Изоляция, характеристика и очистки макрофагов из пострадавших от связанных с ожирением воспаление тканей

Резюме

Этот протокол позволяет исследователю изолировать и характеризуют ткани резидентов макрофаги в различных hallmark воспаленных тканей, извлеченные из диеты индуцированной модели метаболических расстройств.

Аннотация

Ожирение способствует хронические воспалительные государство, которое во многом опосредовано макрофагов ткани резидентов, а также моноцитарных макрофагов. Диета индуцированной ожирение (DIO) является полезной моделью в изучении роли неоднородности макрофагов; Однако адекватные макрофагов изоляции трудно приобрести из воспаленных тканей. В этом протоколе мы наметим шаги изоляции и необходимого руководства по устранению проблем, производный от наших исследований для получения подходящей населения макрофагов ткани резидентов от мышей после 18 недель высокой жирностью (HFD) или высокой жира/высокий холестерина ( Диетические вмешательство HFHCD). Этот протокол фокусируется на три пробы тканей, учился в ожирение, атеросклероз, включая печень, белой жировой ткани (Ват) и аорты. Мы подчеркиваем как дуалистической использование потока цитометрии можно добиться новое измерение изоляции и характеристика тканей резидентов макрофаги. Основной раздел настоящего протокола адреса тонкости лежащие в основе ткани конкретных ферментативного пищеварения и макрофагов изоляции и последующих клетк поверхности антитело пятная для анализа потока гранулярных. Этот протокол адреса существующих сложностей, лежащих в основе активированного люминесцентные клеток, сортируя (FACS) и представлены разъяснения этих сложностей, с тем чтобы получить широкий диапазон характеристик от адекватно отсортированный клеточных популяций. Методы альтернативной обогащения включены для сортировки клеток, например, плотная печень, позволяя для гибкости и времени управления при работе с СУИМ. Короче говоря этот протокол СПИД исследователь оценить неоднородность макрофагов из множества воспаленных тканей в рамках данного исследования и обеспечивает проницательные советы по устранению неполадок, которые оказались успешными для благоприятного сотовой изоляции и характеристика иммунных клеток в Дио опосредованной воспаления.

Введение

Мышь модели широко используются для изучения динамики заболеваний человека. Надлежащая изоляция резидентов клеток ткани от мышей в состоянии больной может обеспечить платформу для понимания молекулярная и клеточная вклад в патогенезе заболевания¹. Одно расстройство, которое имеет решающее значение является ожирение. Распространенность ожирения продолжает расти во всем мире параллельно с сопротивлением инсулина и типа 2 диабет, сердечно-сосудистых заболеваний и жировой болезни печени^2,3. Чрезмерное потребление питательных веществ далее перекос, снижение физической активности, вызывая изменения сигналов, вытекающих из жировой ткани, который может изменить клеточного окружения других периферийных тканей, таких как аорты и печени⁴. Такие нарушения метаболизма гомеостаза приводит к хронической низкосортных внутрирастительного воспаления⁵.

Классическая активация макрофагов, резидент в аорту и печени, а также их вербовки в белой жировой ткани (Ват) было показано не только инициировать регуляции метаболических сигналов, но также поддерживать воспаление^6,7. Фенотипические и функциональных неоднородность макрофагов прочно ассоциируется с патогенезе ожирения связаны сопутствующие заболевания⁷. Динамический пластичности в макрофагов поляризации позволяет эти клетки демонстрируют широкий спектр активированные фенотипов, которые координируют прогрессии и резолюции воспаления⁸. В то время как классически Активированные макрофаги (M1) вовлечены в распространении воспаления, альтернативно Активированные макрофаги (м2) были связаны с резолюцией и ткани ремонт^9,10.

Как тело испытывает метаболический стресс, аномально накапливается белой жировой ткани. Расширенный жировой ткани привлекает и удерживает воспалительные клетки, которые глубоко изменить функции нормальной Адипоцит содействовать сопротивление инсулина, гипергликемия и в конечном итоге сахарный диабет типа 2, сопротивление инсулина или гипергликемия^{11, 12}. Параллельно белой жировой ткани переделывает в ответ на воспалительные сигналы, выпущенное проникли классически активированные (M1) жировой ткани макрофагами (банкоматов)^13,14. Этот многоклеточной орган оказывает Каскад сигналов, derails нормальной функции других органов тела, например, аорта и печени⁴.

Печень является метаболически электростанция, которая адаптируется в ответ на раздражители, происходящих из близлежащих dysregulated Ват¹⁵. Макрофагами печени или клеток Купфера, в ответ на метаболические изменения, выделяют воспалительных цитокинов, что преобразования как Паренхиматозный и фенотип не Паренхиматозный клеток и содействовать тканей ремоделирования. Накопление липидов в печени, воспаление, депозиты чрезмерно внеклеточного матрикса, некроз и возможные функции потерь следует воспалительных оскорбления, предоставляющих широкий спектр повреждения печени, связанные с безалкогольных жирная болезнь печени ^16,17,18.

