Yalıtım, karakterizasyonu ve obezite ile ilgili iltihap tarafından etkilenen dokular makrofajlar arıtma

Özet

Bu iletişim kuralı ayırmak ve karakterize bir araştırmacı doku yerleşik sağlar makrofajlar içinde çeşitli metabolik bozuklukların diyet kaynaklı modellerinden çıkarılan iltihaplı dokulara hallmark.

Özet

Obezite büyük ölçüde doku yerleşik makrofajlar gibi monosit kaynaklı makrofajlar tarafından aracılık ettiği kronik bir enflamatuar devlet teşvik etmektedir. Diyet kaynaklı obezite (DIO) makrofaj heterojenite rolü eğitim değerli bir modeldir; Ancak, yeterli makrofaj izolasyonların iltihaplı dokulara elde etmek zordur. Bu protokol için biz yalıtım adımları ve doku yerleşik makrofajlar uygun nüfusu yüksek yağlı (HFD) veya yüksek yağ/yüksek kolesterol (18 hafta takip fareler elde etmek için çalışmalarımız elde gerekli hata giderme kılavuzu anahat HFHCD) diyet müdahale. Bu iletişim kuralı obezite ve karaciğer, beyaz yağ dokuları (WAT) ve aort damarı da dahil olmak üzere ateroskleroz okudu üç hallmark dokular üzerinde duruluyor. Biz nasıl ikici kullanımı vurgulayın Akış Sitometresi yalıtım yeni bir boyut ve doku yerleşik makrofajlar karakterizasyonu elde edebilirsiniz. Bu iletişim kuralının temel bir bölümünü doku özgü Enzimatik sindirim ve makrofaj yalıtım ve akış sitometrik çözümlemesi için boyama sonraki hücre yüzeyine antikor temel inceliklerini giderir. Bu iletişim kuralı mevcut karmaşıklığı floresan aktif hücre (FACS) sıralama temel giderir ve geniş karakterizasyon yeterli sıralanmış hücre gruplarından elde etmek için bu karmaşıklığı için açıklamalar sunar. Alternatif zenginleştirme yöntemleri gibi FACS ile çalışırken esneklik ve zaman yönetimi için izin yoğun karaciğer hücreleri sıralamak için dahil edilir. Kısacası, bu iletişim kuralı çok sayıda belirli bir çalışma içinde iltihaplı doku makrofaj heterojenite değerlendirmek için araştırmacı yardımcıları ve olumlu hücresel yalıtım ve karakterizasyonu için başarılı olmuştur anlayışlı sorun giderme ipuçları sağlar iltihap DIO-aracılı bağışıklık hücrelerinin.

Giriş

Fare modelleri yoğun insan hastalıkları dinamiklerini incelemek için kullanılmaktadır. Fareler hastalıklı bir durumda doku yerleşik hücre uygun yalıtım Patogenez moleküler ve hücresel katkılar hastalığı¹anlamak için bir platform sağlar. Kritik önemi olan bir obezite bozukluğudur. Obezite sıklığı 2 diyabet, kalp-damar hastalıkları ve yağlı karaciğer hastalığı^2,3yazın ve insülin direnci ile paralel olarak dünya çapında yükselmeye devam ediyor. Aşırı besin tüketimi daha da azalmış fiziksel aktivite olan aort ve karaciğer⁴gibi diğer periferik dokuların hücresel ortamı değiştirmek Yağ dokusundan kaynaklanan değişmiş sinyalleri tetikleyen tarafından çarpık. Bu tür bozulma metabolik homeostazı sonuçları bir kronik düşük dereceli sistemik inflamasyon⁵.

Klasik makrofajlar aorta ve karaciğer gibi beyaz Yağ dokusundan (WAT) onların işe alım için ikamet aktivasyonu sadece bozukluk metabolik sinyallerin başlatmak ama aynı zamanda iltihabı^6,7sürdürmek için gösterilmiştir. Makrofajlar fenotipik ve fonksiyonel heterojen şiddetle obezite patogenezi ile ilişkilidir ilgili komorbiditeler⁷. Makrofaj polarizasyon dinamik plastisite bu hücreler bir dizi ilerleme koordine aktif fenotipleri ve inflamasyon⁸çözünürlüğe sergilemek sağlar. Klasik aktif (M1) makrofajlar iltihap yayılmasında karıştığı iken, alternatif olarak aktif (M2) makrofajlar çözünürlük ve doku onarımı^9,10ile ilişkilendirilmiştir.

Vücudun metabolik stres uğrar gibi beyaz yağ dokusu anormal derecede birikir. Genişletilmiş yağ dokusu çeker ve derinden insülin direnci, hiperglisemi ve sonuçta tip 2 diabetes mellitus, insülin direnci veya hiperglisemi^{11tanıtmak için normal adipocyte işlevini değiştirme inflamatuar hücreleri korur, 12}. Buna paralel olarak, beyaz yağ dokusu değişikler yanıt inflamatuar sinyalleri tarafından yayımlanan olarak klasik aktif (M1) yağ doku makrofajlar (TYS)^13,14sızmış. Çok hücreli bu organ aort ve karaciğer⁴gibi diğer vücut organlarının normal fonksiyon raydan çıktı bir çağlayan sinyal yayıyor.

