肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

要約

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ ホールマーク食事誘発代謝疾患モデルから抽出された組織の炎症。

要約

肥満は、主として単球由来マクロファージと同様に、住民組織マクロファージによる慢性的な炎症状態を促進します。食餌誘導性肥満 (DIO) はマクロファージの多様性; の役割を勉強の貴重なモデルただし、分離十分なマクロファージは炎症を起こした組織から取得する困難です。このプロトコルでは、私達は分離手順と必要なトラブルシューティングのガイドライン 18 週間の高脂肪 (HFD) または高脂肪高コレステロール (マウスから住民組織マクロファージの適切な人口を得るため私たちの研究から派生した輪郭を描くHFHCD) 食事介入。このプロトコルは、肥満や動脈硬化、肝、白色脂肪組織 (WAT)、大動脈などで学んだ 3 つのホールマーク組織に焦点を当てください。我々 はどのように二元的な使用を強調流れの cytometry 分離の新しいディメンションと住民組織マクロファージの性質を達成できます。このプロトコルの基本的なセクションは、フローサイトメトリーによる解析の染色後の細胞表面抗体とマクロファージの分離、組織固有の酵素の消化力の基になる複雑さを扱います。このプロトコルは、蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えの基になる既存の複雑さに対処し、適切に並べ替えられた細胞集団から幅広い評価を得られるようにこれらの複雑さへの明確化を提案します。豊かな代替メソッドは、並べ替え FACS を操作するときの柔軟性と時間の管理を可能にする高密度の肝臓などの細胞に含まれています。簡単に言えば、このプロトコルを特定の研究では炎症を起こした組織の多数のマクロファージの不均一性を評価する研究者を助けるし、良好な細胞の単離と解析の成功している洞察力のトラブルシューティングのヒントを提供しますDIO を介した炎症における免疫細胞。

概要

マウス モデルは、人間の病気の研究に広く使用されています。病気の状態のマウスから常駐細胞の適切な分離は、病¹の病態を分子・細胞の貢献を理解するためのプラットフォームを提供できます。重要です 1 つの障害は、肥満です。肥満の発生率は、インスリン抵抗性と並行世界的に上昇、タイプ 2 の糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患^2,3を継続します。過剰栄養摂取はさらに減らされた身体活動⁴大動脈および肝臓などの末梢組織の細胞環境を変更することができます脂肪組織から発せられる変更された信号をトリガーによって偏っています。代謝恒常性のような混乱は、慢性低学年全身性炎症⁵の結果します。

古典的活性化マクロファージの白色脂肪組織 (WAT) の募集と同様に大動脈および肝臓に居住者だけでなく代謝シグナルの調節不全を開始、また炎症^6,7を維持する示されています。大食細胞の表現型および機能の多様性は肥満の病因に強く関連付けられている関連する併存⁷。マクロファージ偏波の動的塑性進行を調整するアクティブ化された表現型の範囲と炎症⁸の解像度を展示するこれらの細胞が可能です。一方、古典的活性化 (M1) マクロファージは炎症の進展に関与している、あるいはマクロファージ (M2) が解像度と組織修復^9,10に関連付けられています。

体は代謝ストレスを受けると白色脂肪組織が異常蓄積されます。拡張の脂肪組織を引き付ける、インスリン抵抗性、高血糖、最終的に 2 型糖尿病、インスリン抵抗性や高血糖^{11を促進するために通常の脂肪細胞機能を深く変更炎症細胞を保持 12}。並行して、白色脂肪組織改造によって解放の炎症性反応では古典的活性化 (M1) 脂肪組織マクロファージ (Atm)^13,14を浸透させた。この多細胞器官は肝⁴大動脈などの他の臓器の正常な機能を derails シグナルのカスケードを発揮します。

肝臓は、近くの調節不全ワット¹⁵発刺激への応答の適応代謝パワーハウスです。肝マクロファージまたは代謝の変化に対応した、クッパー細胞実質の両方を変換する炎症性サイトカインと非実質細胞表現型を分泌して組織リモデリングを促進します。肝臓への脂肪蓄積、炎症、過剰な細胞外マトリックス預金、壊死、肝臓障害の広い範囲に貢献して炎症性の侮辱は、非アルコール性脂肪性肝疾患^{に関連付けられている最終的な関数の損失次のよう16,17,18}。

並行して侵害されたワットと肝機能、太い動脈累積動脈壁内の脂質、体は慢性的な代謝ストレス¹⁹を受けます。動脈の脂質の蓄積は、活性化された血管内皮細胞によるケモカイン分泌および単球²⁰の後の採用をトリガーします。募集、一度単球増殖を区別するため、リポ蛋白を摂取、泡沫細胞になります。粥状動脈硬化を開始され、プロ炎症性活動による持続的な募集と組織マクロファージ脂質荷を積んだ。この動脈硬化の微小環境の中継細胞外と細胞内ストレス信号に屈して、これらマクロファージは、アポトーシスのシグナル伝達カスケードに従事しています。これらの泡の細胞が死ぬと、プラーク破裂、心筋梗塞や脳卒中につながる病巣の壊死性コアに満たされた脂質内容を貢献します。