Параллельно с нарушенной Ват и функции печени крупные артерии накапливаться липидов в стенке артерий, как тело испытывает хронический метаболический стресс¹⁹. Накопление липидов артериальной вызывает секрецию chemokines активированный эндотелиальных клеток и последующего набора моноциты²⁰. После вербовки, моноциты размножаться, дифференцировать, глотать липопротеинов и стать пены клетки. Атерогенеза инициируется и устойчивого про воспалительных деятельности набранных и тканевых макрофагов резидентов липидов Ладена. Поддаваясь внеклеточные и внутриклеточных стресс сигналы передаются в этом атерогенные микроокружения, эти макрофаги затем заниматься apoptotic сигнальный Каскад. Как эти пены клетки умирают, они способствуют их содержание липидов заполнены на ядро некротические поражения, которое затем приводит к разрыву зубного налета, инфаркта миокарда и инсульта.

Коллективно неоднородность фенотипов макрофагов в части оркеструет ожирения, вызванных воспалительные изменения, наблюдаемые в dysregulated ткани, такие как Ват, печень и аорты^8,21. Характеристику набранных и ткани-резидентов макрофаги могут обеспечить понимание потенциальных молекулярных целей, которые манипулируют макрофагов фенотип¹. Эффективно охарактеризовать макрофаги от ожирения индуцированной воспаленных тканей, подвески одной ячейки можно получить путем ферментативного пищеварения. Такие протоколы диссоциации должна быть эффективной в достаточно унижающего достоинство соединительной ткани при минимизации иммунных клеток смерть и обеспечивая оптимальное ячейки урожайности. Смесь ферментов зависит от типа ткани и ее структурных составляющих. Эластичных тканей, таких как аорты требует сильнее ферментативную активность, по сравнению с печени и Ват, для достижения ткани диссоциации. От одноклеточного подвеска резидентов макрофаги ткани может быть однозначно характеризуется или изолированные для дополнительного течению анализа, таких как транскрипционный анализ профиля.

Здесь ткани конкретного протокол описан, использующий коллагеназы зависимых тканей пищеварение и полихромный проточной цитометрии эффективно изолировать и характеризуют ткани резидентов макрофаги, полученные от традиционного рациона индуцированной ожирения, атеросклероз, простой стеатоз и стеатогепатит мыши модели. Одновременная окрашивания клеток поверхности маркеров с антителами против лейкоцита-(CD45 или CD11b) и макрофагов - специфических антигенов (F4/80), часто используется для идентификации макрофагов населения²². Активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS) является мощной стратегией, используемый для сортировки этих выявленных подвергающегося высокой чистоты. Отсортированный населения можно затем оценить фенотип профилей конкретных генов с помощью течению молекулярного анализа (например, количественные реального времени полимеразной цепной реакции)²³. Хотя стандартные проточной цитометрии и сортировки потока на основе цитометрии клеток являются мощными инструментами в отличительный макрофагов в суспензии значительно гетерогенных клеток, бывший протоколы должны быть оптимизированы для обеспечения успешного вывода. В этом исследовании описываются протоколы, которые эффективно изолировать и характеризуют конкретные жизнеспособных тканевых макрофагов; что еще более важно это исследование обеспечивает решающую понимание технических вопросов, которые часто возникают, а также активную и неисправностей стратегии предотвращения и/или их решения.

протокол

Все экспериментальные протоколы (разделы 1, 1.2 и 1.3) были утверждены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете штата Пенсильвания.

Ткани	Диссоциация буферы подготовки	Окончательный объем	Хранения
Белой жировой ткани (Ват)	Диссоциация буфера: 2,5% HEPES, 10 мг/мл бычьим сывороточным альбумином (БСА), 3 мг/мл (0.3%) Коллагеназы типа II в Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) с глюкозой 4,5 г/Л без пируват натрия и L-глютамина	500 мл	минус 80° C (10 мл аликвоты)
Печень	25 x перфузии буфера концентрат (PBC): 3,55 М NaCl, 168 мм KCl, 240 мм HEPES, 150 мм NaOH в дистиллированной деионизированной H2O	500 мл	минус 20° C (40 мл аликвоты)
	Сохранения буфера (PRB): 1% BSA в 1 x перфузии буфера	1 Л	4 ° C
	Диссоциация буфер: 1 x перфузии буфера дополнена 4,76 мм CaCl2 и 72 ед/мл коллагеназы типа IV	50 мл (на мышь)	Готовят непосредственно перед использованием
Аорта	Диссоциация: 125 ед/мл коллагеназы тип Буфера XI, 60 ед/мл гиалуронидазы типа I, 60 ед/мл DNase I, 450 ед/мл коллагеназы типа I, 20 мм HEPES 1 x Buffered фосфатный (PBS)	500 мл	минус 80° C (10 мл аликвоты)

Таблица 1: Рецепты буфера конкретных перфузии тканей.