Karaciğer yakındaki dysregulated WAT¹⁵kaynaklanan uyaranlara yanıt olarak uyum sağlar metabolik bir elektrik santrali var. Hepatik makrofajlar veya Kupffer hücreleri, metabolik değişiklikler, hem parenkima dönüşümü inflamatuar sitokinlerin ve parenkimal olmayan hücre fenotip salgılar ve doku remodeling teşvik. Karaciğer lipid birikimi, iltihap, aşırı hücre dışı matriks mevduat, nekroz ve karaciğer hasarı geniş yelpazede katkıda inflamatuar hakaret non alkolik yağlı karaciğer hastalığı ile ^{ilgili nihai işlev kaybı aşağıdaki gibidir 16,17,18}.

Vücudun kronik metabolik stres¹⁹uğrar gibi güvenliği aşılan WAT ve karaciğer fonksiyon için paralel olarak büyük arterlerin lipidler Arteryel duvardaki içinde birikir. Arteryel lipid birikimi kemokinler aktive endotel hücreleri tarafından salgılanmasını ve monosit²⁰sonraki işe alım tetikler. Bir kez işe, monosit çoğalırlar, ayırt etmek, lipoproteinler yutmayın ve köpük hücreleri haline. Atherogenesis başlatılan ve pro-inflamatuar etkinliği tarafından sürekli işe ve doku ikamet lipid yüklü makrofajlar. Bu aterojenik microenvironment geçirilen ekstraselüler ve hücre içi stres sinyallerini succumbing, bu makrofajlar sonra art arda sıralı sinyal bir apoptotik meşgul. Bu köpük hücreleri ölürken dolu lipid içeriklerini daha sonra plak rüptürü, miyokard enfarktüsü ve inme için neden lezyon nekrotik çekirdeğini katkıda bulunur.

Topluca, makrofaj fenotipleri heterojen kısmen enflamatuar degisimler WAT, karaciğer ve aort^8,21gibi dysregulated dokularda gözlenen tarafından indüklenen obezite orchestrates. Karakterizasyonu işe ve ikamet makrofajlar doku makrofaj fenotip¹işlemek potansiyel moleküler hedeflerin içgörü sağlayabilir. Etkili bir şekilde gelen obezite kaynaklı iltihaplı doku makrofajlar karakterize etmek için bir tek hücre süspansiyon Enzimatik sindirim elde edilebilir. Böyle ayrılma iletişim kurallarının yeterince bağ dokusu bağışıklık hücre ölümü en aza indirilmesi ve optimum hücre verim sağlayan aşağılayıcı içinde etkili olması gerekir. Enzim karışımı doku ve yapısal onun makyaj türüne bağlıdır. Aort damarı gibi esnek doku karaciğer ve WAT doku ayrılma elde etmek için kıyasla daha güçlü enzimatik aktivite gerektirir. Tek hücre süspansiyon, doku ikamet makrofajlar olabilir belirsizliğe yer bırakmadan ile karakterize veya transkripsiyon profil oluşturma gibi daha da aşağı akım analizleri için izole.

Burada bir doku özel iletişim kuralı etkin bir şekilde izole ve doku yerleşik makrofajlar indüklenen geleneksel beslenme obezite elde edilen karakterize için collagenase bağlı doku sindirim ve renkliden Akış Sitometresi kullanan anlatılan, ateroskleroz, basit yağlanma ve steatohepatitis fare modelleri. Eşzamanlı lökosit-(CD45 ve/veya CD11b) ve makrofaj - karşı antikor ile hücre yüzey işaretlerinin boyama (F4/80) belirli antijenleri kez makrofaj nüfus²²tanımlamak için kullanılır. Floresans aktif hücre (FACS) sıralama yüksek saflıkta, saptanan bu nüfus sıralamak için kullanılan güçlü bir stratejidir. Sıralanmış nüfus daha sonra aşağı akım moleküler analizi (gibi nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu)²³kullanarak fenotip belirli bir gen profilleri için değerlendirilebilir. Standart Akış Sitometresi ve Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama makrofajlar içinde büyük ölçüde türdeş olmayan hücre süspansiyon ayrım içinde güçlü araçlar olmakla birlikte, eski protokoller başarılı çıkış sağlamak için optimize edilmiş olması gerekir. Bu çalışmada, etkili bir şekilde izole etmek ve uygun doku belirli makrofajlar karakterize protokolleri açıklanmıştır; daha da önemlisi, bu çalışmada, önlemek ve/veya bunları çözmek için proaktif ve LNB'ler stratejileri yanı sıra sık sık ortaya çıkan teknik sorunları içine çok önemli bilgiler sağlar.

Protokol

Tüm deneysel protokoller (Bölüm 1, 1.2 ve 1.3) kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Pennsylvania State Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

Doku	Ayrılma arabellekleri hazırlık	Son hacim	Depolama
Beyaz Yağ dokusundan (WAT)	Ayrılma tampon: %2.5 HEPES, 10 mg/mL sığır serum albumin (BSA), 3 mg/mL (% 0.3) Collagenase tip II içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) L-glutamin ve sodyum pyruvate olmadan 4,5 g/M glikoz ile	500 mL	eksi 80° C (10 mL aliquots)
Karaciğer	25 x perfüzyon arabellek konsantresi (PBC): 3,55 M NaCl, 168 mM KCl, 240 mM HEPES, 150 mM NaOH buna deiyonize H2O distile	500 mL	eksi 20° C (40 mL aliquots)
	Koruma arabellek (PRB): % 1 BSA perfüzyon arabellek x 1	1 L	4 ° C
	Ayrılma arabellek: 1 x perfüzyon arabellek 4,76 mM CaCl2 ve 72 U/mL Collagenase tip IV ile desteklenmiş	(fare) başına 50 mL	Hazırlamak hemen önce kullanım
Aort	Ayrılma arabellek: 125 U/mL Collagenase XI 60 U/mL Hyaluronidase yazın, ben 60 U/mL Dnaz ben, 450 U/mL Collagenase tip ı, 20 mM HEPES fosfat Buffered Saline (PBS) x 1	500 mL	eksi 80° C (10 mL aliquots)

Tablo 1: Doku belirli perfüzyon arabellek tarifleri.