総称して、マクロファージの表現型の多様性は一部ワット、肝臓、大動脈^8,21などの調節不全組織における炎症性変化による肥満を調整します。特性の採用し、組織マクロファージは、大食細胞の表現型の¹を操作する分子標的の可能性への洞察を提供すること。効果的に炎症を起こした組織の肥満によるマクロファージを特徴付ける、酵素消化による単一細胞懸濁液が得られます。このような分離のプロトコルは免疫細胞死を最小限に抑えながら、最適な細胞収率を提供する結合組織を十分に分解に効果的である必要があります。酵素の混合、組織とその構造のメイクアップの種類に依存します。大動脈など弾力性のある組織では、肝組織の解離を達成するためにワットと比較してより強力な酵素活性を必要があります。単一細胞懸濁液から組織マクロファージが明確に特徴するまたは、転写プロファイリングなどさらに下流解析の分離します。

ここで組織固有のプロトコルは説明を効果的に分離し、伝統的な食生活による肥満、住民組織マクロファージを特徴付けるコラゲナーゼ依存組織消化と多色フローサイトメトリーを使用します。アテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝と肝炎マウス モデル。同時白血球 - (CD45 や CD11b) やマクロファージに対する抗体と細胞表面のマーカーの染色 (F4/80) 特定の抗原は、しばしばマクロファージ人口²²を識別するために使用されます。蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えは、高純度でこれらの特定の集団を並べ替えるために使用する強力な戦略です。並べ替えられた人口は、表現型特異的遺伝子プロファイル (量的なリアルタイムのポリメラーゼの連鎖反応) などの下流の分子分析²³を使用して評価できます。標準フローサイトメトリー ・ フロー フローサイトメトリーを用いた細胞のソーティングは非常に異種細胞懸濁液内マクロファージを区別する強力なツールであるが、正常な出力を確保するため元のプロトコルを最適化する必要があります。本研究では効果的に分離し、実行可能なティッシュ特定の大食細胞を特徴付けるプロトコルを説明します。もっと重要なは、この研究は、しばしば発生を防ぐおよび/またはそれらを解決するプロアクティブとトラブルシューティング戦略だけでなく、技術的な問題に重要な洞察を提供します。

プロトコル

すべての実験的プロトコル (セクション 1、1.2、および 1.3) 承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルベニア州立大学で。

組織	解離バッファー準備	最終巻	ストレージ
白色脂肪組織 (WAT)	解離バッファー: 2.5 %hepes、10 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA)、3 mg/mL (0.3%)コラゲナーゼ タイプ II でダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) L-グルタミンとナトリウムのピルビン酸なし 4.5 G/L グルコース	500 mL	80 マイナス° C (10 mL 因数)
肝臓	濃縮液灌流 (PBC) x 25: 3.55 M NaCl、KCl、168 mM 240 mM HEPES、150 mM NaOH に蒸留脱イオン H2O	500 mL	マイナス 20° C (40 mL 因数)
	保全バッファー (PRB): 1 %bsa を灌流バッファー x 1	1 L	4 ° C
	4.76 mM CaCl2 IV コラゲナーゼ型 72 U/mL と補われる解離バッファー: 1 x 血流バッファー	(マウス) あたり 50 mL	準備直前の使用
大動脈	解離バッファー: 125 U/mL コラゲナーゼ タイプ XI、60 U/mL ヒアルロニダーゼ タイプ I、60 U/mL DNase I, 450 U/mL コラゲナーゼ タイプ I、20 mM HEPES リン酸バッファー生理食塩水 (PBS) x 1	500 mL	80 マイナス° C (10 mL 因数)