1. ткань изоляции и разобщенности

1. Ват изоляции и разобщенности
   1. Подготовка тканей конкретных буферов согласно таблице 1и хранить их, как описано.
   2. Подготовьте следующие реагентов.
      1. Подготовьте буфере пищеварение, оттаивания соответствующий объем буфера диссоциации Ват и хранить при 4 ° C до использования. Непосредственно перед применением теплый буфера до 37 ° C. Подготовьте СУИМ буфера путем подготовки 1 x фосфат амортизированное saline (PBS), содержащий 2% плода бычьим сывороточным (ФБС).
   3. Ват изоляции
      1. Усыпить камере мыши в двуокись углерода (CO₂) заполнены. Проверить эффективность до продолжения на сцену рассечение.
      2. Окуните Усыпленных мыши кратко в стакан, содержащие 70% этанол до тех пор, пока тщательно смоченной и покрытием с этанолом. Место мыши вентральной поверхности вверх на сцене диссекции и закрепите мыши передний и задние лапы рассечение Совету использованием 21 G иглы.
      3. Использовать средние точки оконечности щипцы понять брюшной кожи предшествовавшие уретры открытия, а затем использовать рассечения острыми ножницами сделать Ник в захваченной кожи живота.
      4. Вставьте маленький разрез между кожей и брюшины нижнего лезвия ножниц и сделать боковой разрез от живота к грудной клетке.
      5. Осторожно потяните назад кожу, чтобы разоблачить нетронутыми брюшной полости и сделать боковой разрез через брюшину и либо загибается прозрачной мембраны или акцизного ткань подвергать брюшной Ват.
      6. Собрать perigonadal жировых отложений, как описано в Манн и др. ²⁴
         1. Perigonadal жировых отложений у мышей-самцов слабо связаны и придатка яичек. Сначала найдите семенников и затем с средней точки щипцы, Возьмите голову придатка и слегка потяните.
         2. С помощью острых ножниц рассечения, акцизных каждый эпидидимальных жировой ткани путем разрезания вдоль поверхности придатка (голова, тело и хвост) и яичках.
         3. Пинцетом осторожно потяните на жировой ткани во время резки через соединительной ткани непосредственно привязан к структуре придатка яичка.
         4. С помощью щипцов, твердо захват конец жировой ткани проксимальнее придатка и осторожно снимите жира накладку гонады
         5. В самок мышей perigonadal жира подушечки слабо Бонда в рога матки и тела матки.
         6. С помощью средней точки щипцы, сцепление perigonadal жировой ткани и осторожно потяните ткань от рога матки и тела матки.
         7. Акцизный каждый жировой ткани путем разрезания вдоль тела матки и рога матки с использованием рассечения острыми ножницами.
      7. Место жир колодки в чашке Петри заполнены с PBS и держать на льду держать влажной ткани.
   4. Диссоциации о Ват в одну ячейку суспензий
      1. Удалите избыток PBS из Петри и использовать одним краем лезвия для фарша брюшной Ват на мелкие кусочки.
      2. С острым краем лезвия бритвы аккуратно очистите фарш брюшной Ват в помечены 15 мл полипропиленовые коллекции трубка, содержащая 2 мл Ват диссоциации буфера.
      3. Инкубируйте эту смесь ткани пищеварение буфера под медленное непрерывное вращение при 37 ° C на 45 мин.
      4. Фильтр переваривается ткани через стрейнер ячейки 70 мкм в 50 мл трубки коллекции во время движения резиновые поршень поршень шприца в круговом движении и продолжают сита суспензии клеток через фильтр.
      5. Пипетки 2 мл Дульбекко вверх и вниз в 15 мл трубки коллекции, нежно накапайте среднего изменения орла (DMEM) и промойте фильтр с одной ячейкой подвеска.
      6. Промойте фильтр еще два раза с холодной среде DMEM и поместите одну ячейку подвеска на льду.
      7. Центрифуга суспензию клеток на 300 x g при 4 ° C на 8 мин.
      8. Используйте Вакуумный аспиратор тщательно удалить плавающие адипоцитов (первый) и оставшиеся супернатант. Убедитесь в том, чтобы не мешать гранулированных стромальные сосудистой дроби (СФДВ).
      9. С 1000 мкл пипетки нежно вновь приостановите гранулы в буфере аммония хлорид калия (ACK) лизируют эритроцитов согласно инструкциям производителя.
      10. Разбавить выше суспензию клеток с DMEM и центрифуги суспензию клеток на 300 g при 4 ° C на 8 мин.
      11. Вновь приостановить клетки в холодной PBS, содержащий 2% FBS (FACS буфера) и подсчитать количество ячеек в Burker камере/Горяева.
      12. Передача всей ячейки подвеска (для СУИМ) или 1 x 10⁶ клеток (для основных проточной цитометрии) помечены 5 мл раунд дно из полистирола трубы. Продолжить к разделу 2 для проточной цитометрии пятнать протокол.
2. Ткани печени изоляции и разобщенности
   Примечание: Этот протокол был адаптирован от Smedsrød²⁵.
   1. Подготовка тканей конкретных буферов согласно таблице 1 и хранить их, как описано.
   2. Подготовьте следующие реагентов.