1. doku yalıtım ve ayrılma

1. WAT yalıtım ve ayrılma
   1. Tablo 1aynı derecede doku özel arabellekleri hazırlamak ve açıklandığı gibi depolayabilirsiniz.
   2. Aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. Sindirim arabellek kadar kullanmak uygun hacmi WAT ayrılma arabellek ve mağaza 4 ° C'de çözdürme tarafından hazırlayın. Kullanımdan hemen önce tampon ile 37 ° c sıcak 1 x %2 fetal sığır serum (FBS) içeren fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hazırlayarak FACS arabellek hazırlayın.
   3. WAT yalıtım
      1. Bir dolu fare bir karbondioksit (CO₂) odası ötenazi. Diseksiyon Sahne Alanı'na devam etmeden önce etkinliğini denetleyin.
      2. İyice ıslanmış ve etanol ile kaplı kadar % 70 etanol içeren bir ölçek kısaca euthanized fare daldırma. Fare menfez yüzey diseksiyon Sahne Alanı'nda yeri ve fare ön ve arka paws için diseksiyon kurulu 21 G iğneler kullanarak bağlayın.
      3. Orta noktası uç forseps üretral açılış anterior karın deri kavramak için kullanın, sonra keskin diseksiyon makası kavranabilir karın deride bir nick yapmak için kullanın.
      4. Cilt ve Periton arasında küçük kesi makası alt bıçak yerleştirin ve göğüs kafesi için yanal bir kesi karın üzerinden yapmak.
      5. Yavaşça geri bozulmamış Periton boşluğu ortaya çıkarmak ve geri şeffaf membran katlamayın veya karın WAT ortaya çıkarmak için doku tüketim bir yan kesi aracılığıyla Periton ve ya yapmak için cilt çekin.
      6. Perigonadal yağ yastıkları Mann ve ark. içinde açıklandığı gibi toplamak ²⁴
         1. Erkek farelerde perigonadal yağ yastıkları gevşek testis ve epididim bağlıdır. İlk testis bulun ve sonra Forseps ile orta noktası, epididim kafa tutun kavramak ve yavaşça çekin.
         2. Keskin diseksiyon makası kullanarak, testis ve epididim (baş, gövde ve kuyruk) yüzey boyunca keserek her epididimal yağ yastığı tüketim.
         3. Bağ dokusu ile kesme doğrudan epididim yapısına bağlı iken Forseps ile yağ yastığı üzerinde yavaşça çekin.
         4. Forseps kullanarak, yağ yastığı için epididimlerden proksimal sonu sıkıca kavrama ve hafifçe yağ yastığı gonads uzak kabuğu
         5. Dişi farelerde perigonadal yağ yastıkları gevşek bağ rahim boynuz ve rahim beden var.
         6. Orta noktası forseps kullanarak, perigonadal yağ dokusu kavrama ve doku rahim vücut ve rahim boynuz yavaşça çekin.
         7. Rahim vücut ve rahim boynuz keskin diseksiyon makası kullanarak boyunca keserek her yağ yastığı tüketim.
      7. Bir petri yastıkları PBS ile dolu ve doku nemli tutmak için buza tutmak yağ koyun.
   4. WAT ayrılma tek hücre süspansiyonlar içine
      1. Aşırı PBS petri kabına kaldırmak ve karın WAT küçük parçalar halinde kıyma için tek uçlu jilet kullanın.
      2. Tıraş bıçağı keskin kenar ile hafifçe 2 mL WAT ayrılma arabellek içeren etiketli 15 mL polipropilen toplama tüp içine kıyılmış karın WAT kazı.
      3. Bu doku-sindirim arabellek karışımı yavaş sürekli rotasyon için 45 dk 37 ° C'de altında kuluçkaya.
      4. Sindirilir doku 70 µm hücre süzgeç aracılığıyla bir 50 mL koleksiyonu tüpüne enjektör pompası lastik piston dairesel hareketlerle hareket ederken filtre ve hücre süspansiyon filtreden elek devam ediyor.
      5. Dulbecco 2 mL damlalıklı modifiye kartal orta (DMEM) bir 15 mL toplama tüp, yavaşça damlalıklı yukarı ve aşağı 's ve filtrenin tek hücre süspansiyon ile yıkayın.
      6. Filtre ile soğuk DMEM iki ek kez yıkama ve tek hücre süspansiyon Buza koyun.
      7. Hücre süspansiyon 300 x g 8 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
      8. Dikkatle kayan adiposit (ilk) kaldırmak için bir vakum aspiratör kullanın ve süpernatant kalan. Pelleted stromal vasküler kesir (SVF) rahatsız değil emin olun.
      9. 1000 µL pipet ile hafifçe Pelet eritrositler üreticinin yönergelerine uygun koşullar için amonyum klorür-potasyum (ACK) arabelleği yeniden askıya alma.
      10. DMEM ile yukarıdaki hücre süspansiyon sulandırmak ve hücre süspansiyon 300 g 8 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi.
      11. Soğuk PBS % 2 içeren hücrelerde yeniden askıya FBS (FACS arabellek) ve bir Burker odası/hemasitometre hücreleri saymak.
      12. 1 x 10⁶ hücreler (için temel Akış Sitometresi) veya tüm hücre süspansiyon (FACS için) etiketli 5 mL yuvarlak alt polistren tüpler aktarın. Akış Sitometresi Protokolü boyama için Bölüm 2'ye geçin.
2. Karaciğer dokusu yalıtım ve ayrılma
   Not: Bu protokol Smedsrød²⁵uyarlanmıştır.