表 1: 組織の特定の灌流のバッファー調理法。

1. 組織分離と解離

1. ワットの分離と解離
   1. 表 1に従って組織固有のバッファーを準備し、前述の保存します。
   2. 次の試薬を準備します。
      1. 消化バッファーを準備するには、使用するまでワット解離バッファーと 4 ° C でストアの適切なボリュームを融解します。使用前にすぐに暖かい 37 ° c. にバッファーリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 2% ウシ胎児血清 (FBS) を含む x 1 を準備すること、FACS バッファーを準備します。
   3. ワットの分離
      1. 充填中の二酸化炭素 (CO₂) マウスの商工会議所を安楽死させます。郭清のステージに続行する前に有効性を確認します。
      2. 簡単に徹底的に浸漬し、エタノールでコーティングまでの 70% エタノールを含むビーカーの euthanized マウスを浸しなさい。郭清ステージ上をマウスの腹側表面に配置、前面のマウスと後足は前足 21 G の針を使用して解剖基板に固定します。
      3. 尿道口の前方の腹部の皮膚を把握する中ポイント先端の鉗子を使用し、ニックネームは、把持の腹部皮膚に鋭い解剖はさみを使用します。
      4. 小切開の皮膚と腹膜の間にはさみの下刃を挿入し、胸郭、腹部から外側切開。
      5. そっとそのまま腹腔内を公開、横切開、腹膜を介して、いずれか透明な膜を折り返し、または腹部のワットを公開する組織を切除して皮膚を引き戻します。
      6. マンらの説明に従って perigonadal の脂肪パッドを収集します。²⁴
         1. 雄マウス perigonadal 脂肪パッドは、精巣上体や精巣に緩くバインドされます。まず精巣を検索し媒体鉗子、精巣上体頭の把握し、ポイントを軽く引いてください。
         2. 鋭い解剖はさみを使用して、(頭、胴、尾) は精巣上体や精巣の表面に沿って切断することによって各副睾丸脂肪パッドを切除します。
         3. 鉗子、脂肪パッドを引いて精巣上体構造直接バインドする結合組織を切削中。
         4. 鉗子を使用すると、精巣上体に近位の脂肪パッドの端をしっかりとつかんで、生殖腺からの脂肪パッドを慎重にはがします
         5. 雌マウスの perigonadal 脂肪パッドが緩く子宮体と子宮角への結合です。
         6. 中ポイント鉗子を使用して、perigonadal の脂肪質のティッシュを握り、軽く子宮体と子宮角から組織を引いてください。
         7. 子宮体と子宮角の鋭い解剖はさみを使ってに沿って切断することによってそれぞれの脂肪パッドを切除します。
      7. パッド、ペトリ皿の PBS で満たされ、組織の潤いを保つために氷の上を保つ脂肪を配置します。
   4. 単一細胞懸濁液にワットの解離
      1. ペトリ皿から余分な PBS を外し、小さな断片に腹部のワットをミンチにシングル エッジかみそりの刃を使用します。
      2. かみそりの刃の鋭い端、2 mL ワット解離バッファーを含むラベル 15 mL ポリプロピレン コレクション チューブにみじん切りにした腹部ワットに優しく擦る。
      3. 45 分の 37 ° C の低速連続回転の下でこの組織消化バッファー混合物を孵化させなさい。
      4. 円形の動きでシリンジのプランジャーのゴム製ピストンを移動しながら 50 mL のコレクション チューブに 70 μ m 携帯こし器を通って消化組織をフィルターし、フィルターを通して細胞懸濁液をふるい続けます。
      5. ピペット 2 mL のダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 15 mL 管、優しく上下にピペットで移しなさい、単一細胞懸濁液とフィルターの洗浄に。
      6. 冷たい DMEM に追加で 2 回フィルターを洗浄し、単一細胞懸濁液を氷の場所します。
      7. 8 分の 4 ° C で 300 x g で細胞懸濁液を遠心します。
      8. 真空吸引装置を使用して慎重に (最初の) 浮動脂肪細胞を削除して、残りの上清。小球形にされた間質血管分数 (SVF) の邪魔をしないことを確認します。
      9. 1,000 μ L ピペット優しく再中断ペレット アンモニウム塩化カリウム (ACK) バッファーに製造元の指示に従って赤血球を溶解します。
      10. DMEM に上記細胞懸濁液を希釈し、8 分の 4 ° C で 300 g の細胞懸濁液を遠心分離します。
      11. 2% を含む冷 PBS のセルを再停止 FBS (FACS バッファー) Burker 商工会議所/検定のセルをカウントします。
      12. ラベルを 5 mL 丸底ポリスチレン管 (の基本的な流れの cytometry) 1 x 10 の⁶セルまたは (FACS) の全体細胞懸濁液を転送します。プロトコルを汚すフローサイトメトリー用セクション 2 に進みます。
2. 肝組織の分離と解離
   注: このプロトコルは、Smedsrød²⁵から適応されました。
