JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.

Abstract

השמנת יתר מקדמת מדינה דלקתית כרונית בעיקר מתווך על ידי רקמת תושב מקרופאגים, כמו גם נגזר מונוציט מקרופאגים. דיאטה-induced השמנת יתר (דיו) הוא מודל ערך לומד את התפקיד של הטרוגניות מקרופאג; עם זאת, ומשום מקרופאג נאותה קשים לרכוש רקמות מודלק. ב פרוטוקול זה, אנו מכינים את הצעדים בידוד ואת ההנחיות הדרושות לפתרון בעיות נגזר מן המחקרים שלנו להשגת אוכלוסייה מתאימים של מקרופאגים רקמות תושב של עכברים לאחר 18 שבועות עתירת שומן (HFD) או שומן/תיכון-כולסטרול ( התערבות תזונה HFHCD). פרוטוקול זה מתמקד שלוש רקמות הולמרק למד ב השמנת יתר, טרשת עורקים, כולל הכבד, רקמות adipose לבן (וואט) של העורקים. אנחנו להדגיש השימוש איך דואלית של זרימה cytometry ניתן להשיג מימד חדש של בידוד ואפיון של רקמות תושב מקרופאגים. מקטע יסוד של פרוטוקול זה מטפל המורכבות הבסיסית digestions אנזימטי רקמות ספציפיות מקרופאג בידוד, ואת הבאים נוגדן תא-פני מכתים לניתוח cytometric זרימה. פרוטוקול זה מטפל המורכבות הקיימת בבסיס תא לפעיל על-פלורסנט מיון (FACS) ומציגה הבהרות על המורכבות כדי להשיג אפיון במגוון רחב של אוכלוסיות תאים ממוינים כראוי. שיטות חלופיות העשרה הינם כלולים למיון תאים, כגון הכבד צפופה, ומאפשר גמישות וניהול זמן בעת עבודה עם FACS. בקצרה, פרוטוקול זה מסייע החוקר להעריך מקרופאג הטרוגניות של שפע של רקמות מודלק במחקר נתון, ומספק עצות לפתרון בעיות תובנה כי כבר מוצלח עבור בידוד תאית חיובית ואפיון של תאים חיסוניים בדלקת בתיווך דיו.

Introduction

העכבר מודלים היו בשימוש נרחב ללמוד את הדינמיקה של מחלות אנושיות. בידוד תקין של רקמות תאים תושב עכברים בתוך מדינה חולה יכול לספק פלטפורמה להבנת מולקולרית, תאית התרומות בפתוגנזה של המחלה1. הפרעה אחת זה חשיבות קריטית היא השמנת יתר. שכיחות ההשמנה ממשיכה לעלות בכל העולם במקביל לאינסולין סוג 2 סוכרת מחלות לב וכלי דם, מחלת כבד שומני2,3. צריכת מזון נוסף מוטה על ידי ירידה פעילות גופנית מפעילה שינו אותות שמקורם רקמת שומן, אשר יכול לשנות את חצרו הסלולר של רקמות היקפיים אחרים כגון אב העורקים ואת הכבד4. כזה שיבוש הומאוסטזיס המטבולית גורמת לדלקת מערכתית כרונית נמוך בכיתה5.

הפעלה קלאסית של מקרופאגים תושב העורקים ואת הכבד, כמו גם את הגיוס שומן לבן (וואט) הוכח ליזום dysregulation של אותות מטבולי אלא גם לקיים דלקת6,7. הטרוגניות פנוטיפי ופונקציונליים של מקרופאגים קשורה חזק בפתוגנזה של השמנת יתר הקשורים לעבודה morbidities7. הפלסטיות דינמי ב מקרופאג קיטוב מאפשר תאים אלה שהפגינו מגוון פנוטיפים מופעל זה לתאם את התקדמות והרזולוציה של דלקת8. בעוד בסגנון קלאסי מופעל מקרופאגים (M1) הם מעורבים על התפשטות של דלקת, לחלופין מופעל מקרופאגים (M2) קושרו עם רזולוציה ורקמות תיקון9,10.

כפי הגוף עובר מתח מטבולית, שומן לבן מצטבר באופן חריג. רקמת שומן המורחב מושך, שומר על תאים דלקתיים שמשנות עמוקות adipocyte רגילה פונקציה כדי לקדם את תנגודת לאינסולין, היפרגליקמיה, בסופו של דבר סוכרת סוג 2, תנגודת לאינסולין או היפרגליקמיה11, 12. במקביל, remodels שומן לבן בתגובה אותות דלקתיים שפורסמו על ידי הסתננו מופעל באופן קלאסי (M1) רקמת שומן מקרופאגים (כספומטים)13,14. איבר זה רב תאית מפעילה מפל של אותות זה תוקע את התיפקוד הרגיל של איברים אחרים בגוף כגון אבי העורקים, כבד4.

הכבד הוא עוצמתי מטבולית המסתגל בתגובה לגירויים שמקורם dysregulated הסמוך וואט15. מקרופאגים כבדית או תאים Kupffer, כתגובה לשינויים מטבוליים, מפרישים ציטוקינים דלקתיים שהופכים שניהם parenchymal ו תא הלא-parenchymal פנוטיפ ולקדם רקמות. הצטברות שומנים בדם הכבד, דלקת, פיקדונות מופרז מטריצה חוץ-תאית, נמק, הפונקציה בסופו של דבר אובדן כדלקמן העלבונות דלקתיות לתרום ספקטרום רחב של פגיעה בכבד הקשורים אלכוהוליים מחלת כבד שומני 1617,,18.