   1. Tablo 1 aynı derecede doku özel arabellekleri hazırlamak ve açıklandığı gibi depolayabilirsiniz.
   2. Aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. 1 x sadece perfüzyon başlamadan önce perfüzyon arabellek (PB), sulandrarak 40 mL PBC 960 mL ultrasaf H₂O. öncesi sıcak bir şırınga içine tarafından PB 50 mL 37 ° C'de dolu hazırlayın. Herhangi bir mevcut hava kabarcıkları ortadan kaldırmak.
         1. Hava kabarcıkları ortadan kaldırmak için nerede leur kilit ipucu yukarı işaret ediyor şırınga tersine çevirin. Dokunun veya hava kabarcıkları şırınga üst pf olana şırınga hafifçe vur. Hava çıkarmak için yavaşça push pistonu
      2. 476 mm CaCl₂ çözüm 0.5 mL sulandrarak sindirim arabellek hazırlamakperfüzyon arabellek x 49,5 ml 1. 3600U Collagenase türü IV 4,76 mM CaCl₂ -PB çözüm ekleyin. Sadece perfüzyon başlamadan önce sindirim arabelleği 37 ° C'de 50 mL dolu bir şırınga önceden ısıtmak. Herhangi bir mevcut hava kabarcıkları ortadan kaldırmak 1.2.2.1.1 adımda anlatıldığı gibi.
      3. Koruma arabellek (PRB) 2.5 g sığır serum albumin (BSA) çözülerek 250 mL 1 x perfüzyon arabellekte hazırlayın. 4 ° C'de depolayın veya buz üzerinde kullanımda kadar devam.
      4. 1 x PBS ve % 2 FBS önbellekle FACS hazırlayın.
   3. Karaciğer dokusu yalıtım
      1. Bir fare CO₂ boğulma tarafından ötenazi, fare kürk ile intraabdominal organlar önlemek amacıyla % 70 etanol ile emdirmek.
      2. Fare ventral tarafta yukarı bir polistiren köpük kurulu anatomi ve fare ön ve arka güvenli pozisyon diseksiyon kurulu 21 G iğneler kullanarak paws.
      3. Göğüs duvarı ve Periton boşluğuna duyurmak, bir orta nokta uç forseps kullanarak üretral açılış yakınındaki karın deri kavramak. O zaman keskin diseksiyon makası kavranabilir karın cilt için küçük bir insizyon attım oluşturmak için kullanın.
      4. Cilt ve Periton arasında küçük kesi makası alt bıçak yerleştirin ve kasığından çene için yanal bir kesi yapmak.
      5. Yavaşça geri bozulmamış Periton boşluğu ve göğüs duvarı açığa, karın zarını aracılığıyla yanal bir kesi yapmak ve membran tüketim için cilt çekin.
      6. Göğüs kemiği kaldırmak ve dikkatle diyafram deşmek, inferior vena kava (IVC) rahatsız değil emin olun. Gastrointestinal organ kenara çek ve subhepatic IVC bulun. Kan durdurucu sargı forseps IVC yerelleştirilmiş perfüzyon korumak için suprahepatic kelepçe için kullanın.
         Not: Visseral beyaz yağ dokuları aşırı birikimi kez IVC maske yapabilirsiniz. Bu gemi daha iyi görmek için yağ dokusu IVC yanındaki küçük bir alanı eksize. Bükülebilir yağ dokusu içinde kazıma pencere o zaman cannulation için gemi ortaya çıkarmak için IVC üzerinde konumlandırılmış olabilir.
      7. 23 G kan toplama ve infüzyon seti için Önceden ısıtılmış PB ile dolu şırınga iliştirin. Boru ve iğne PB ile doldurulur kadar pistonu üzerinde hafifçe itin.
      8. 23 G iğne, subhepatic IVC düzeyine paralel yerleştirin. İğne 4 cm Kan durdurucu sargı kelepçe kullanarak yerine sabitleyin.
         Not: IVC daha iyi olabilir bu diyet beslenen farelerde IVC tercih subhepatic Cannulation görüntülenir ve yağ dolu kavite içinde cannulated.
      9. Yavaşça perfüzyon başlamak için pistonu üzerinde itin, renk hızla karaciğer floş (LOB ilk düzgün) iğne uygun şekilde taşıyıcıyı içinde konumlandırılmış. Genişleme LOB da iğneyi düzgün subhepatic IVC eklediyseniz görünür.
      10. Derhal portal ven karaciğer serbestçe akmaya PB izin vermek için kesti.
      11. Kan görünene kadar karaciğer sıvı. Zaman zaman hafifçe masaj karaciğer lobları arasında ön-parmak ve başparmak perfüzyon kolaylaştırmak için.
          Not: Doku hasarı önlemek için karaciğer işlemek için tırtıklı sigara künt kenarlı araçları kullanmak önemlidir.
      12. PB 5 mL şırınga içinde kalır, Önceden ısıtılmış ayrılma arabellek ile dolu şırınga için değiştirmek. Güvenli iğne konumunu bu dönemde rahatsız etmeyin.
          Not: 1.5 g önemli ölçüde aşan başarılı karaciğer ayrılma güvence altına almak için Önceden ısıtılmış sindirim arabellek büyük bir hacim ile periosteum karaciğerleri genişlemiş.
      13. Tamamen sindirilmiş kadar karaciğer sıvı. Yavaşça perfüzyon kolaylaştırmak için karaciğer lobları masaj.
          Not: Glisson'ın kapsül parankimi üzerinden gözlemlenebilir başarıyla sindirilir karaciğerde ayrılmasıdır. Bu değerlendirmek için forseps, bir çift kör kenarını hafifçe bastırın üzerinde sol yan lob için kullanın. Bir izlenim yüzeyinde görünür ve bir kez forseps çıkarmak girintileme yavaş yavaş doldurmalıdır.