   1. 表 1に従って組織固有のバッファーを準備し、前述の保存します。
   2. 次の試薬を準備します。
      1. 1 x 血流バッファー (PB) 960 mL 超純水 H₂o. 前暖かいシリンジに PBC の 40 mL の希釈でいっぱい 37 ° C で PB の 50 mL の灌流を開始する直前の準備します。存在空気の泡を排除します。
         1. 空気の泡をなくすため、leur ロック ヒントが上向きシリンジを反転します。タップまたは気泡が頂上に注射器まで注射器をフリックします。空気を抜くためのプランジャーを軽く押します
      2. 476 mM CaCl₂ソリューションの 0.5 mL を希釈して消化バッファーを準備49.5 mL 1 x 血流バッファーにします。4.76 mM CaCl₂ -PB ソリューションに IV 型コラゲナーゼの 3600U を追加します。前灌流を開始する直前に 37 ° C で消化バッファーの 50 mL の満たされた注射器を温めます。1.2.2.1.1 の手順で説明するよう、現在空気の泡を排除します。
      3. 250 mL 1 x 血流バッファーで 2.5 g ウシ血清アルブミン (BSA) を溶解することにより保全バッファー (PRB) を準備します。4 ° C で保存または使用するまで氷の上を保ちます。
      4. 1 × PBS と 2 %fbs で FACS バッファーを準備します。
   3. 肝組織分離
      1. CO₂窒息によってマウスを安楽死させる、毛皮の腹腔内の臓器の汚染防止を 70% エタノールでマウスを飽和させます。
      2. 21 G の針を使用して解剖基板に足の位置、ポリスチレンをマウスの腹側発泡ボードを解剖と前部と後部のマウスを保護します。
      3. 胸壁と腹腔内に公開するには、媒体のポイント先端の鉗子を用いた尿道口近くの腹部の皮膚を把握します。鋭い解剖はさみを使用して把持の腹部の皮膚に小さな切開を作成します。
      4. 小切開の皮膚と腹膜の間にはさみの下刃を挿入し、あごを脚の付け根から横切開。
      5. そっとそのまま腹腔と胸壁を公開側腹膜切開、膜を切除し、皮膚を引き戻します。
      6. 胸骨を持ち上げると慎重に横隔膜を切開、下大静脈 (IVC) を邪魔しないようにしてください。消化器官を側に移動し、#22. IVC を探します。Suprahepatic 局在の灌流を維持するために下大静脈をクランプするのに止血鉗子を使用します。
         注: 内臓の白色脂肪組織の過剰な蓄積はしばしば下大静脈をマスクできます。この船をよりよく視覚化するには、下大静脈の横にある脂肪組織の小さな領域を切除することができます。しなやかな脂肪組織内切開のウィンドウは、穿刺用容器を公開する下大静脈に配置できます。
      7. 23 G 血のコレクションおよび輸液セットに予め温めておいた PB でいっぱい注射器を取り付けます。プランジャーのチューブと針 PB で満ちているまで軽く押します。
      8. #22. IVC のレベルに平行 23 G 針を挿入します。4 cm 止血クランプを使ってその場で針を固定します。
         注: 食飼育マウスの下大静脈を優先すると、下大静脈が良いこと、肝胆のカニュレーション可視化し、脂肪で満たされた空洞内 cannulated。
      9. 灌流を開始するプランジャーの慎重に押し、色は肝臓から急速にフラッシュされます (右葉最初) 針が容器に適切に配置されている場合。葉の拡大、針が正しく #22. 下大静脈に挿入されて場合表示されますも。
      10. 速やかに肝臓を自由に通過する PB を許可する門脈をカットします。
      11. 肝臓を灌流、血液が表示されなくなるまでです。前面の指と親指の血流を容易にする肝葉を機会に優しくマッサージします。
          注: 鋸歯状にされた非鈍い刃物を使用して、組織の損傷を防ぐために肝臓を処理することが重要です。
      12. PB の 5 mL 注射器内に残ります、注射器に予め温めておいた解離バッファーでいっぱいに変更されます。この時間の間にセキュリティで保護された針の位置が不可でした。
          メモ: 拡大肝 1.5 g を大幅に上回る成功の肝解離を保証するために予め温めておいた消化バッファーの大きいボリュームに灌流する必要があります。
      13. 完全に消化するまで肝臓を灌流します。血流を促進する肝葉を優しくマッサージします。
          注: 政教分離グリソン鞘の柔組織からは正常に消化肝臓の観測可能なオブジェクトです。これを評価するために、鉗子のペアの鈍端を使用して、左葉外側を軽く押して。印象、表面に出現し、鉗子を取り外したら、インデントはゆっくりと記入してください。
      14. #22. IVC から針を抜きます。Suprahepatic 下大静脈をクランプ止血鉗子を削除しないでください。
      15. 慎重に靭帯解剖はさみ短いまっすぐな刃を使用しての接続を切断することによって全体の肝臓を切除し、胆嚢を削除します。
      16. 10 cm のシャーレに全体の肝細胞を解放するために冷たい保全バッファーと 4 ^оC までで店の準備 10 mL を含みます。