במקביל וואט פרוץ, תפקודי כבד, עורקים גדולים לצבור שומנים בתוך קיר עורקים כפי הגוף עובר מתח מטבולית כרונית19. הצטברות שומנים בדם עורקי מפעיל את הפרשת נוגדנים על ידי תאי אנדותל מופעל והגיוס עוקבות של monocytes20. ברגע גייס, ומונוציטים להתרבות, להבדיל, להבלע lipoproteins, להפוך לתאי קצף. Atherogenesis יזם, נגרם על ידי פעילות הפרו דלקתיים גייס ו רקמות לאדן השומנים תושב מקרופאגים. להיכנע האותות חוץ-תאית, תאיים סטרס נמסר ב- microenvironment atherogenic הזה, מקרופאגים האלה ואז לעסוק מוות איתות בהתאם להיררכית הקשרים. כאשר תאים אלה קצף מתים, הם תורמים את תוכנם השומנים מלא אל ליבה נמק של הנגע, מה שמוביל ואז קרע פלאק, אוטם שריר הלב ושבץ.

באופן קולקטיבי, הטרוגניות של פנוטיפים מקרופאג האחראית בחלקו השמנת יתר הנגרמת על ידי שינויים דלקתיים שנצפתה dysregulated רקמות כגון וואט, הכבד, אבי העורקים8,21. אפיון גייס, מקרופאגים תושב רקמות יכול לספק תובנות פוטנציאליים מטרות מולקולריות שמטפלות מקרופאג פנוטיפ1. לאפיין ביעילות מקרופאגים רקמות מודלק השמנת יתר-induced, ניתן לקבל השעיה תא בודד באמצעות עיכול אנזימטי. פרוטוקולים דיסוציאציה כזה חייב להיות יעיל דיו משפילים רקמת חיבור תוך מזעור מוות של תאים חיסוניים, מתן תשואה אופטימלית בתא. התערובת אנזים הוא תלוי בסוג הרקמה איפור המבני שלה. רקמות גמיש כמו אבי העורקים דורש פעילות אנזימטי חזק יותר, לעומת הכבד ו וואט, כדי להשיג רקמה דיסוציאציה. מן התליה תא בודד, מקרופאגים תושב רקמות ניתן חד משמעית מאופיין או מבודדים עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים כגון יצירת פרופיל תעתיק.

כאן פרוטוקול רקמות ספציפיות מתואר המשתמשת תלויי-collagenase רקמות לעיכול, cytometry זרימה צבעוני לבודד ביעילות לאפיין את רקמת תושב מקרופאגים המתקבל השמנה דיאטה מסורתי המושרה, טרשת עורקים, פשוט steatosis ומודלים steatohepatitis העכבר. סימולטני מכתים של סמני פני שטח התא עם נוגדנים נגד ליקוציט-(CD45 או CD11b) וגם מקרופאג - אנטיגנים ספציפיים (F4/80) משמשת לעתים קרובות כדי לזהות אוכלוסיות מקרופאג22. תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) היא אסטרטגיה רב עוצמה המשמש למיון אוכלוסיות אלה שזוהו על טוהר גבוהה. אז ניתן להעריך האוכלוסייה ממוינים לפרופילי גנים ספציפיים פנוטיפ באמצעות אנליזה מולקולרית במורד הזרם (כגון תגובת שרשרת של פולימראז בזמן אמת כמותית)23. למרות cytometry זרימה רגילה ומיון תא מבוססי cytometry זרימה כלים רבי-עוצמה בהבחנה מקרופאגים בתוך השעיה תא הטרוגנית מאוד, הפרוטוקולים לשעבר חייב להיות מוטבת כדי להבטיח פלט מוצלחת. במחקר זה, פרוטוקולים של ביעילות לבודד, לאפיין את רקמת קיימא מקרופאגים ספציפיים מתוארים; חשוב יותר, מחקר זה מספק תובנה מכריע בנושאים טכניים הנובעים לעתים קרובות, כמו גם אסטרטגיות פרואקטיבית וגישה לפתרון בעיות כדי למנוע ו/או לפתור אותן.

Protocol

כל הפרוטוקולים ניסיוני (סעיפים 1, 1.2, 1.3) אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת פנסילבניה.

רקמהדיסוציאציה מאגרי הכנהנפח סופיאחסון
שומן לבן (וואט) מאגר דיסוציאציה: 2.5% HEPES, 10 מ"ג/מ"ל אלבומין שור (BSA), 3 מ"ג/מ"ל (0.3%) Collagenase מסוג II של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM) עם 4.5 g/L גלוקוז ללא פירובט-גלוטמין ו נתרן500 ממינוס 80° C (10 מ ל aliquots)
הכבד 25 x זלוף מאגר להתרכז (ות ת): 3.55 M NaCl, 168 מ"מ אשלגן כלורי, 240 מ"מ HEPES, 150 מ"מ NaOH באופן מזוקק יונים H2O500 ממינוס 20° C (40 מ ל aliquots)
שימור מאגר (PRB): BSA 1% 1 x מאגר זלוף1 ליטר4 ° C
מאגר דיסוציאציה: 1 x זלוף מאגר בתוספת מ מ 4.76 CaCl2 ו- 72 IV סוג Collagenase U/mL50 מ ל (לכל עכבר)להכין מיד לפני השימוש
אבי העורקים מאגר דיסוציאציה: 125 U/mL Collagenase סוג XI, Hyaluronidase U/mL 60 סוג אני, 60 DNase U/mL, 450 U/mL Collagenase מסוג I, 20 מ מ HEPES 1 x פוספט תמיסת מלח Buffered (PBS)500 ממינוס 80° C (10 מ ל aliquots)

טבלה 1: רקמות ספציפיות זלוף מאגר מתכונים.