      14. İğne subhepatic IVC kaldırın. Suprahepatic IVC sıkma Kan durdurucu sargı forseps kaldırmaz.
      15. Bütün karaciğer dikkatle makas dissekan kısa düz bıçak kullanarak bağ bağlantı üzerinden kesim tarafından tüketim ve safra kesesi kaldırma.
      16. Bütün karaciğer bir 10 cm-kabında yer 10 mL içeren buz gibi koruma tamponu ve 4 ^оC kadar mağaza hücreleri kurtarmak için hazır.
   4. Karaciğer hücre ayrılma
      1. Karaciğer 10 mL içeren bir 10 cm çanak transfer buz gibi DMEM.
      2. Tutunma IVC dişli bir forseps kullanarak eksize karaciğere bağlı kesik suprahepatic. Orta noktası forseps Glisson'ın kapsül hücrelerden her LOB için hızlı okşayarak hareket uygulayarak serbest bırakmak için kullanın.
      3. Doymuş DMEM 50 mL toplama tüp bağlı 70 µm hücre süzgeç geçişi.
      4. Damlalıklı 10 mL buz gibi DMEM 10 cm petri kabına ve medya doygunluğu artık görülmektedir kadar 1.2.4.3 1.2.4.1 arasındaki adımları yineleyin. Yer buz üzerinde veya 4 ° C'de hücre süspansiyon
      5. Hücre süspansiyon toplama tüp ters çevirme karışımı yavaşça ve, 54 x g 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi
      6. Süpernatant temiz 50 mL toplama tüp içinde toplamak. Hücre süspansiyon, 54 x g 4 ° C'de 2 dk santrifüj kapasitesi
      7. 1.2.4.6 adım 1.2.4.8 geçmeden önce iki ek kez yineleyin.
      8. Süpernatant temiz 50 mL-toplama tüp aktarmak ve hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
      9. Parenkimal olmayan hücre Pelet FACS arabellekte yeniden askıya alma ve bunları bir Burker odası/hemasitometre kabul.
      10. 1 x 10⁶ hücreler (için temel Akış Sitometresi) veya 15 x 10⁶ - 20 x 10⁶ hücreler (için FACS) 5 mL yuvarlak alt polistren tüpler etiketli aktarın. Akış Sitometresi Protokolü boyama için Bölüm 2'ye geçin.
3. Aort yalıtım ve ayrılma
   Not: Bu protokol kasap uyarlanmıştıret al.²⁶
   1. Tablo 1 ' de sağlanan tarifleri temel doku özel arabellekleri hazırlamak ve açıklandığı gibi depolayabilirsiniz.
   2. Aşağıdaki reaktifler hazırlayın.
      1. Sindirim arabellek kadar kullanmak uygun hacmi WAT ayrılma arabellek ve mağaza 4 ° C'de çözdürme tarafından hazırlayın. Kullanımdan hemen önce tampon ile 37 ° c sıcak
      2. 10 x heparin çözüm heparin çözülerek sodyum tuzu 1 x PBS, 200 U/mL bir konsantrasyon içinde hazırlamak. 10 x 1 x 1 x Heparin çözüm hazırlamak için PBS heparin hisse senedi Çözümle sulandırmak. 10 x ve 1 x 4 ° C'de Heparin çözümleri kullanmak kadar saklamak.
      3. %2 içeren 1 x PBS FACS önbellekle hazırlamak FBS.
   3. Aort
      1. Bir fare bir karbon dioksit dolu odası ve durulama ile % 70 etanol ötenazi.
      2. Fare ventral yan diseksiyon sahnede yer, fare ön ve arka paws yaymak ve onları diseksiyon kurulu 21 G iğneler kullanarak bağlayın.
      3. Hemen-den sonra fareyi, ötenazi kardiyak ponksiyon gerçekleştirin. Adımları 1.3.3.4 1.3.3.9 için bakın.
      4. Göğüs kemiğinin alt ucundaki xiphoid işlemi bulun
      5. Bunu yapmak için bir parmak orta nokta hayvanın boyun genişliği boyunca yerleştirin. Kıkırdak bir uzantısı hissedene göğüs kemiği Kaudal sonuna boynundan midline ventral izleyin.
      6. Orta noktası forseps kıkırdak uzantısı kavramak için kullanın ve gerekiyorsa saç veya deri vasıl belgili tanımlık alan düzeltme ekini kaldırarak xiphoid işleminin konumunu işaretleyin.
      7. Kısmen 26 G iğne xiphoid işleminin altında 20-30 ° açıyla yerleştirin.
      8. Yavaşça pistonu yavaş yavaş çekilerek şırınga için negatif basınç uygulayın, sonra iğne daha fazla kan akar kadar boşluğa yerleştirmek.
      9. Kan akışı durursa, yavaş yavaş iğne döndürmek veya biraz olarak taşımak ve dışarı.
      10. Üretral anterior karın deri forseps kapmak için çift tutun kullanım açma ve karın zarını aracılığıyla ventral orta çizgi boyunca kasığından çene için kesin için keskin diseksiyon makası kullanın.
      11. Geri çekin karın organları ve göğüs kafesi ile parmak duyurmak cilt veya künt forseps yavaşça karın organları kayar mı.
      12. Xiphoid işlemi, kapmak için forseps tutun kullanım göğüs kemiği kaldırın ve diyafram deşmek.
      13. Her iki tarafta yanal kaburga kesmek diseksiyon makası kullanarak. Göğüs kemiği sürükleyici, göğüs kafesi yukarı doğru çevirmek ve bağlantı Bankası kesti. Göğüs kafesi temel torasik organları açığa çıkarın.
      14. Aort kalp sol ventrikül (LV) 1-2 mL çözeltisi enjekte edilerek 1 x heparin çözüm dolu 10 bir mL şırınga bağlı 26 lik bir iğne ile sıvı.