   4. 肝細胞解離
      1. 10 mL を含んでいる 10 cm 皿に肝臓を転送冷たい DMEM。
      2. 下大静脈は歯の鉗子を使用して摘出した肝臓に接続切断の suprahepatic をグリップします。各葉になでるの急速な動きを適用してから、グリソン鞘の細胞を解放するのに中ポイント鉗子を使用します。
      3. 50 mL のコレクション チューブに接続されている 70 μ m セル ストレーナーを飽和 DMEM を通過します。
      4. ピペット 10 mL 冷たい DMEM 10 cm シャーレと 1.2.4.3 に 1.2.4.1 メディア飽和は発生しなくなるまで、ステップを繰り返します。細胞懸濁液または 4 ° C で氷の上の場所
      5. 優しくコレクション チューブを反転による細胞懸濁液を混合し、4 ° C で 2 分間 54 × g で遠心分離
      6. きれいな 50 mL のコレクション チューブに上清を収集します。4 ° C で 2 分間 54 x g で細胞懸濁液を遠心分離します。
      7. 手順 1.2.4.6 1.2.4.8 の手順に進む前に追加で 2 回。
      8. クリーン 50 mL コレクション チューブに上清を転送し、4 ° C で 10 分間 300 x g で細胞懸濁液を遠心分離
      9. 再 FACS バッファーに非実質細胞ペレットを中断し、Burker 商工会議所/検定でそれらを数えます。
      10. ラベル 5 mL 丸底ポリスチレン管 (の基本的な流れの cytometry) 1 x 10 の⁶セルまたは 15 x 10⁶ - 20 x 10⁶セル (FACS) に転送します。プロトコルを汚すフローサイトメトリー用セクション 2 に進みます。
3. 大動脈隔離と解離
   注: このプロトコルは、肉屋から適応されました。et al.²⁶
   1. テーブル 1で提供されるレシピに基づいて組織固有のバッファーを準備し、前述の保存します。
   2. 次の試薬を準備します。
      1. 消化バッファーを準備するには、使用するまでワット解離バッファーと 4 ° C でストアの適切なボリュームを融解します。使用前にすぐに暖かい 37 ° c. にバッファー
      2. 200 U/mL の濃度で 1 × PBS でナトリウム塩ヘパリンを溶解することにより 10 倍、ヘパリン溶液を準備します。ヘパリン溶液 × 1 を準備する 1 × PBS でヘパリン原液 x 10 を希釈します。使用するまで 10 倍と 4 ° C でヘパリン溶液 x 1 を格納します。
      3. 2% を含む 1x PBS で FACS バッファーを準備政府短期証券。
   3. 大動脈解離
      1. 炭酸ガス充填室、70% エタノールでリンスでマウスを安楽死させます。
      2. 郭清ステージ上をマウスの腹側に配置、前面マウスと後足は前足を広める、21 G の針を使用して解剖基板に固定します。
      3. マウスを使い果たせば、直後後心臓穿刺を行います。必要に応じて 1.3.3.9 に 1.3.3.4 の手順を参照してください。
      4. 胸骨の下端の剣状突起を検索します。
      5. これを行うには、動物の首の幅に沿って指の中間点を配置します。軟骨の拡張子が感じられるまで胸骨尾側に首から腹側正中線に沿ってトレースします。
      6. 軟骨拡張機能を把握する中ポイント鉗子を使用し、必要に応じて髪または領域の皮膚のパッチを除去することによって、剣状突起の位置をマークします。
      7. 部分的に 20-30 ° の角度で剣状突起下 26 G 針を挿入します。
      8. ゆっくり注射器に、プランジャーをゆっくり引き出すことによって否定的な圧力を適用し、血流まで空洞にさらに針を挿入します。
      9. 血流が停止した場合ゆっくりと針を回転またはわずかに移動し、アウトします。
      10. 尿道の前方の腹部の皮膚のホールドをつかむための鉗子のペア使用を開くと、あごに脚の付け根から腹膜を介して腹側正中線に沿ってカットする鋭い解剖はさみのペアを使用.
      11. 腹部臓器との指で胸郭を公開する皮膚を引き戻すか、鈍い鉗子は優しく側に腹部臓器を移動します。
      12. 剣状突起のホールドをつかむ鉗子の使用は、胸骨を持ち上げて横隔膜を切開します。
      13. 両側に横リブをカット、解剖はさみを使用します。胸骨をつかんで、胸郭を上向きに反転、接続ベースでカットします。基になる胸部臓器を公開する胸郭を削除します。
      14. 心臓の左心室 (LV) に 1-2 mL の溶液を注入することで、ヘパリン溶液 × 1 でいっぱい 10 mL のシリンジに接続されている 26 g 注射針と大動脈を灌流します。
          注: 必ず少し圧力がそのまま動脈硬化大動脈病変を確認すると遅い速度でを灌流してください。
      15. 胸腺、肺および結合組織を切除します。必要に応じて手順 1.3.3.16 と 1.3.3.17 を参照してください。
          1. 中心前方検索白双裂 (または蝶の形) オルガンとしっかりとつかむ鉗子による胸腺のホールド。両葉をキャビティから引き上げて、基部にハサミでカットします。