1. רקמות בידוד, דיסוציאציה

  1. בידוד וואט, דיסוציאציה
    1. להכין את מאגרי רקמות ספציפיות לפי טבלה 1, לאחסן אותן כמתואר.
    2. הכינו את ריאגנטים הבאים.
      1. הכן המאגר לעיכול על ידי מפשיר נפח מתאים של וואט דיסוציאציה מאגר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. מיד לפני השימוש, לחמם את המאגר ל- 37 מעלות צלזיוס. להכין מאגר FACS על-ידי הכנת 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) המכיל 2% סרום שור עוברית (FBS).
    3. בידוד וואט
      1. המתת חסד תא העכבר פחמן דו-חמצני (CO2) מלא. בדוק את האפקטיביות לפני שתמשיך לשלב ניתוח.
      2. טובלים את העכבר לאללה בקצרה בתוך המכיל אתנול 70% עד ביסודיות ספוג מצופה עם אתנול. המקום (גחוני) העכבר על הבמה לנתיחה והדקו את העכבר הפורה ואת כפות הרגליים האחוריות אל לוח חיתוך באמצעות מחטים 21 G.
      3. השתמש בינוני נקודת קצה מלקחיים להבין בעור בטן והשתרשה עמוק בלבה פתח השופכה, ואז להשתמש במספריים חדים ויבתר לעשות חתך בעור בטן grasped.
      4. להכניס את הלהב התחתון של המספריים חתך קטן בין העור לבין הצפק, עושים חתך לרוחב מהבטן אל כלוב הצלעות.
      5. משוך בעדינות בחזרה את העור כדי לחשוף את חלל הצפק שלם לרוחב חתך דרך של הצפק, גם לקפל חזרה קרום שקוף או לסלק את הרקמה כדי לחשוף הוואט בטן.
      6. לאסוף את הידיות perigonadal fat כפי שמתואר מאן. et al. 24
        1. הידיות perigonadal fat בעכברים זכרים מאוגדים באופן רופף יותרת האשך ואת האשכים. תחילה לאתר את האשכים, ואז בינונית הצבע מלקחיים, להחזיק ראש יותרת האשך ומשוך בעדינות.
        2. באמצעות מספריים ויבתר חדות, לסלק כל משטח שמן epididymal על ידי גזירה לאורך פני השטח של יותרת האשך (ראש, גוף וזנב) ואת האשכים.
        3. עם המלקחיים, משוך בעדינות על משטח השמן בזמן חיתוך דרך רקמת חיבור ישירות קשורות למבנה יותרת האשך.
        4. עם המלקחיים, לאחוז בחוזקה בסוף מקורב אל האשך fat pad ולהתקלף בעדינות כרית השומן מן הגונדות
        5. בעכברים הנשי, הידיות perigonadal fat הן באופן רופף בונד גוף הרחם, הרחם הורן.
        6. בעזרת מלקחיים נקודת בינוני, אחיזה רקמת השומן perigonadal ומשוך בעדינות את הרקמה הרחק גוף הרחם ואת הרחם קרן.
        7. לסלק כל כרית השומן על ידי גזירה לאורך גוף הרחם, הרחם קרן באמצעות מספריים ויבתר חדות.
      7. מקם את השומן רפידות בצלחת פטרי-מלא עם PBS ולשמור על קרח כדי לשמור על לחות לרקמות.
    4. דיסוציאציה של וואט לתוך תא בודד השעיות
      1. להסיר את עודף PBS הפטרי ולהשתמש תער קצוות יחיד מינצ הוואט בטן לחתיכות קטנות.
      2. עם חוד הסכין גילוח, לגרד בעדינות הוואט בטן טחון לתוך צינור פוליפרופילן אוסף תוויות 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל וואט דיסוציאציה מאגר.
      3. דגירה תערובת מאגר זו רקמה-עיכול תחת סיבוב איטי רציפה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
      4. לסנן את הרקמה מתעכל דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור אוסף 50 מ ל בעת הזזת את הבוכנה מגומי של פומפה מזרק בתנועה סיבובית ולהמשיך ניפוי התליה תא דרך המסנן.
      5. Pipet 2 מ של Dulbecco של המדיום נשר שונה (DMEM) כדי צינור אוסף 15 מ"ל, בעדינות pipet למעלה ולמטה ולשטוף את המסנן עם התליה תא בודד.
      6. רוחצים את המסנן שתי שעות נוספות עם DMEM קרים ומניחים התליה תא בודד על קרח.
      7. Centrifuge התליה תא ב g x 300 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
      8. להשתמש ליניקת אבק בזהירות להסיר את adipocytes צף (קודם), הנותרים supernatant. ודא שלא להפריע השבר בכלי הדם סטרומה pelleted (SVF).
      9. עם פיפטה 1,000 µL, בעדינות מחדש להשעות את צניפה במאגר אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) כדי lyse אריתרוציטים בהתאם להוראות היצרן.
      10. לדלל התליה תא לעיל עם DMEM, centrifuge התליה תא ב 300 גרם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 8 דקות.
      11. מחדש להשעות את התאים ב- PBS קר המכיל 2% FBS (FACS מאגר) ולספור התאים קאמרית/hemocytometer Burker.
      12. העברה או עונה 1 פרק 106 תאים (עבור cytometry זרימה בסיסי) או ההשעיה התא כולו (עבור FACS) כדי הנקרא מ ל צינורות פוליסטירן סיבוב המדרגה. המשך סעיף 2 עבור cytometry זרימה מכתים פרוטוקול.