      1. Подготовка 1 x перфузии буфера (PB), путем разбавления 40 мл КПБ в 960 мл сверхчистого H₂O. предварительно теплой шприц заполнены с PB 50 мл при 37 ° C, непосредственно перед началом перфузии. Исключите любой настоящий пузырьков воздуха.
         1. Чтобы избежать воздушных пузырей, Инвертируйте шприц, где подсказка блокировки leur указывая вверх. Флик шприц, пока пузырьки воздуха в верхней ПФ шприц или коснитесь ее. Осторожно нажмите на поршень, чтобы изгнать воздух
      2. Подготовьте пищеварение буфера путем разбавления 0,5 мл 476 мм CaCl₂ решениядо 49,5 мл 1 x перфузии буфера. Добавьте 3600U коллагеназы типа IV 4,76 мм CaCl₂ – PB решение. Предварительно теплой шприц заполнены с 50 мл буфера пищеварения при 37 ° C, непосредственно перед началом перфузии. Ликвидации нынешней воздушные пузыри, как описано в шаге 1.2.2.1.1.
      3. Подготовьте сохранения буфера (PRB) путем растворения 2.5 g бычьим сывороточным альбумином (БСА) в 250 мл 1 x перфузии буфера. Хранить при 4 ° C, или держать на льду до использования.
      4. Подготовьте СУИМ буфер с 1 x PBS и 2% FBS.
   3. Изоляция ткани печени
      1. Усыпить мыши CO₂ удушение, насытить мышь с 70% этанола для предотвращения загрязнения внутрибрюшное органов с мехом.
      2. Положение вентральной стороне мыши вверх на полистирола вспененного, пройдя через Совет и обеспечить мыши передних и задних лапы рассечение Совету использованием 21 G иглы.
      3. Подвергать грудной стенки и брюшной полости, понять брюшной кожа возле уретры открытия с помощью средней точки оконечности щипцами. Затем используйте рассечения ножницами для создания небольшой надрез на захваченной брюшной кожу.
      4. Вставьте маленький разрез между кожей и брюшины нижнего лезвия ножниц и сделать боковой разрез от паха до подбородка.
      5. Осторожно потяните назад кожу, чтобы разоблачить нетронутыми брюшной полости и грудной стенки, сделать боковой разрез через брюшину и акцизных мембраны.
      6. Поднимите грудины и тщательно надрезать диафрагмы, будьте уверены, чтобы не мешать нижней полой вены (IVC). Переместить в сторону органов желудочно-кишечного тракта и найдите subhepatic мкВ. Используйте гемостатический пинцет для зажима suprahepatic IVC поддерживать локализованные перфузии.
         Примечание: Чрезмерное накопление висцеральных белой жировой ткани часто может маскировать мкВ. Чтобы лучше визуализировать это судно, можно вырезан небольшой площади жировой ткани рядом с мкВ. Резаная окна в пределах податливой жировой ткани затем может располагаться над IVC подвергать судно для катетеризации.
      7. Прикрепите шприц, заполнены с подогретым PB в наборе сбора и вливания крови 23 G. Осторожно нажмите на поршень, до тех пор, пока иглы и трубки заполнены с PB.
      8. Вставьте иглу 23 G, параллельно с уровня subhepatic мкВ. Безопасности иглы на месте с помощью гемостатический зажим 4 см.
         Примечание: Катетеризации subhepatic, которую IVC предпочтителен в диете кормили мышей в том, что может быть лучше мкВ визуализируется и канюлированной внутри полости заполнены жира.
      9. Осторожно нажмите на поршень начать перфузии, цвет будет быстро избавиться от печени (правой доли сначала) если игла надлежащим образом позиционируется в сосуде. Увеличение долей также является видимым, если иглы правильно вставлена в subhepatic мкВ.
      10. Быстро вырежьте воротной вены, чтобы позволить PB свободно течь через печень.
      11. Perfuse печени, до тех пор, пока кровь больше не видна. По случаю мягко массаж печени долей между передний план палец и большой палец, чтобы облегчить перфузии.
          Примечание: Важно использовать-зубчатые тупыми краями инструменты для обработки для предотвращения повреждения тканей печени.
      12. Когда 5 мл PB остается в шприц, измените на шприц, заполнены с подогретым диссоциации буфера. Не беспокоить положение обеспеченных иглы в это время.
          Примечание: Увеличена печень, который значительно превышает 1,5 g следует увлажненную с больший объем буфера подогретым пищеварение гарантировать успешный печени диссоциации.
      13. Perfuse печени пока не полностью переваривается. Мягко массаж печени лопастями для облегчения перфузии.
          Примечание: Разделение Глиссон в капсулу из паренхимы является наблюдаемая в успешно усваивается печенью. Оценить это, используйте тупой край пару щипцов, аккуратно нажмите на левой боковых лепестков. Впечатление должен появиться на поверхности и отступ следует заполнить медленно после удаления щипцы.
      14. Удалите иглу из subhepatic мкВ. Не удаляйте гемостатический пинцет, пережатия suprahepatic мкВ.