          2. 肺を取り外す、生検鉗子で肺の葉をピンチ、胸腔内から組織を引いて、ベースでカットします。各残りの葉に繰り返します。
      16. 解剖顕微鏡とマイクロ分析ツール、および収集、昇順、降順、胸部、腹部大動脈、腕頭動脈、左総頚動脈、左鎖骨下動脈)、(を含む大動脈アーチを使用します。
          1. 心臓の左心室に大動脈を探します。
          2. 湾曲した 0.07 × 0.04 mm チップのペアで鉗子はそっと左心室から出て上行大動脈の部分を把握します。
             注: は、黄色を帯びた周囲の脂肪組織と比較して、大動脈はヘパリン溶液を十分にフラッシュされたとき LV から明るい白い容器になります。
             1. 大動脈は、心臓の血流によって正しくフラッシュされなかった場合、は、大動脈の空洞に接続されたままに大動脈をもう一度フラッシュしています。これを行うには、心臓大動脈ジャンクション付近をカット、心を取り除き、腹部大動脈のローエンドを水平方向に切ってください。上行大動脈の開口部に 26 G 針を挿入し、優しくヘパリン溶液 x 1 大動脈をフラッシュします。
             2. 良い脂肪組織および埋め込まれた大動脈の間で区別する上行大動脈を慎重に引っ張って。
             3. まだ、上行大動脈に引き上げて、昇順大動脈および大動脈弓をカプセル化する脂肪をオフに閉じた春解剖はさみの先端を使用します。これを行うには、接続の脂肪を離れて引き裂く閉じたシザーの刃の先端で脂肪質のティッシュをストロークします。
                注: 昇順大動脈およびアーチを明確に視覚化できることまでを切断することによって任意の脂肪質のティッシュの切除を控えます。これは、大動脈を切断を防ぐためです。
             4. 昇順大動脈およびアーチは、サラウンドの脂肪質のティッシュから明確に線引きすることができる場合、は、解剖はさみばねを使用して余分な脂肪を切除します。
             5. 優しく、鉗子で大動脈弓のホールドをつかみます。脂肪のスリーブの右側で行います春シザーの先端、腹部大動脈の尾の端に降順、胸部、腹部の大動脈の長さに沿って脂肪でストロークを使用しています。
             6. 脂肪を離れて引き裂くとき大動脈に沿って把握し続けます。大動脈の損傷を防ぐために優しく行うようにしてください。
             7. 脂肪が大動脈の後ろに今すぐ表示されるように、顕微鏡に向かって上向きの大動脈をゆっくり引き抜きます。
             8. にべもなく抜本的な動きを使用して深刻な下行大動脈の前方終わり近く脂肪大動脈インターフェイス間閉じたシザー ブレード大動脈の表面に脂肪質のティッシュの添付ファイルを挿入します。
                注: 徹底的に余分な脂肪を削除して、大動脈がまだ空洞内にある組織の接続を推奨します。
             9. 心を消費税し、横置き腹部大動脈の尾側端でカットします。全大動脈を削除します。
             10. 35 mm ディッシュの大動脈を置き、2 つの 21 ゲージ針を使用して大動脈に余分な脂肪をいじめます。氷の上の 1.7 mL 遠心チューブに摘出した大動脈を配置します。
   4. 単一細胞懸濁液に、大動脈の解離
      1. ピペット 0.2 mL 大動脈解離バッファー、大動脈を含むチューブ。テーパ管末春シザー ブレードを挿入し、急速に酵素消化を容易にする大動脈をミンチします。
      2. 組織の溶液を 15 mL コレクション チューブ ・ ピペット 1.8 mL 大動脈解離のバッファー容量 2 ml に転送します。
         注: 組織懸濁液の簡単な転送は、標準的な 1,000 μ L ピペット チップのテーパー端から 1 cm をカットします。短縮のヒントを使用すると、マイクロ ピペットの懸濁液を転送します。
      3. 220 rpm (0.514 x g) で揺れ、37 ° C で 55 分の大動脈解離バッファーにみじん切りにした大動脈を孵化させなさい。
      4. 50 μ m の細胞のストレーナを通過して懸濁液 15 mL ポリプロピレン コレクション チューブに。シリンジのプランジャーのゴム製ピストンを使用すると、フィルター処理を容易にします。
      5. 1 mL FACS バッファーで 15 mL コレクション チューブを洗浄、懸濁液を収集し、セル ストレーナを通過します。
      6. 50 μ m の細胞のストレーナーを 1 mL FACS バッファーを追加で 2 回洗います。
      7. 4 ° C で 5 分間 300 × g で遠心分離によって細胞をペレットします。再冷たい FACS バッファー内セルを中断します。Burker 商工会議所/検定のセルをカウントします。
      8. 1 x 10⁶ (基本的な流れの cytometry) セルまたは (FACS) の全体細胞懸濁液をラベル付き 5 mL 丸底のポリスチレン管に転送します。プロトコルを汚すフローサイトメトリー用セクション 2 に進みます。