  2. בידוד רקמת הכבד, דיסוציאציה
    הערה: פרוטוקול זה הותאם Smedsrød25.
    1. להכין את מאגרי רקמות ספציפיות לפי טבלה 1 ולאחסן אותן כמתואר.
    2. הכינו את ריאגנטים הבאים.
      1. להכין 1 x זלוף-מאגר (PB), על ידי המדללת 40 מ ל נכסים ובנין לתוך 960 מ ל הנדסה גנטית H2O. חם מראש של מזרק מלא 50 מ של PB ב 37 מעלות צלזיוס, בדיוק לפני זלוף מתחיל. לחסל את כל בועות האוויר הנוכחי.
        1. לחסל בועות אוויר, היפוך המזרק איפה קצה נעל ופסאר מצביע כלפי מעלה. הקש או לסתור את המזרק עד בועות אוויר הן pf בראש המזרק. דחף בעדינות על הבוכנה לגרש את האוויר
      2. להכין המאגר לעיכול על ידי דילול 0.5 מ"ל של 476 מ פתרון2 CaCl49.5 מ ל 1 x מאגר זלוף. להוסיף 3600U של Collagenase הסוג הרביעי מ מ 4.76 CaCl2 – פתרון PB. לחמם מזרק מלא 50 מ של עיכול מאגר ב 37 מעלות צלזיוס לפני זלוף מתחיל. לחסל את כל בועות האוויר הנוכחי כפי שמתואר בשלב 1.2.2.1.1.
      3. להכין שימור מאגר (PRB) על ידי המסת 2.5 g אלבומין שור (BSA) במאגר זלוף 1 x 250 מ. ב 4 ° C או לשמור על הקרח עד השימוש.
      4. להכין מאגר FACS עם FBS PBS ו- 2% 1 x.
    3. רקמת הכבד בידוד
      1. המתת חסד עכבר בעזרת2 CO, להרוות את העכבר עם 70% אתנול למניעת זיהום של האיברים intraabdominal עם פרווה.
      2. מיקום העכבר הגחון בצד של למעלה פוליסטירן מוקצף לנתח לוח ולאבטח העכבר פור, האחוריות הכפות ללוח לנתיחה באמצעות מחטים 21 G.
      3. כדי לחשוף את קיר בית החזה ואת חלל הצפק, לאחוז בעור בטן ליד הפתח השופכה באמצעות מלקחיים עצה של נקודת בינוני. מספריים חדות ויבתר להשתמש כדי ליצור חתך קטן על העור בטן grasped.
      4. להכניס את הלהב התחתון של המספריים חתך קטן בין העור לבין הצפק, עושים חתך לרוחב מהארבה עד הסנטר.
      5. משוך בעדינות בחזרה את העור כדי לחשוף את חלל הצפק ללא פגע בקיר בית החזה, עושים חתך לרוחב דרך הצפק, לסלק את הקרום.
      6. הרם את החזה היטב תחתכי את הסרעפת, להיות בטוח שלא להפריע הכלילי התחתון (IVC). להעביר את האיברים במערכת העיכול לצד ואתר של IVC subhepatic. להשתמש מלקחיים hemostatic כדי לצבוט את suprahepatic IVC לשמור זלוף לשפות אחרות.
        הערה: הצטברות יתר של רקמת שומן לבנים הקרביים לעיתים קרובות מטשטשים את IVC. כדאי להמחיש את כלי השיט הזה, אפשר להוציא שטח קטן של רקמת שומן לצד IVC. החלון חרות בתוך רקמת השומן גמיש יכול ואז למקם מעל IVC לחשוף את כלי הקיבול. של תעלות.
      7. לצרף את המזרק מלא מראש ומחוממת PB לסט 23 גרם דם אוסף, אינפוזיה. דחף בעדינות על הבוכנה עד צינורות ואת המחט מלאים PB.
      8. הכנס את המחט 23 גרם, מקביל לרמה של IVC subhepatic. אבטח את המחט במקום באמצעות מלחציים hemostatic 4 ס מ.
        הערה: תעלות של subhepatic ש-IVC מועדף בעכברים דיאטה-fed בכך IVC יכול להיות טוב יותר, דמיינו, לצינוריות בתוך החלל מלא שומן.
      9. דחף בעדינות על הבוכנה כדי להתחיל זלוף, צבע יתאפס במהירות מן הכבד (נכון האונה קודם) אם המחט ממוקם כראוי בתוך הכלי. הגדלה של האונות מוצגת גם אם המחט הוכנס כהלכה לתוך IVC subhepatic.
      10. מיד לחתוך וריד שער הכבד כדי לאפשר את PB לזרום בחופשיות דרך הכבד.
      11. Perfuse הכבד עד דם אינה גלויה. לעסות בעדינות מדי פעם אונות הכבד בין קידמה-האצבע והאגודל להקל זלוף.
        הערה: חשוב להשתמש שאינם משונן בכלים להב קהה כדי להתמודד עם הכבד כדי למנוע נזק לרקמות.
      12. כאשר 5 מ ל חמאת בוטנים נותר בתוך המזרק, לשנות המזרק מלא עם מאגר דיסוציאציה ומחוממת מראש. נא לא להפריע את המיקום של המחט מאובטח במהלך תקופה זו.
        הערה: להגדיל כבדי באופן משמעותי העולה על 1.5 g צריך להיות perfused עם נפח גדול יותר של מאגר עיכול ומחוממת מראש כדי להבטיח דיסוציאציה הכבד מוצלחת.
      13. Perfuse הכבד עד מלא מתעכל. לעסות בעדינות אונות הכבד כדי להקל על זלוף.
        הערה: פרידה של הקפסולה של גליסון parenchyma היא נצפות בכבד בהצלחה מעוכל. כדי להעריך את זה, משתמש הקצה הקהה של זוג מלקחיים, ללחוץ בעדינות על האונה השמאלית לרוחב. רושם אמור להופיע על פני השטח ולמלא כניסת צריכים באיטיות ברגע המלקחיים מוסר.
      14. הסר את המחט IVC subhepatic. אל תסיר את המלקחיים hemostatic מחבר חובק למעקה suprahepatic של IVC.
      15. לסלק את כל הכבד על ידי חיתוך בזהירות דרך חיבור הרצועות באמצעות להב ישר קצר לנתח מספריים ולהסיר את כיס המרה.