      15. Акцизный весь печени тщательно разрубом через соединение связок, используя короткие прямые лезвия, рассекает ножницы и удаление желчного пузыря.
      16. Поместите весь печени в чашке Петри 10 см содержащие 10 мл ледяной сохранения буфера и хранить при 4 ^оC до готовы освободить клетки.
   4. Диссоциации клеток печени
      1. Передача печени в 10 см блюдо, содержащие 10 мл ледяной DMEM.
      2. Захват разорвала suprahepatic, придаваемое IVC подакцизным печени с помощью зубчатого щипцами. Используйте средней точки щипцы выпустить клетки от Глиссон капсулы, применяя поглаживание быстрое движение для каждого лепестка.
      3. Передайте насыщенных DMEM через стрейнер ячейки 70 мкм, придают коллекции Тюбик 50 мл.
      4. Накапайте 10 мл ледяной DMEM Петри 10 см и повторите шаги 1.2.4.1 для 1.2.4.3 до насыщения СМИ больше не наблюдается. Место суспензию клеток на льду или на 4 ° C.
      5. Аккуратно перемешать суспензию клеток, инвертирование трубки коллекции и затем центрифуги на 54 g x 2 мин при 4 ° C.
      6. Соберите супернатант в коллекции чистый 50 мл трубки. Затем центрифуга суспензию клеток в 54 g x 2 мин при 4 ° C.
      7. Повторите шаг 1.2.4.6 еще два раза, прежде чем перейти к шагу 1.2.4.8.
      8. Супернатант передать трубку чистой 50 мл коллекции и центрифуги суспензию клеток на 300 g x 10 мин при 4 ° C.
      9. Вновь приостановить гранулы не Паренхиматозный клеток в буфере СУИМ и считать их в Burker камере/Горяева.
      10. Передачи 1 x 10⁶ клеток (для основных проточной цитометрии) или 15 x 10⁶ - 20 х 10⁶ клеток (для СУИМ) помечены 5-мл раунд дно из полистирола трубы. Продолжить к разделу 2 для проточной цитометрии пятнать протокол.
3. Аорта изоляции и разобщенности
   Примечание: Этот протокол был адаптирован от мясникаet al.²⁶
   1. Подготовка тканей конкретных буферов, основанный на рецепты, приводятся в таблице 1 и хранить их, как описано.
   2. Подготовьте следующие реагентов.
      1. Подготовьте буфере пищеварение, оттаивания соответствующий объем буфера диссоциации Ват и хранить при 4 ° C до использования. Непосредственно перед применением теплый буфера до 37 ° C.
      2. Приготовляют раствор гепарина 10 x, растворяя гепарина натриевой соли в однократном ПБС в концентрации 200 ед/мл. Развести 10 x Стоковый раствор гепарина с ПБС подготовить 1 x Гепарин раствор. Магазин 10 x и 1 x решения гепарина на 4 ° C до использования.
      3. Подготовьте СУИМ буфер с ПБС, содержащий 2% FBS.
   3. Дисекция аорты
      1. Усыпить мышь в камере двуокиси углерода заполнен и полоскания с 70% этиловом спирте.
      2. Место вентральной стороне мыши вверх на сцене рассечение, распространение мыши передний и задние лапы и закрепите их в Правление рассечение, с помощью иглы 21 G.
      3. Сразу же после euthanizing мыши, выполните сердца прокол. Обратитесь к шагам 1.3.3.4 для 1.3.3.9, в случае необходимости.
      4. Найдите мечевидного отростка в нижней части грудины
      5. Сделать это, Поместите палец медианы по ширине шею животного. Трассировки вдоль вентральной midline от шеи в хвостовой конец грудины, пока не почувствовал хрящевой расширение.
      6. Используйте корнцанг средней точки понять хрящевой расширение и при необходимости отметьте место мечевидного отростка, удалив патч волос или кожи в зоне.
      7. Частично Вставьте иглу 26 G под мечевидного отростка под углом 20-30°.
      8. Осторожно применять отрицательное давление в шприц сняв поршень медленно, а затем вставить иглу далее в полость до потоки крови.
      9. Если поток крови останавливается, медленно поверните иглу или переместить слегка в и вне.
      10. Использование пара щипцы захватить провести брюшной кожи предшествовавшие уретры открытие и использовать рассечения острыми ножницами отрезать вдоль вентральной midline через брюшины от паха до подбородка.
      11. Потяните кожу, чтобы разоблачить органов брюшной полости и грудной клетке с пальцами или тупым щипцами осторожно двигаться органов брюшной полости в сторону.
      12. Используйте корнцанг захватить провести мечевидного отростка, поднимите грудины и надрезать диафрагмы.
      13. Рассечения ножницами, вырежьте через боковые ребра с обеих сторон. Сжимать грудину, флип грудную клетку вверх и прорваться через смежные базы. Удаление грудной клетки, подвергая основных органах грудной клетки.
      14. Perfuse аорты с 26-иглы придает 10 мл шприц, заполнены с 1 x Гепарин раствор путем инъекций 1-2 мл раствора в левом желудочке сердца (LV).
          Примечание: Не забудьте perfuse медленными темпами с минимальное давление для обеспечения нетронутыми атеросклеротических поражений аорты.
      15. Акцизы, вилочковой железы, легких и соединительной ткани. Обратитесь к шагам, 1.3.3.16 и 1.3.3.17, в случае необходимости.