2. フローサイトメトリーおよび FACS 染色を流れ

蛍光体	R-フィコエ リスリン (PE)	PE/シアニン (Cy) 7	PE/シアニン (Cy) 5	パシフィック ブルー (PB)
レーザー (nm)	青 (488 nm)/黄色 (561-570 nm) ・緑 (532 nm)	青 (488 nm)/黄色 (561-570 nm) ・緑 (532 nm)	青 (488 nm)/黄色 (561-570 nm) ・緑 (532 nm)	バイオレット (405 nm)
励起MAX (nm)	496	496	496	401
排出量MAX (nm)	578	785	667	455
表現型マーカー	F4/80	CD11c	CD11b	CD45
	EMR1、Ly71	ΑX インテグリン インテグリン αX チェーン、CR4、p150、ITGAX	インテグリン α M、Mac 1、Mo1、CR3、Ly 40、C3biR、ITGAM	T200, Ly 5, LCA
対象となるセルの種類	組織マクロファージ	(M1) 古典的活性化マクロファージ	単球/マクロファージ	白血球 (マクロファージ/顆粒球、リンパ球、単球)
	樹状細胞のサブセット	樹状細胞、NK 細胞、活性化 T 細胞、腸管上皮内リンパ球 (IEL) のサブセット	顆粒球、樹状細胞、NK 細胞、T および B 細胞のサブセット
希釈倍率	1:50	1: 100	1: 100	1: 100
アイソタイプ コントロール	PE ラット igg2a 産	PE/Cy7 アルメニア ハムスター IgG します。	PE/Cy5 ラット IgG2b	太平洋の青いラット IgG2c

表 2: タグ付き差別組織マクロファージの特異抗体の fluorophore の一覧。

1. 収集し、次の項目を準備: FACS バッファー 5 mL 丸底ポリスチレン チューブ、抗マウス CD16/32 Fc 受容体抗体・蛍光体共役または一次抗体、二次抗体の蛍光標識 (場合を非抱合型へリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 必要)、1 は。
   注: 大量の細胞を染色抗体濃度は最も重要な細胞の数ではなくです。たとえば、染色 10 × 10⁶細胞染色バッファー量や抗体濃度は 1.0 × 10 を汚すかのよう同じをする必要がある場合、⁶は 100 μ L バッファーのボリュームでセルします。1.0 x 10 の汚損のため⁸細胞、抗体量を 5 倍に増やすことをお勧めします。
2. 5 分 (4 ° C) 751 × g で遠心分離によって細胞のペレット、必要に応じて各 FACS 管に追加冷たい FACS バッファーを追加します。清次遠心分離を吸い出しなさい。
3. 製造元の指示に従ってすべてのサンプルに抗体抗マウス CD16/CD32 Fc 受容体を追加します。氷または 4 ° C で 15 分間インキュベートします。
4. 蛍光標識一次抗体カクテル直接 Fc 受容体に細胞懸濁液とインキュベート ブロッキング抗体を含む試料 4 ° C、30 分で保護蛍光色素標識された抗体の漂白を最小限に光からを追加します。
   1. ステップ 2.4 の完了後、次の手順に従って、非標識一次抗体が使用されたイベント。
   2. 洗浄一次抗体染色し、5 分間 (4 ° C) 751 × g で遠心分離によるサンプル。
   3. 上清をデカントで削除し、再 100 μ L FACS バッファー内のペレットを中断します。
   4. すべての必要な試料に共役二次抗体を追加し、4 ° C で 30 分間インキュベート2.5 の手順に進みます。
5. 次抗体の孵化、2 mL の氷冷 FACS バッファーを追加し、5 分間 (4 ° C) 751 x g で細胞のペレットします。上清をデカントし、ペレットを邪魔しないようにしてください。
6. 細胞を優しくミックスに FACS バッファーの 200-400 μ L で再停止し、標準フロー フローサイトメトリー解析や細胞選別まで 4 ° C で暗闇の中でこれを維持します。
7. 陽性細胞の短期固定、2.10 に 2.8 の手順に進みます。標準フローサイトメトリー用固定を使用します。
8. 4 ° C で 15-30 分の 0.5 mL 2-4% パラホルムアルデヒド (PFA) のセルを中断直後ステップ 2.5 再
   注意: 注意: PFA は、発ガン性や毒性の効果で知られている刺激。PFA を使用する場合は、細心の注意と処理します。必ず適切な個人用保護具を使用し、換気してください。
9. 次の固定は 2 mL FACS バッファーをすべてのサンプルに追加することによって細胞を洗って 5 分削除清次遠心分離のための 4 ° C で 751 × g で遠心分離機します。
10. 氷冷 FACS バッファーと 4 ° C でストアの 200 μ L に固定細胞を再懸濁しますストア修正プログラム細胞 4 ° C で最大 1 週間、理想的には蛍光を最小限に抑えるために 48 時間以内の流れ cytometry 買収を実行します。
11. Basu et alによって記述された蛍光活性化細胞のソートを実行または流れの cytometer 製造元の指示に従って流れ cytometry データを取得します。²³