          Not: sağlam aterosklerotik aort lezyonlar emin olmak için baskı ile yavaş bir hızda sıvı emin olun.
      15. Timus, akciğerler ve bağ dokusu tüketim. Adım 1.3.3.16 ve 1.3.3.17, bakın.
          1. Beyaz iki loblu (veya kelebek şeklinde) anterior kalp bulun organ ve sıkıca Forseps ile timus kapmak tutun. Her iki loblari yukarı doğru uzak kavite çekin ve tabanda makasla kesme.
          2. Akciğerleri kaldırmak için bir Akciğer lobu Forseps ile çimdik, doku göğüs boşluğuna uzak çekin ve tabanında kesti. Kalan her LOB için yineleyin.
      16. Diseksiyon mikroskop ve mikro-anatomi araçları ve aort (innominate arter, sol ortak Karotid arter ve sol subklavyan arter dahil), artan, azalan, torasik ve abdominal aort kemer toplamak kullanın.
          1. Kalbin sol ventrikül, artan aort bulun.
          2. Eğri 0.07 x 0.04 mm-uç bir çift ile forseps hafifçe sol ventrikül ortaya çıkan artan aort bölümünü kavramak.
             Not: için çevredeki sarı tinged yağ dokusu karşılaştırıldığında, aort LV yeterince heparin çözüm ile boşaltılan kaynaklanan bir parlak beyaz gemi olacak.
             1. Aort düzgün kardiyak perfüzyon tarafından temizlendi değil, aorta için boşluğuna bağlı kalırken aort tekrar sifonu çek. Bunu yapmak için kalp-aort Kavşağı kesme, kalp kaldırmak ve sonra yatay olarak abdominal aort alt uç ile kesti. Artan aort açılış 26 G iğne yerleştirin ve nazikçe heparin çözüm x 1 ile aort floş.
             2. Daha iyi yağ dokusu ve katıştırılmış aort arasında ayırımcılık için artan Aortası üzerine hafifçe tug.
             3. Artan aort hala hafifçe çekerek, kapalı bahar makas dissekan ucu artan aort ve aort saklanması yağ temizlemek için kullanın. Bunu yapmak için ucu kapalı makas bıçaklarının bağlanan yağ yıkmak yağ dokusu inme.
                Not: artan aort ile kemer açıkça görüntülenmeyecektir kadar kesim tarafından herhangi bir yağ dokusu bilincin kaçınmalıdır. Aort kesme önlemek için bu.
             4. Artan aort ile kemer surround Yağ dokusundan açıkça tarif, aşırı yağ tüketim için makas dissekan bahar kullanın.
             5. Yavaşça aort tutun Forseps ile. Yine bahar makas'ın ucu, inme, azalan, torasik ve abdominal aort Kaudal abdominal aort sonuna uzunluğu boyunca yağ kullanarak benzeri yağ kol sağ tarafında.
             6. Aort yağ hayata sarılıyorsan zaman kavramak devam edin. Nazikçe aorta zarar önlemek için yapmanız gerekir.
             7. Böylece yağ şimdi aort yerleştirilir yavaşça aort mikroskop yukarı doğru çekin.
             8. Kapalı makas bıçakları inen aorta, şiddetli ön sonuna yakın yağ-aort arabirimi arasında yağ dokusu'nın eki aorta'nın yüzeyine açık açık bir süpürme hareketi kullanarak ekleme.
                Not: İyice aşırı yağ kaldırma ve aort hala boşluğu içinde iken doku bağlantı önerilir.
             9. Kalp tüketim ve Kaudal abdominal aort sonuna kemiği kesti. Bütün aort kaldırın.
             10. Aort bir 35 mm tabak yerleştirin ve uzakta herhangi bir aşırı yağ iki 21'lik iğne kullanarak Aortası üzerine alay. Eksize aort 1.7 mL microcentrifuge tüp buz koyun.
   4. Tek hücre süspansiyonlar içine aort ayrılma
      1. Damlalıklı 0.2 mL aort ayrılma arabelleğe aort içeren tüp. Bahar makas bıçakları sonuna doğru konik tüp takın ve hızla aort enzimatik sindirimi kolaylaştırmak için bin dereden su getirmek.
      2. Doku-çözüm karışımı 15 mL toplama tüp ve pipet 1,8 mL aort ayrılma için bir tampon 2 mL toplam hacmi aktarın.
         Not: doku süspansiyon kolay aktarımı için bir standart 1000 µL pipet ucu konik sonu kapalı 1 cm kesti. Bir micropipette ile süspansiyon aktarmak için kısaltılmış ipucu kullanın.
      3. 55 dk. 37 ° C'de 220 rpm'de (0.514 x g) sallayarak, aort ayrılma arabellekte kıyılmış aort kuluçkaya.
      4. Süspansiyon 50 µm hücre süzgeç aracılığıyla 15 mL polipropilen toplama tüp içine geçmek. Bir şırınga dalgıç lastik piston filtreleme kolaylaştırmak için kullanın.
      5. 15 mL toplama tüp 1 mL FACS arabelleği ile durulayın, süspansiyon toplamak ve hücre süzgeç aracılığıyla geçmek.
      6. 50 µm hücre süzgeç iki ek kez 1 mL FACS arabelleği ile yıkayın.
      7. Hücreleri tarafından Santrifüjü 300 x g 4 ° C'de 5 min için de cips Soğuk FACS arabellek hücrelerde yeniden askıya alma. Bir Burker odası/hemasitometre hücreleri saymak.
      8. 1 x 10⁶ (Temel Akış Sitometresi) hücreleri veya tüm hücre süspansiyon (FACS için) etiketli 5 mL yuvarlak alt polistren tüpler aktarın. Akış Sitometresi Protokolü boyama için Bölüm 2'ye geçin.