          1. Предшествовавшие сердце найти белый двухлопастную (или бабочка форме) органа и твердо захватить провести тимуса пинцетом. Потяните вверх обеих долях от полости и сократить на базе с ножницами.
          2. Для удаления легких, щепотку доли легких с щипцами, потяните ткань от грудной полости и сократить на базе. Повторите для каждой оставшейся доли.
      16. Используйте микроскопом диссекции и микро Рассекающий инструменты и собирать аорты арки (включая безымянной артерии, левую общую сонную артерию и левой подключичной артерии), по возрастанию, по убыванию, грудной и брюшной аорты.
          1. Найдите восходящей части аорты в левый желудочек сердца.
          2. С парой изогнутые 0,07 х 0,04 мм наконечник щипцы нежно обхвати часть восходящей части аорты, выходящих из левого желудочка.
             Примечание: По сравнению с окружающих желтым оттенком жировой ткани, аорты будет яркий белый судна, возникая от LV, когда достаточно промыть раствором гепарина.
             1. Если аорты не был должным образом покраснел от сердца перфузии, флеш аорты снова в то время как аорты остается подключенным к полости. Чтобы сделать это, сократить около перекрестка сердца аорта, удалить сердце и затем разрезается горизонтально через нижний конец брюшной аорты. Вставьте иглу 26 G в открытии восходящей части аорты и осторожно промойте аорты с 1 x Гепарин раствор.
             2. Аккуратно буксир на восходящей части аорты лучше различать между жировой ткани и внедренного аорте.
             3. По-прежнему осторожно потянув на восходящей части аорты, используйте кончик закрытых весны, рассекает ножницы для очистки жира, которые инкапсулируют восходящей аорты и дуги аорты. Чтобы сделать это, инсульт жировой ткани с кончик лезвия закрытыми ножницами оторвать соединения жира.
                Примечание: Воздерживаться от иссечения любой жировой ткани путем разрезания до восходящей аорты и дуги могут быть четко визуализированы. Это необходимо для предотвращения резки аорты.
             4. Если восходящей аорты и дуги могут быть четко от объемного жировой ткани, используйте весной, рассекает ножницы для акцизных избыточного жира.
             5. Аккуратно схватить аорты с щипцами. Снова с помощью ножниц весной кончика, инсульта в жир по длине по убыванию, грудной и брюшной аорты в хвостовой конец брюшной аорты, так на правой стороне рукав жира.
             6. Продолжать понять вдоль аорты, когда отрыв жир. Не забудьте сделать так нежно, чтобы предотвратить повреждение аорты.
             7. Осторожно потяните аорты вверх к Микроскоп, так, что жир теперь располагается позади аорты.
             8. Вставьте лезвия закрытыми ножницами между интерфейсом жир аорты в конце передней нисходящей аорты, тяжелой жировой ткани привязанность к поверхности аорты, тупо используя радикальные движения.
                Примечание: Тщательно удаление избыточного жира и соединительные ткани в то время как аорты находится все еще в полость рекомендуется.
             9. Акцизный сердце и режут на хвостовой конец брюшной аорты поперечно. Удалите весь аорты.
             10. Аорты в 35 мм блюдо и дразнить прочь любые излишки жира на аорте, используя две иглы 21-го калибра. Место подакцизным аорты в пробки microcentrifuge 1,7 мл на льду.
   4. Диссоциация аорты в одну ячейку суспензий
      1. Накапайте 0,2 мл аорты диссоциации буфера трубка, содержащая аорты. Вставьте лезвия ножниц весной направлении конической трубки и быстро фарш аорты для облегчения ферментативного пищеварения.
      2. Передача смеси ткань решение в 15 мл коллекции трубки и пипетки 1.8 мл аорты диссоциации буфер для общего объема 2 мл.
         Примечание: Для легкой передачи ткани подвески, вырежьте 1 см конический конец стандартный наконечник пипетки 1000 мкл. Для переноса подвеска с микропипеткой используете кончик сокращен.
      3. Инкубируйте фарш аорты в буфере диссоциации аорты 55 минут при 37 ° C, тряски на 220 об/мин (0,514 x g).
      4. Передайте подвеска через сито ячейки 50 мкм в 15 мл полипропиленовые коллекции. Для облегчения фильтрации используйте резиновые поршень поршень шприца.
      5. Промойте трубку коллекции 15 мл с 1 мл СУИМ буфера, собирать подвеска и проходят через сито ячейки.
      6. Промойте ситечко ячейки 50 мкм еще два раза с 1 мл СУИМ буфера.
      7. Пелле клетки центрифугированием при 300 g x 5 мин при 4 ° C. Вновь приостановите клетки в холодных СУИМ буфера. Подсчитать ячейки в Burker камере/Горяева.
      8. 1 x 10-⁶ (для основных проточной цитометрии) клетки или приостановление всей ячейки (для СУИМ) передавать помечены 5 мл раунд дно из полистирола трубы. Продолжить к разделу 2 для проточной цитометрии пятнать протокол.