      16. למקם את הכבד כל ס מ 10-פטרי המכיל 10 מ"ל כקרח שימור מאגר וחנות ב 4 оC עד מוכן לשחרר תאים.
    4. תאי הכבד דיסוציאציה
      1. להעביר את הכבד צלחת 10 ס מ המכיל 10 מ"ל DMEM קר כקרח.
      2. לאחוז את suprahepatic קטועה ש-IVC מצורף אל הכבד נכרת באמצעות מלקחיים במיתולגיות. השתמש בנקודה בינונית מלקחיים כדי לשחרר את התאים כמוסה של גליסון על-ידי החלת הביציות מהירה בכל האונה.
      3. עוברים את DMEM רוויות דרך מסננת תא מיקרומטר 70 מחובר צינור אוסף 50 מ.
      4. Pipet קר כקרח 10 מ"ל DMEM פטרי 10 ס מ, חזור על שלבים 1.2.4.1 עד 1.2.4.3 עד רוויה מדיה נצפית כבר לא. המקום התליה תא על קרח או ב- 4 מעלות צלזיוס.
      5. בעדינות לערבב התליה תא על-ידי היפוך הצינור אוסף, ואז צנטריפוגה ב g x 54 למשך 2 דקות ב 4 º C.
      6. לאסוף את תגובת שיקוע בשפופרת איסוף נקי 50 מ. ואז centrifuge התליה תא ב g x 54 למשך 2 דקות ב 4 º C.
      7. חזור על שלב 1.2.4.6 פעמיים נוספות לפני שתמשיך לשלב 1.2.4.8.
      8. להעביר את תגובת שיקוע צינור נקי 50 מ"ל-אוסף של centrifuge התליה תא ב 300 גרם x 10 דקות ב 4 º C.
      9. מחדש להשעות בגדר תא הלא-parenchymal במאגר FACS, לספור אותם ב קאמרית/hemocytometer Burker.
      10. להעביר עונה 1 פרק 106 תאים (עבור cytometry זרימה בסיסי) או 15 x 106 - 20 x 106 תאים (FACS) הנקרא 5-mL למטה לסיבוב צינורות פוליסטירן. המשך סעיף 2 עבור cytometry זרימה מכתים פרוטוקול.
  3. אבי העורקים בידוד, דיסוציאציה
    הערה: פרוטוקול זה היה ממאמרו של הקצבet al.26
    1. להכין את מאגרי רקמות ספציפיות בהתבסס על המתכונים הניתנים טבלה 1 ולאחסן אותן כמתואר.
    2. הכינו את ריאגנטים הבאים.
      1. הכן המאגר לעיכול על ידי מפשיר נפח מתאים של וואט דיסוציאציה מאגר וחנות ב 4 ° C עד השימוש. מיד לפני השימוש, לחמם את המאגר ל- 37 מעלות צלזיוס.
      2. להכין פתרון הפארין 10 x על ידי המסת הפארין נתרן מלח 1 x PBS ב ריכוז של 200 U/mL. לדלל את 10 x הפארין פתרון מניות עם 1 x PBS להכין 1 x פתרון הפארין. חנות ה-x 10 ו- 1 x הפארין פתרונות ב 4 ° C עד השימוש.
      3. הכנת המאגר FACS עם PBS 1 x המכיל 2% FBS.
    3. דיסקציה של אבי העורקים
      1. המתת חסד עכבר קאמרית פחמן דו-חמצני מלא ולאחר שטיפה עם 70% אתנול.
      2. המקום הצד הבטני העכבר על הבמה לנתיחה, התפשטה העכבר הפורה על כפות הרגליים האחוריות, להדק אותם ללוח לנתיחה באמצעות מחטים 21 G.
      3. מיד לאחר המתות חסד העכבר, לבצע ניקוב הלב. עיין צעדים 1.3.3.4 כדי 1.3.3.9, אם יש צורך בכך.
      4. לאתר הסרעפת בקצה התחתון של עצם החזה
      5. לשם כך, מקם את נקודת אמצע האצבע לרוחב הצוואר של החיה. מעקב לאורך הקו האמצעי הגחון מהצוואר עד הסוף סימטרית של עצם החזה עד סיומת הסחוס מורגשת.
      6. להשתמש מלקחיים נקודת בינוני לתפוס את הסיומת הסחוס, אם יש צורך לסמן את המיקום של הסרעפת על-ידי הסרת התיקון של שיער או עור באזור.
      7. חלקית הכנס מחט 26 גרם תחת הסרעפת בזווית של 20-30 מעלות.
      8. בעדינות להחיל לחץ שלילי על המזרק על ידי לאט נסיגה הבוכנה, ולאחר מכן להוסיף עוד יותר את המחט לתוך החלל עד זורם דם.
      9. אם זרימת הדם נפסק, לאט לסובב את המחט או להזיז מעט פנימה והחוצה
      10. השתמש זוג מלקחיים לתפוס החזק של עור בטן והשתרשה עמוק בלבה השופכה פתיחה של השימוש זוג מספריים ויבתר חדה לחתוך לאורך הקו האמצעי הגחון דרך הצפק מהארבה עד הסנטר.
      11. להפשיל את העור כדי לחשוף אברי הבטן ואת הצלעות עם האצבעות או מלקחיים בוטה בעדינות העבר אברי הבטן בצד.
      12. שימוש המלקחיים לתפוס החזק של הסרעפת, הרם את החזה, תחתכי את הסרעפת.
      13. בעזרת המספריים ויבתר, לחתוך לרוחב הצלעות משני הצדדים. כשתפסת עצם החזה, הפוך את כלוב הצלעות כלפי מעלה, לחתוך הבסיס מחברים. הסר את הצלעות חשיפת האברים בית החזה המשמש כבסיס.
      14. Perfuse העורקים עם מחט 26-מד המצורפת 10 מ"ל-מזרק מלא 1 x הפארין פתרון על ידי הזרקת 1-2 מ של פתרון לתוך החדר השמאלי (LV) של הלב.
        הערה: הקפד perfuse בקצב איטי עם לחץ כדי להבטיח שלמות התרדמה אבי העורקים.
      15. בלו התימוס, בריאות, רקמת חיבור. עיין שלבים 1.3.3.16 ו- 1.3.3.17, במידת הצורך.
        1. והשתרשה עמוק בלבה בלב אתר את הלבן bi אונות (או בצורת פרפר) עוגב ו בחוזקה. להחזיק של בלוטת התימוס עם המלקחיים. . שתי אונות כלפי מעלה לעזוב החלל וחותכים בבסיס עם המספריים.