2. Akış Sitometresi ve FACS boyama

Fluorophore	R-Phycoerythrin (PE)	PE/siyanür (Cy) 7	PE/siyanür (Cy) 5	Pasifik mavi (Türkçe)
Lazer (nm)	Mavi (488 nm) / (561-570 nm) - sarı yeşil (532 nm)	Mavi (488 nm) / (561-570 nm) - sarı yeşil (532 nm)	Mavi (488 nm) / (561-570 nm) - sarı yeşil (532 nm)	Violet (405 nm)
UyarmaMAX (nm)	496	496	496	401
EmisyonMAX (nm)	578	785	667	455
Fenotipik Marker	F4/80	CD11c	CD11b	CD45
	EMR1, Ly71	αx Integra, integrin αX zinciri, CR4, p150, ITGAX	αm Integra, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM	T200, Ly-5, LCA
Hedef hücre tipi	Doku ikamet makrofajlar	Klasik aktif (M1) makrofajlar	Monosit / makrofajlar	Lökosit (makrofajlar / monosit, lenfositler ve granülosit)
	Dendritik hücre alt grubunu	Dendritik hücreler, NK hücreleri, aktive T hücreleri ve bir alt bağırsak intraepitelyal lenfositlerin (IEL)	Granülosit, dendritik hücreler, NK hücreleri ve T ve B hücreleri alt kümeleri
Seyreltme faktörü	1:50	1: 100	1: 100	1: 100
İzotip denetimleri	PE sıçan Igg2a	PE/Cy7 Ermeni Hamster IgG	PE/Cy5 sıçan Igg2b	Pasifik mavi sıçan IgG2c

Tablo 2: Antikor öğesini fluorophore ayrımcı doku ikamet makrofajlar için belirli listesi.