2. поток цитометрии и СУИМ пятнать

Флюорофор	R-фикоэритрин (PE)	PE/цианиновые (Cy) 7	PE/цианиновые (Cy) 5	Тихоокеанский синий (PB)
Лазер (Нм)	Синий (488 нм) / желтый (561-570 Нм) - зеленый (532 нм)	Синий (488 нм) / желтый (561-570 Нм) - зеленый (532 нм)	Синий (488 нм) / желтый (561-570 Нм) - зеленый (532 нм)	Фиолетовый (405 нм)
ВозбужденияМакс (Нм)	496	496	496	401
ВыбросовМакс (Нм)	578	785	667	455
Фенотипические маркер	F4/80	CD11c	CD11b	CD45
	EMR1, Ly71	Интегрин αX, Интегрин αX цепи, CR4, p150, ITGAX	ΑM Интегрин, Mac-1, МО1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAM	T200, Ly-5, ДМС
Тип целевой ячейки	Ткани-резидентов макрофаги	Макрофаги классически активированные (M1)	Моноцитов / макрофагов	Лейкоциты (макрофагов / гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов)
	Подмножество дендритных клеток	Дендритные клетки, клетки, активация Т-клеток и подмножество кишечных интраэпителиальных лимфоцитов (IEL)	Гранулоцитов, дендритные клетки, клетки и подмножества T и B клеток
Коэффициент разрежения	1:50	1: 100	1: 100	1: 100
Isotype элементы управления	PE крыса IgG2a	Армянский хомяка PE/Cy7 IgG	PE/Cy5 крыса IgG2b	Тихоокеанский синий крыса IgG2c

Таблица 2: Список Флюорофор меткой антител специфических для требовательных ткани-резидентов макрофаги.