        2. כדי להסיר את הריאות, קמצוץ של האונה ריאות עם המלקחיים, משוך את הרקמה הרחק בחלל בית-החזה ו חתך בבסיס. חזור על כל באונה נותרת.
      16. השתמש מיקרוסקופ לנתיחה לנתח מיקרו כלים ו לאסוף שאבי העורקים קשת (כולל העורק innominate, עורק תרדמני שמאל בעורק בריחי השמאלי), את עולה, יורד, אבי העורקים החזי ועל הבטן.
        1. אתר של אבי העורקים על החדר השמאלי של הלב.
        2. עם זוג 0.07 מעוקל x מ מ 0.04-טיפ מלקחיים לאחוז בעדינות את החלק של העורקים העולה מן החדר השמאלי.
          הערה: בהשוואה שמסביב ומילא את-צהוב רקמת השומן, אבי העורקים יהיה כלי לבן בהיר שמקורם LV בעת ריקון מספיק עם הפתרון הפארין.
          1. אם אבי העורקים לא הסמיקו כראוי על ידי הלב זלוף, ריקון העורקים שוב בעוד העורקים נשאר מחובר החלל. כדי לעשות זאת, לחתוך ליד צומת לב-העורקים להסיר את הלב, ואז לחתוך אופקית דרך הקצה התחתון של העורק. להכניס מחט 26 גרם הפתיחה של העורקים ותוציאו בעדינות את העורקים עם ה 1 x פתרון הפארין.
          2. בעדינות תבצע אבי העורקים יותר להפלות בין רקמת השומן לבין אבי העורקים מוטבעים.
          3. מושך עדיין בעדינות על העורקים, השתמש קצה סגור באביב לנתח מספריים כדי לנקות את השומן הכומסים את אבי העורקים עולה ואת קשת אבי העורקים. כדי לעשות זאת, קו רקמת השומן עם קצה להבי מספריים סגור כדי לנתק את השומן המחבר.
            הערה: להימנע excising כל רקמת שומן על ידי חיתוך עד אבי העורקים עולה ואת קשת ניתן בבירור לאבחן. זה כדי למנוע חיתוך אבי העורקים.
          4. אם אבי העורקים עולה ואת קשת יכול בבירור מאפשרת של רקמת השומן סראונד, השתמש המעיין לנתח מספריים לסלק עודף שומן.
          5. בעדינות. תפוס את קשת אבי העורקים עם המלקחיים. שוב באמצעות המספריים האביב של העצה, משיכה השומן לאורכו של העורקים יורד, בטן, מותניים עד הסוף סימטרית של אבי העורקים בבטן, עושה זאת על הצד הימני של השרוול של שומן.
          6. ממשיכים להיאחז לאורך העורקים כאשר קורעים משם את השומן. הקפד לעשות בעדינות כדי למנוע פגיעה אבי העורקים.
          7. משוך בעדינות את העורקים כלפי מעלה לכיוון המיקרוסקופ כך השומן ממוקם כעת מאחורי אבי העורקים.
          8. הכנס להבי מספריים סגור בין הממשק שומן-האאורטה ליד הקצה הקדמי של העורקים, חמור המצורף של רקמת השומן אל השטח של אבי העורקים באמצעות תנועה גורף בלשון בוטה.
            הערה: הסרת שומן עודף וחיבור רקמות בעוד העורקים הוא עדיין בתוך החלל הוא מומלץ ביסודיות.
          9. לסלק את הלב וחותכים בקצה סימטרית של העורק הראשי באופן רוחבי. הסר את כל העורקים.
          10. למקם את העורקים בקערה 35 מ מ, להקניט משם כל עודף שומן על העורקים באמצעות שתי מחטים 21-מד. הצב העורקים נכרת בצינור microcentrifuge 1.7 mL על קרח.
    4. דיסוציאציה של אבי העורקים אל תא בודד השעיות
      1. Pipet 0.2 מ"ל העורקים דיסוציאציה מאגר אל הצינור המכיל אבי העורקים. הוסף את להבי מספריים האביב לקראת סוף הצינור מחודדות, במהירות מינצ העורקים כדי להקל על עיכול אנזימטי.
      2. להעביר את התערובת רקמות-פתרון 15 מ"ל אוסף שפופרת, פיפטה 1.8 mL העורקים דיסוציאציה מאגר עבור הנפח הכולל של 2 מ.
        הערה: להעברה קלה של המתלה רקמות, חותכים 1 ס מ מסוף מחודדות טיפ פיפטה 1,000 µL רגיל. שימוש בקצה מקוצר כדי להעביר את הבולם עם micropipette.
      3. דגירה העורקים טחון במאגר דיסוציאציה של אבי העורקים במשך 55 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, רועדת-220 סל"ד (0.514 x g).
      4. עוברים את המתלים 50-מיקרומטר תא מסננת לתוך צינור פוליפרופילן אוסף 15 מ"ל. השתמש את הבוכנה מגומי של פומפה מזרק כדי להקל על סינון.
      5. שטוף הצינורית אוסף 15 מ"ל עם מאגר 1 מ"ל FACS, לאסוף את המתלים ומעבירים דרך מסננת התא.
      6. לשטוף את מסננת תא 50 מיקרומטר שתי שעות נוספות עם מאגר FACS 1 מ"ל.
      7. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב g x 300 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להשעות מחדש תאים במאגר FACS קר. לספור התאים קאמרית/hemocytometer Burker.
      8. להעביר צינורות פוליסטירן סיבוב המדרגה שכותרתו מ ל 1 x 106 (עבור cytometry זרימה בסיסי) תאים או ההשעיה התא כולו (עבור FACS). המשך סעיף 2 עבור cytometry זרימה מכתים פרוטוקול.