1. Toplamak ve aşağıdaki öğeleri hazırlamak: FACS arabellek 5 mL yuvarlak alt polistiren tüpler, antikor engelleme Anti-fare CD16/32 Fc reseptör, fluorophore Birleşik veya birincil antikorlar, ikincil antikorlar (Eğer fluorophore Birleşik çekimsiz gerekli), 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
   Not: hücreler büyük miktarda boyama için antikor konsantrasyon cep numarası yerine en çok önemlidir. Örneğin, boyama 10 x 10⁶ boyama arabellek cilt hücreleri ve antikor konsantrasyon aynı sanki 1.0 x 10 boyama olmalıdır⁶ 100 µL arabellek hacmindeki hücreler. 1.0 x 10 boyama için⁸ hücreleri, 5-fold antikor miktarı artan tavsiye edilir.
2. Ek buz gibi FACS arabellek her FACS tüp ekleyin, hücreleri tarafından Santrifüjü 751 x g 5 min (4 ° C) için de cips. Süpernatant aşağıdaki Santrifüjü Aspire edin.
3. Anti-fare CD16/CD32 Fc reseptör antikor üretici yönergelerine göre tüm örnekleri engelleme ekleyin. 15 dakika 4 ° C'de veya buz üzerinde kuluçkaya.
4. Birincil antikor doğrudan Fc reseptör için engelleme antikor içeren süspansiyon hücre ve kuluçkaya kokteyl fluorophore Birleşik 30 dakika süreyle 4 ° C'de fluorophore Birleşik antikorlar ağartma en aza indirmek için ışık koruma örnekleri örnekleri ekleyin.
   1. Olay çekimsiz birincil antikorlar kullanıldı, adım 2.4 tamamladıktan sonra aşağıdaki adımları izleyin.
   2. Yıkama birincil antikor Santrifüjü 751 x g 5 min (4 ° C) için de tarafından örnekleri lekeli.
   3. Decanting tarafından süpernatant kaldırmak ve Pelet 100 µL FACS arabellekte yeniden askıya alma.
   4. Konjuge ikincil antikor için tüm gerekli örnekleri eklemek ve 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya 2.5 adıma geçin.
5. Aşağıdaki antikor kuluçka, buz soğuk FACS arabellek 2 mL ekleyin sonra 5 dakika (4 ° C) 751 x g hücreleri cips. Süpernatant dikkatle boşaltmak ve Pelet rahatsız değil emin olun.
6. Hücreleri hafifçe karıştırın ve sonra ile 200-400 µL FACS arabelleği yeniden askıya sonra bu kadar standart Akış Sitometresi Analizi veya hücre sıralama 4 ° C'de karanlıkta bırakın.
7. Lekeli hücreleri kısa vadeli fiksasyonu için adımları 2.8 2.10 için devam edin. Fiksasyon standart Akış Sitometresi için kullanın.
8. Adım 2.5, hemen ardından yeniden askıya 0.5 mL % 2-4 paraformaldehyde (PFA) 15-30 dk 4 ° c için hücrelerde
   Not: Dikkat: PFA değil kanserojen ve toksik etkileri ile bilinen bir tahriş edici. İngiltere'de yılın kullanırken, aşırı dikkatli başa. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve havalandırma egzoz emin olun.
9. Aşağıdaki fiksasyon, tüm örnekleri için 2 mL FACS arabelleği ekleyerek hücreleri yıkama ve vasıl 751 x g 5 dk. Kaldır süpernatant aşağıdaki Santrifüjü için 4 ° C'de santrifüj kapasitesi.
10. Sabit buz soğuk FACS arabellek ve mağaza 4 ° C'de 200 µL hücrelerde resuspend Mağaza düzeltme 4 ° C'de 1 hafta kadar hücreleri, ideal olarak Akış Sitometresi edinme autofluorescence en aza indirmek için 48 saat içinde gerçekleştirin.
11. Akış Sitometresi veri akış sitometresi üreticinin yönergelerine uygun elde etmek veya floresan aktif hücre Basu ve arktarafından açıklandığı gibi sıralama gerçekleştirir. ²³

Sonuçlar

Apolipoprotein E eksik (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) fareler yüksek yağ yüksek kolesterol diyet (HCHFD veya HCD) 18 hafta, 1 x 10⁴ - 2 x 10⁴ CD45 tutulan kullanırken⁺F4/80⁺ ne zaman iki örnek aortik makrofajlar izole olabilir havuza alınmış. HFHCD beslenen ApoE KO fareler disseke ciğeri üretilen (ki mevcut sıralama zaman bağlıdır) 5 x 10 göre⁵ Kupffer hücreleri daha büyük. Ne zaman yüksek yağlı diyet (HFD) kullanarak be...

Tartışmalar

Komorbiditeler ateroskleroz, basit yağlanma, steatohepatitis gibi taklit ve tip 2 diyabet diyet kaynaklı metabolik bozukluk modelleri temel moleküler mekanizmaları hastalık progresyon daha iyi anlamak için yaygın olarak kullanılır. Collagenase bağımlı sindirim genellikle doku hücreleri hücre dışı Matriks (ECM)^16,27den kurtarmak için ayırmak için kullanılır. Collagenase gibi enzimler hücre komşu için yapısal destek sağlayan kolajen bozab...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G x 5/8 in Needles	BD	305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set	BD	367297	Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles	BD	305156
1 mL syringe with rubber stops	BD	309659
10 mL Syringes	BD	309604
1 mL Syringe	BD	309659
F4/80 PE	Biolegend	123110
CD11c PE/Cy7	Biolegend	117318
CD11b PE/Cy5	eBioscience	15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block	Biolegend	101320
CD45 Pacific Blue	Biolegend	103126
PE Rat IgG2a	Biolegend	400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG	Biolegend	400922
PE/Cy5 Rat IgG2b	Biolegend	400610
Pacific Blue Rat IgG2c	Biolegend	400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Cellgro	21-031-CV
70 μm cell strainers	Corning, Inc.	352350
1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x	Electron Microscopy Sciences	CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp	Stoelting	52132-10P	Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm	Stoelting	52102-37P	Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge	Fine Science Tool	15000-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps	Fine Science Tool	11297-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved)	Fine Science Tool	13021-12
Heparin Sodium Salt	Fischer Scientific	9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes	Fischer Scientific	12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid	Fischer Scientific	08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes	Fischer Scientific	14-959-5
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)	Millipore	EX0285-1
Bovine Serum Albumin	Rockland	BSA-50
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Collagenasse Type XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase Type I	Sigma-Aldrich	H3506
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich	C0130
NaOH	Sigma Aldrich	1310-73-2
CaCl2	Sigma Aldrich	449709-10G
500 mL beaker	Sigma Aldrich	02-540M
4 cm Hemostatic clamp	Stoelting	52120-40
Toothed forceps	Stoelting	52104-33P
50 μm Disposable filters	Systemex	04-0042-2317
Collagenase Type IV	ThermoFischer Scientific	17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK)	ThermoFischer Scientific	A1049201
Razors (0.22 mm (0.009"))	VWR International	55411-050
Texas Red Live/Dead stain			Red viability stain (in Figure 1A)