1.0 x 10⁸ células, aumentando la cantidad de anticuerpo 5 veces es recomendable.
2. Añadir tampón de FACS helado adicional a cada tubo de FACS si es necesario, de la pelotilla de las células por centrifugación a 751 x g durante 5 min (4 ° C). Aspirar el sobrenadante centrifugado siguiente.
3. Añadir receptor CD16/CD32 Fc de anti-ratón bloqueo de anticuerpos a todas las muestras según las instrucciones del fabricante. Incubar por 15 min a 4 ° C o en hielo.
4. Añadir el anticuerpo primario conjugados fluoróforo cóctel directamente al receptor de Fc que contiene anticuerpos bloqueo suspensión de células e incubar las muestras a 4 ° C durante 30 minutos proteger muestras de la luz para minimizar la decoloración de anticuerpos conjugados fluoróforo.
   1. En el evento se utilizaron anticuerpos primarios no conjugados, siga estos pasos después de completar el paso 2.4.
   2. Anticuerpo primario lavado teñido de muestras por centrifugación a 751 x g durante 5 minutos (4 ° C).
   3. Eliminar el sobrenadante por decantación y vuelva a suspender el sedimento en 100 μl de tampón FACS.
   4. Añadir el anticuerpo secundario conjugado a todas las muestras necesarias e incubar 30 min a 4 ° C. Proceda al paso 2.5.
5. Siguiente incubación del anticuerpo, añadir 2 mL de tampón de FACS frío hielo luego pelotilla células 751 x g durante 5 minutos (4 ° C). Decantar el sobrenadante y asegúrese de no perturbar el pellet.
6. Mezclar suavemente las células y luego vuelva a suspender con 200-400 μL de tampón FACS, luego mantener esto en la oscuridad a 4 ° C hasta el análisis de citometría de flujo estándar o clasificación celular.
7. Para la fijación de células a corto plazo, proceder a pasos 2.8 a 2.10. Fijación de uso para la citometría de flujo estándar solamente.
8. Inmediatamente después de paso 2.5, Resuspenda las células en paraformaldehido de 2-4% de 0,5 mL (PFA) durante 15-30 min a 4 ° C.
   Nota: PRECAUCIÓN: PFA es un conocido irritante con efectos cancerígenos y tóxicos. Cuando se utiliza PFA, manejar con mucho cuidado. Asegúrese de utilizar el equipo de protección personal y ventilación de escape.
9. Fijación siguiente, lave las células mediante la adición de tampón FACS de 2 mL para todas las muestras y centrifugue a 751 x g en 4 ° C por 5 minutos eliminar sobrenadante centrifugado siguiente.
10. Resuspender células fijas en 200 μL de tampón de FACS frío hielo y almacenar a 4 ° C. Arreglo de tienda las células hasta 1 semana a 4 º C, idealmente realizar adquisición de citometría de flujo dentro de 48 horas para minimizar la autofluorescencia.
11. Adquirir datos de citometría de flujo según las instrucciones del fabricante de citómetro de flujo o realizar fluorescente celular activado clasificación según lo descrito por Basu et al. ²³

Resultados

Cuando se utiliza la apolipoproteína E deficiente (KO ApoE) C57BL/6 (BL6) ratones mantenidas en una dieta de alta grasa colesterol alto (HCHFD o HCD) para 18 semanas, 1 x 10⁴ - 2 x 10⁴ CD45⁺⁺ de F4/80 macrófagos aórticos pueden ser aislados cuando las dos muestras son agrupados. Hígado disecado de los ratones alimentados con HFHCD KO ApoE, produjo mayor que 5 x 10⁵ clasificado las células de Kupffer (que depende del tiempo dispon...

Discusión

Modelos de trastorno metabólico inducido por la dieta que imitan comorbilidades tales como ateroesclerosis, esteatosis simple, esteatohepatitis y diabetes tipo 2 se utilizan extensivamente para entender mejor los mecanismos moleculares subyacentes de progresión de la enfermedad. Digestión depende de la colagenasa a menudo se utiliza para disociar los tejidos para liberar las células de la matriz extracelular (ECM)^16,27. Enzimas como la colagenasa interrumpen ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G x 5/8 in Needles	BD	305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set	BD	367297	Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles	BD	305156
1 mL syringe with rubber stops	BD	309659
10 mL Syringes	BD	309604
1 mL Syringe	BD	309659
F4/80 PE	Biolegend	123110
CD11c PE/Cy7	Biolegend	117318
CD11b PE/Cy5	eBioscience	15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block	Biolegend	101320
CD45 Pacific Blue	Biolegend	103126
PE Rat IgG2a	Biolegend	400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG	Biolegend	400922
PE/Cy5 Rat IgG2b	Biolegend	400610
Pacific Blue Rat IgG2c	Biolegend	400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Cellgro	21-031-CV
70 μm cell strainers	Corning, Inc.	352350
1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x	Electron Microscopy Sciences	CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp	Stoelting	52132-10P	Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm	Stoelting	52102-37P	Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge	Fine Science Tool	15000-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps	Fine Science Tool	11297-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved)	Fine Science Tool	13021-12
Heparin Sodium Salt	Fischer Scientific	9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes	Fischer Scientific	12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid	Fischer Scientific	08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes	Fischer Scientific	14-959-5
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)	Millipore	EX0285-1
Bovine Serum Albumin	Rockland	BSA-50
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Collagenasse Type XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase Type I	Sigma-Aldrich	H3506
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich	C0130
NaOH	Sigma Aldrich	1310-73-2
CaCl2	Sigma Aldrich	449709-10G
500 mL beaker	Sigma Aldrich	02-540M
4 cm Hemostatic clamp	Stoelting	52120-40
Toothed forceps	Stoelting	52104-33P
50 μm Disposable filters	Systemex	04-0042-2317
Collagenase Type IV	ThermoFischer Scientific	17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK)	ThermoFischer Scientific	A1049201
Razors (0.22 mm (0.009"))	VWR International	55411-050
Texas Red Live/Dead stain			Red viability stain (in Figure 1A)