2. flow Cytometry, FACS מכתים

FluorophoreR-Phycoerythrin (PE)PE/Cyanine (Cy) 7PE/Cyanine (Cy) 5פסיפיק בלו (PB)
לייזר (אן אם)כחול (488 ננומטר) / צהוב (561-570 ננומטר) - ירוק (532 ננומטר)כחול (488 ננומטר) / צהוב (561-570 ננומטר) - ירוק (532 ננומטר)כחול (488 ננומטר) / צהוב (561-570 ננומטר) - ירוק (532 ננומטר)ויולט (405 ננומטר)
עירורמקס (אן אם)496496496401
פליטהמקס (אן אם)578785667455
סמן פנוטיפיF4/80CD11cCD11bCD45
EMR1, Ly71אינטגרין αX, אינטגרין p150 שרשרת, CR4, αX, ITGAXΑM אינטגרין, Mac-1, Mo1, CR3, Ly-40, C3biR, ITGAMT200, Ly-5, LCA
סוג יישוב התאמקרופאגים תושב רקמותמקרופאגים מופעל באופן קלאסי (M1)ומונוציטים / מקרופאגיםלויקוציטים (מקרופאגים / ומונוציטים לימפוציטים, גרנולוציטים)
ערכה של תאים דנדריטיםתאים דנדריטים, תאי NK, תאי T מופעל, תת-קבוצה של לימפוציטים intraepithelial הנרתיק מעיים (אישור IEL)גרנולוציטים, תאים דנדריטים, תאי NK, קבוצות משנה של תאי T ו- B
גורם לדילול1:50בטחונותבטחונותבטחונות
Isotype שולטPE חולדה IgG2aאוגר ארמני PE/Cy7 אגPE/Cy5 חולדה IgG2bעכבר כחול פסיפיק IgG2c

טבלה 2: רשימת fluorophore מתויג נוגדנים ספציפיים עבור מקרופאגים תושב מפלה של רקמות.

  1. לאסוף ולהכין את הפריטים הבאים: FACS מאגר 5 מ"ל סיבוב המדרגה פוליסטירן צינורות, העכבר אנטי Fc CD16/32 קולטן חסימת נוגדן, fluorophore מצומדת או unconjugated נוגדנים העיקרי, fluorophore מצומדת נוגדנים משניים (אם 1 הצורך), x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
    הערה: עבור צביעת כמויות גדולות של תאים, ריכוז נוגדן הוא הקריטי ביותר במקום מספר הטלפון הנייד. לדוגמה, אם 10 x 10 מכתימים6 תאים האחסון מאגר מוכתמים, ריכוז נוגדן צריכה להיות זהה כאילו מכתים 1.0 x 106 תאים בכרך מאגר 100 µL. עבור צביעת 1.0 x 10 מומלץ8 תאים, הגדלת כמות נוגדנים 5 פי.
  2. להוסיף המאגר הנוסף FACS כקרח כל שפופרת FACS במידת הצורך, גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב g 751 x במשך 5 דקות (4 ° C). וארוקן את צנטריפוגה הבאים supernatant.
  3. הוסף העכבר אנטי Fc CD16/CD32 קולטן חסימת נוגדן ל כל הדגימות בהתאם להוראות היצרן. תקופת דגירה של 15 דקות ב 4 ° C או על קרח.
  4. הוסף fluorophore מצומדת קוקטייל ישירות לקולטן Fc המכיל נוגדנים חסימה תא ההשעיה, דגירה העיקרי נוגדן דוגמאות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הגן על דגימות אור כדי למזער את הלבנה של נוגדנים fluorophore מצומדת.
    1. במקרה unconjugated נוגדנים העיקרי שימשו, בצע את הפעולות הבאות מיד לאחר השלמת שלב 2.4.
    2. שטיפת נוגדן ראשוני מוכתמת דגימות צנטריפוגה-751 g x עבור 5 דקות (4 ° C).
    3. להסיר את תגובת שיקוע על ידי decanting והשהה מחדש צניפה במאגר FACS 100 µL.
    4. להוסיף נוגדנים משניים מצומדת כל דוגמאות הכרחי, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. המשך לשלב 2.5.
  5. הדגירה נוגדן הבאים, להוסיף 2 מ של מאגר FACS קר קרח מכן הצניפה תאים ב 751 x g במשך 5 דקות (4 ° C). Decant תגובת שיקוע ולהיות בטוח שלא להפריע. גלולה.
  6. מערבבים בעדינות תאים להשעות מחדש עם 200-400 µL מאגר FACS, ואז לשמור את זה בחושך ב 4 ° C עד ניתוח cytometry זרימה רגילה או מיון תא.
  7. עבור קיבעון לטווח קצר של תאים מוכתם, המשך 2.8 צעדים כדי 2.10. השתמש קיבוע עבור cytometry זרימה רגילה בלבד.
  8. מחדש מיד לאחר שלב 2.5, להשעות את התאים ב- 0.5 מ ל 2-4% paraformaldehyde (PFA) למשך 15-30 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: זהירות: PFA הוא מגרה ידוע עם השפעות מסרטנים רעילים. בעת שימוש מחברים, לטפל בזהירות מרבית. הקפד להשתמש בציוד מגן אישי המתאים, למצות אוורור.
  9. קיבוע הבאים, לשטוף תאים על-ידי הוספת 2 מ"ל FACS מאגר הדוגמאות, צנטריפוגה-751 g x ב- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק הסר צנטריפוגה הבאים supernatant.
  10. Resuspend התאים קבוע ב- µL 200 של מאגר FACS קר קרח וחנות ב 4 º C. חנות לתקן תאים עד שבוע 1-4 ° C, אידיאלי לבצע רכישה cytometry זרימה בתוך 48 שעות כדי למזער את autofluorescence.
  11. נתוני cytometry זרימה לפי ההוראות של היצרן cytometer זרימה או לבצע מיון פלואורסצנטי תא מופעל כפי שתואר על ידי Basu et al. 23