結果

アポリポ蛋白 E 欠損 (アポ島) C57BL/6 (BL6) マウス 18 週間、1 x 10 の⁴ - 2 × 10⁴ CD45 (HCHFD または HCD) 高脂肪高コレステロール食で維持を使用する場合⁺F4/80⁺ 2 つのサンプルは、大動脈マクロファージが分離することができますプール。HFHCD 給電アポ KO マウスの胃から肝臓生産 (これは、使用可能な並べ替え時間異なります) 5 x 10⁵並べ?...

ディスカッション

病気の進行の分子メカニズムを理解するアテローム性動脈硬化、単純な脂肪肝、肝炎などの併存を模倣し、タイプ 2 の糖尿病の食事誘発代謝性疾患モデルが採用されます。コラゲナーゼの消化力依存は細胞外マトリックス (ECM)^16,27から細胞を解放するために組織を分離するによく使用されます。コラゲナーゼなどの酵素は、隣接する細胞の構造的な...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G x 5/8 in Needles	BD	305115
23 G x 0.75 in needle x 12 in. tubing Blood Collection Set	BD	367297	Used for cannulation of subhepatic IVC during liver perfusion
21 G 1 1/2 in. Needles	BD	305156
1 mL syringe with rubber stops	BD	309659
10 mL Syringes	BD	309604
1 mL Syringe	BD	309659
F4/80 PE	Biolegend	123110
CD11c PE/Cy7	Biolegend	117318
CD11b PE/Cy5	eBioscience	15-0112-81
Anti-mouse CD16/32 Fc Block	Biolegend	101320
CD45 Pacific Blue	Biolegend	103126
PE Rat IgG2a	Biolegend	400508
PE/Cy7 Armenian Hamster IgG	Biolegend	400922
PE/Cy5 Rat IgG2b	Biolegend	400610
Pacific Blue Rat IgG2c	Biolegend	400717
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	15-017-CV
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)	Cellgro	21-031-CV
70 μm cell strainers	Corning, Inc.	352350
1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Paraformaldehyde Aqueous Solution -16x	Electron Microscopy Sciences	CAS #30525-89-4
Micro Dissecting Scissors, 3.5 inch, Straight, 23 mm, Sharp	Stoelting	52132-10P	Used for general dissecting purposes
Micro Forceps, 4 inches, full curve, 0.8 mm	Stoelting	52102-37P	Used for general dissecting purposes
Spring dissection scissors – 3 mm Cutting edge	Fine Science Tool	15000-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Curved 0.07 mm x 0.04 mm Tip Forceps	Fine Science Tool	11297-10	Used for aorta dissection Steps 1.3.3.17 to 1.3.3.28
Hemostatic Forceps (Curved)	Fine Science Tool	13021-12
Heparin Sodium Salt	Fischer Scientific	9041-08-1
35 mm Cell Culture/Petri Dishes	Fischer Scientific	12-565-90
Polystyrene Petri Dishes (10 cm) w/lid	Fischer Scientific	08-757-100D
15 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-959-53A
50 mL Conical Centrifuge Tubes (Polypropylene)	Fischer Scientific	14-432-22
5 mL Round-Bottom Polystyrene Tubes	Fischer Scientific	14-959-5
Fetal Bovine Serum	Gemini Bio-Products	100-106
Ethanol (Stock Ethyl Alcohol Denatured, Anyhydrous)	Millipore	EX0285-1
Bovine Serum Albumin	Rockland	BSA-50
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Collagenasse Type XI	Sigma-Aldrich	C7657
Hyaluronidase Type I	Sigma-Aldrich	H3506
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Collagenase Type I	Sigma-Aldrich	C0130
NaOH	Sigma Aldrich	1310-73-2
CaCl2	Sigma Aldrich	449709-10G
500 mL beaker	Sigma Aldrich	02-540M
4 cm Hemostatic clamp	Stoelting	52120-40
Toothed forceps	Stoelting	52104-33P
50 μm Disposable filters	Systemex	04-0042-2317
Collagenase Type IV	ThermoFischer Scientific	17104019
Ammonium Chloride Potassium (ACK)	ThermoFischer Scientific	A1049201
Razors (0.22 mm (0.009"))	VWR International	55411-050
Texas Red Live/Dead stain			Red viability stain (in Figure 1A)