1. Собрать и подготовить следующие пункты: СУИМ буфера 5 мл раунд дно полистирола трубы, анти мыши CD16/32 Fc рецепторов блокируют антитела, Флюорофор конъюгированных или неконъюгированной первичных антител, конъюгированных Флюорофор вторичные антитела (если необходимо), 1 x фосфат амортизированное saline (PBS).
   Примечание: Для окрашивания больших количеств клеток, концентрация антител является наиболее важных, а не номер ячейки. Например если окрашивание 10 х 10⁶ клеток окрашивание объем буфера и антитела концентрация должна быть такой же, как если окрашивание 1.0 x 10⁶ клеток в объеме 100 мкл буфера. Для окрашивания 1.0 x 10 рекомендуется⁸ клеток, увеличивая количество антител 5 раз.
2. При необходимости добавьте дополнительные ледяной СУИМ буфер для каждой трубы СУИМ, Пелле клетки центрифугированием в 751 x g 5 мин (4 ° C). Аспирационная супернатанта следующие центрифугирования.
3. Добавление анти мыши CD16/CD32 Fc рецептор блокирование антитела для всех образцов в соответствии с инструкциями производителя. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C или на льду.
4. Добавьте Флюорофор конъюгированных основное антитело коктейль непосредственно с Fc-рецепторами блокирующих антител содержащих клеток подвеска и инкубировать образцы на 4 ° C на 30 мин образцы защищать от света к минимуму обесцвечивания Флюорофор конъюгированных антител.
   1. В случае, если были использованы неконъюгированной первичных антител, выполните следующие действия после завершения Шаг 2.4.
   2. Основное антитело мыть окрашенные образцы центрифугированием в 751 x g 5 мин (4 ° C).
   3. Удалить супернатант сцеживать и вновь приостановить Пелле в 100 мкл буфера СУИМ.
   4. Добавить все необходимые образцы конъюгированных вторичные антитела и Инкубируйте 30 мин при 4 ° C. Перейдите к шагу 2.5.
5. Следующие Антитело инкубации, добавить 2 мл, лед холодной СУИМ буфера, а затем Пелле клетки в 751 x g 5 минут (4 ° C). Декант супернатант и будьте уверены, чтобы не мешать Пелле.
6. Осторожно перемешать клетки вновь приостановить с 200-400 мкл буфера СУИМ, а затем сохранить это в темноте при температуре 4 ° C до стандартного потока cytometry анализ или сортировки клеток.
7. За короткий срок фиксации окрашенных клеток переходите к 2.8 шаги до 2,10. Для стандартных проточной цитометрии только используйте фиксацию.
8. Сразу же после шаг 2.5, вновь приостановить клетки в 0,5 мл 2-4% параформальдегида (PFA) для 15-30 мин в 4 ° C.
   Примечание: Осторожно: PFA является известный раздражителем с токсичных и канцерогенных эффектов. При использовании PFA, обращаться с крайней осторожностью. Убедитесь в том использовать надлежащие средства личной защиты и вытяжной вентиляции.
9. После записи, вымыть клетки путем добавления 2 мл СУИМ буфера для всех образцов и центрифуги на 751 x g в 4 ° C за 5 минут удалить супернатант следующие центрифугирования.
10. Ресуспензируйте фиксированные клетки в 200 мкл лед холодной СУИМ буфера и хранить при 4 ° C. Магазин исправить клеток до 1 недели при температуре 4 ° C, идеально выполняют потока цитометрии приобретения в течение 48 часов, чтобы свести к минимуму аутофлюоресценция.
11. Приобретать цитометрии потока данных согласно инструкции производителя потока цитометр или выполнение сортировки флуоресцентные активированных клеток, как описано на басу и др. ²³

Результаты

При использовании аполипопротеин E недостаточным (ароЕ KO) C57BL/6 (BL6) мышей поддерживается на высоких жиров высокий холестерин диета (HCHFD или HCD) для 18 недель, 1 x 10-⁴ - 2 х 10⁴ CD45 F4/80^{+ +}аорты макрофаги могут быть изолированы, когда две пробы в пуле. Печень, ра?...

Обсуждение

Чтобы лучше понять глубинные механизмы прогрессирования заболевания широко используются модели диета индуцированной метаболические расстройства, которые имитируют сопутствующие заболевания, таких как атеросклероз, простой стеатоз, стеатогепатитом и диабета типа 2. Коллагеназы зав?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G x 5/8 in Needles	BD	305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set	BD	367297	Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles	BD	305156
1 mL syringe with rubber stops	BD	309659
10 mL Syringes	BD	309604
1 mL Syringe	BD	309659
F4/80 PE	Biolegend	123110
CD11c PE/Cy7	Biolegend	117318
CD11b PE/Cy5	eBioscience	15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block	Biolegend	101320
CD45 Pacific Blue	Biolegend	103126
PE Rat IgG2a	Biolegend	400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG	Biolegend	400922
PE/Cy5 Rat IgG2b	Biolegend	400610
Pacific Blue Rat IgG2c	Biolegend	400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Cellgro	21-031-CV
70 μm cell strainers	Corning, Inc.	352350
1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x	Electron Microscopy Sciences	CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp	Stoelting	52132-10P	Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm	Stoelting	52102-37P	Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge	Fine Science Tool	15000-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps	Fine Science Tool	11297-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved)	Fine Science Tool	13021-12
Heparin Sodium Salt	Fischer Scientific	9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes	Fischer Scientific	12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid	Fischer Scientific	08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes	Fischer Scientific	14-959-5
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)	Millipore	EX0285-1
Bovine Serum Albumin	Rockland	BSA-50
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Collagenasse Type XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase Type I	Sigma-Aldrich	H3506
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich	C0130
NaOH	Sigma Aldrich	1310-73-2
CaCl2	Sigma Aldrich	449709-10G
500 mL beaker	Sigma Aldrich	02-540M
4 cm Hemostatic clamp	Stoelting	52120-40
Toothed forceps	Stoelting	52104-33P
50 μm Disposable filters	Systemex	04-0042-2317
Collagenase Type IV	ThermoFischer Scientific	17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK)	ThermoFischer Scientific	A1049201
Razors (0.22 mm (0.009"))	VWR International	55411-050
Texas Red Live/Dead stain			Red viability stain (in Figure 1A)