תוצאות

בעת שימוש לקוי אפוליפופרוטאין E עכברים (ספקיות KO) C57BL/6 (BL6) שמרו על דיאטה גבוה כולסטרול גבוה שמן (HCHFD או HCD) 18 שבועות, עונה 1 פרק 10-4 - 2 x 104 CD45+F4/80+ מקרופאגים אבי העורקים ניתן לבודד בעת ששתי הדגימות במאגר. כבדי גזור מן HFHCD-fed ספקיות KO עכברים, הפיק גדול מ- 5 x 10...

Discussion

דיאטה-induced הפרעות מטבוליות בדגמי לחקות morbidities שיתוף כגון טרשת עורקים, steatosis פשוטה, steatohepatitis ואף סוכרת מסוג 2 נמצאים בשימוש נרחב כדי להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס של התקדמות המחלה. עיכול תלויים collagenase משמש לעתים קרובות מביצועם רקמות לשחרר תאים16,מטריצה חוץ-...

Disclosures

לעורכים יש אינטרסים לא לחשוף.

Acknowledgements

ברצוננו להודות על המתקן הליבה Cytometry זרימה ב- פנסילבניה המדינה אוניברסיטת המילניום מדע מורכבים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
26 G x 5/8 in NeedlesBD305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection SetBD367297Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. NeedlesBD305156
1 mL syringe with rubber stopsBD309659
10 mL SyringesBD309604
1 mL SyringeBD309659
F4/80 PEBiolegend123110
CD11c PE/Cy7Biolegend117318
CD11b PE/Cy5eBioscience15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block Biolegend101320
CD45 Pacific BlueBiolegend103126
PE Rat IgG2aBiolegend400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgGBiolegend400922
PE/Cy5 Rat IgG2bBiolegend400610
Pacific Blue Rat IgG2cBiolegend400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Cellgro15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)Cellgro21-031-CV
70 μm cell strainersCorning, Inc.352350
1.7 mL microcentrifuge tube DenvilleC2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16xElectron Microscopy SciencesCAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp Stoelting52132-10PUsed for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mmStoelting52102-37P Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge Fine Science Tool15000-10Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip ForcepsFine Science Tool11297-10Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved)Fine Science Tool13021-12
Heparin Sodium SaltFischer Scientific9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri DishesFischer Scientific12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lidFischer Scientific08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)Fischer Scientific14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)Fischer Scientific14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes Fischer Scientific14-959-5
Fetal Bovine SerumGemini Bio-Products100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)MilliporeEX0285-1
Bovine Serum AlbuminRocklandBSA-50
HEPESSigma-AldrichH3375
Collagenase Type IISigma-AldrichC6885
Collagenasse Type XISigma-AldrichC7657
Hyaluronidase Type ISigma-AldrichH3506
DNAseSigma-AldrichDN25
Collagenase Type ISigma-AldrichC0130
NaOHSigma Aldrich1310-73-2 
CaCl2Sigma Aldrich449709-10G
500 mL beaker Sigma Aldrich02-540M
4 cm Hemostatic clampStoelting52120-40
Toothed forcepsStoelting52104-33P
50 μm Disposable filtersSystemex04-0042-2317
Collagenase Type IVThermoFischer Scientific17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK)ThermoFischer Scientific A1049201
Razors (0.22 mm (0.009"))VWR International55411-050
Texas Red Live/Dead stainRed viability stain (in Figure 1A)

References

  1. Davies, L. C., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages: Then and Now. Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).
  2. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444 (12), 840-846 (2006).
  3. Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease. Nature. 444 (12), 875-880 (2006).
  4. Jung, U., Choi, M. -. S. Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).
  5. Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome. Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).
  6. Vieira-Potter, V. J. Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues. Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages. Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).
  9. Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. Macrophages at the fork in the road to health or disease. Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).
  10. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).
  11. Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).
  12. Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).
  13. Fujisaka, S., Usui, I., et al. Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice. Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).
  14. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization. J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).
  15. Qureshi, K., Abrams, G. A. Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease. World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).
  16. Bedossa, P., Paradis, V. Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).
  17. Tilg, H., Moschen, A. R. Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis. Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).
  18. Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations. World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).
  19. Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans. Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).
  20. Mestas, J., Ley, K. Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis. Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).
  21. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  22. Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).
  23. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), e1546 (2010).
  24. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots. J Vis Exp. (94), e52174 (2014).
  25. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), e2848 (2011).
  26. Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II. Chemical Engineering Transactions. 38, 247-252 (2014).
  27. Wells, R. G. The role of matrix stiffness in regulating cell behavior. Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).
  28. Fain, J. N. Isolation of Free Brown and White Fat Cells. Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).
  29. Seglen, P. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
  30. Yu, S., Allen, J. N., et al. The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis. J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).
  31. Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).
  32. Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires "M2c" polarization and MerTK induction. J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).
  33. Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages. PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).
  34. Rőszer, T. Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms. Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).
  35. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages. Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).
  36. Kim, Y. -. J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).
  37. Tung, J. W., Heydari, K., et al. Modern Flow Cytometry: A Practical Approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
  38. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000. 6 (3), 13 (2014).
  39. Porcheray, F., Viaud, S., et al. Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation. Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).
  40. Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment. Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122inducedFACS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved