En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Resumen

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

Resumen

La electroporación es un método que introduce genes de interés en organismos biológicamente relevantes como el embrión de pollo. Se ha establecido que el embrión de pollo es un modelo de investigación eficaz para estudiar las funciones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo. Más recientemente, el embrión de pollo se ha vuelto particularmente valioso en el estudio de la expresión génica, la regulación y la función asociada con la audición. En ovo la electroporación se puede utilizar para dirigir las regiones auditivas del tronco cerebral responsables de funciones auditivas altamente especializadas. Estas regiones incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM) y el núcleo laminaris (NL). NM y NL neuronas surgen de distintos precursores de rhombomeres 5 y 6 (R5 / R6). Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmidos para estudiar las propiedades relacionadas con el gen en estas regiones. Se muestra un método para el control espacial y temporal de la expresión génica que promueven la ganancia o pérdida de funcional fenotipoEs Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con R5 / R6, se muestra la transfección de plásmidos en NM y NL. La regulación temporal de la expresión génica puede conseguirse adoptando un sistema vectorial tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox). La técnica de electroporación in ovo - junto con los ensayos funcionales bioquímicos, farmacológicos y / o in vivo - proporciona un enfoque innovador para estudiar el desarrollo de las neuronas auditivas y los fenómenos patofisiológicos asociados.

Introducción

La codificación neuronal rápida del sonido es esencial para las funciones auditivas normales. Estas incluyen las habilidades de localización de sonido ¹ , el habla en la discriminación de ruido ² , y la comprensión de otras señales de comunicación relevantes para el comportamiento ³ . Las neuronas análogas ubicadas en el tronco encefálico auditivo de aves y mamíferos son altamente especializados para la codificación neuronal rápida [ ^4] . Estos incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM), el núcleo laminaris (NL) y sus análogos de mamíferos, el núcleo coclear anteroventral (AVCN) y el olivo medial superior (MSO), respectivamente ⁵ . Sin embargo, los mecanismos de desarrollo que regulan la codificación neural rápida son mal entendidos en el tronco encefálico auditivo. Por lo tanto, es ventajoso estudiar genes específicos que son responsables de la codificación neural rápida con el fin de comprender mejor su expresión, regulación y función en auDesarrollo territorial.

El embrión de pollo en desarrollo es una herramienta de investigación eficaz y bien establecida para estudiar las cuestiones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo ^{6 , 7} . Recientes avances moleculares han abordado estas cuestiones biológicas en el embrión de pollo en desarrollo mediante la expresión o derribar a los genes de interés con el fin de analizar la función de genes in vivo [ ^{8 , 9]} . La investigación del papel regulador de genes específicos es un avance significativo en la comprensión de patologías asociadas con déficit auditivo. Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmido en el tronco encefálico auditivo de pollo donde la codificación neuronal rápida del sonido se produce ¹⁰ . Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con los rhombomeros 5 y 6 ^{11 , 12} (R5 /R6), se muestra el control espacial de la transfección de plásmidos en NM y NL. Además, se muestra la regulación temporal de la expresión mediante la adopción de un sistema de vector tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox) [ ^8] .

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Northwestern, y llevados a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud Pautas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Manejo de huevos

1. Compre huevos fertilizados de un vendedor local. Almacene los huevos a 13 ° C en un refrigerador por no más de 5 días antes de la incubación. La viabilidad del embrión disminuye significativamente después de 1 semana.
2. Limpie cada huevo con etanol al 70% antes de colocarlo en la incubadora.
3. Coloque 1-2 docenas de huevos en sus lados en una incubadora con la temperatura establecida a 38 ° C a ~ 50% de humedad. Esto asegura el posicionamiento correcto del embrión para la electroporación y la viabilidad óptima, respectivamente.
   NOTA: Después de 48-52 h de incubación, los huevos estarán en el estadio Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 y listos para la electroporación.

2. Preparación

1. Plasmid MiXing
   1. Añadir 1 μl de 0,1% de verde rápido (0,1% en 18 MΩ de H2O desionizada y destilada [ddH ₂ O]) por cada 7 μl de mezcla de ADN.
   2. Para co-electroporación de múltiples plásmidos, mezclar los plásmidos en una proporción de 1: 1. La concentración final de ADN debería ser de 5-8 μg / μl.
2. Pieza de inyección de llenado
   1. Tire las pipetas de un extractor de micropipeta. Llene la pipeta con 1-2 μ l de plásmidos con una jeringa 28G aguja.
   2. Retirar la punta de la pipeta a 10 - 20 μm usando una pinza. Utilice un microscopio para ayudar a determinar el tamaño de la punta de la pipeta rota. Conecte la pipeta al porta-pipeta del picospritzer.

3. Ventana

NOTA: El procedimiento de ventana se ha publicado antes de ¹³ . Consulte la referencia 13 para obtener información visual adicional.

1. Limpie todos los instrumentos y el área de trabajo con un 70%etanol.
2. Tome el número deseado de huevos puestos fuera de la incubadora (entre 6-10), deje a temperatura ambiente, y los huevos de torunda individualmente con etanol 70% otra vez. Los huevos permanecen viables por lo menos 2 horas después de la remoción de la incubadora.
3. Coloque el huevo encima de un iluminador de luz para identificar la posición del embrión. Encierre en un círculo el centro del área oscura ( es decir , embrión) con un lápiz.
4. Usando una aguja 19G, empuje un agujero en el extremo romo del huevo.
5. Poke otro agujero cerca del círculo dibujado en el lado puntiagudo del huevo. Retire una pequeña pieza de la cáscara de huevo externa (aproximadamente 16 mm ² ) con la aguja 19G y luego extraiga un pequeño pedazo de la cáscara de huevo interna (unos 8 mm ² ) con fórceps.
6. Con una jeringuilla de 3 ml equipada con una aguja 19G, extraer 1,5-2,5 ml de albúmina del huevo a través del agujero de extremo romo. Asegúrese de inclinar la aguja hacia abajo a 45 °.
7. Cubra el orificio de extremo romo con un pequeño trozo de cinta adhesiva (1 cm x 1 cm). Cubrir el círculo dibujado unD el segundo agujero con cinta (2,5 cm x 4 cm).
8. Con las tijeras curvadas (filo = 2.5 cm), corte una ventana dentro del círculo. Las tijeras deben estar paralelas a la cáscara del huevo y el diámetro de la ventana debe ser inferior a 2 cm.

4. Inyección de plásmido

1. Encienda el picospritzer. Ajuste la presión a 18 psi y la duración a 5 μs. Encienda el tanque de aire y la lámpara para el microscopio de disección.
2. Haga 30 mL de solución madre de una dilución de 1:10 de tinta china comprada en la tienda mezclada en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Almacenar a 4 ° C. La inyección de tinta china es un paso importante para obtener una mejor visualización del embrión de pollo.
   1. Llene una jeringa de 1 ml con la solución diluida de tinta china. Conecte una aguja de 27G y expulsar cualquier burbuja que esté presente en la jeringa.
   2. Inserte la aguja justo debajo de la membrana de la yema ~ 2 - 3 mm del embrión e inyecte ~ 0.2 ml de tinta india suavemente debajo del embrión. HacerNo inyecte más de 0,5 ml de tinta china, ya que puede disminuir la supervivencia del embrión.
3. Coloque el huevo con ventana en un porta-huevo debajo del microscopio de disección. Utilice la ampliación más alta para una mejor visualización del sitio de inyección del plásmido.
4. Usando fórceps, retire la membrana sobre el área de inyección. Las regiones auditivas del tallo cerebral de interés ( es decir , NM y NL) surgen de Rhombomeres 5 y 6 (R5 / R6). R5 / R6 se encuentran adyacentes a los otocistos (una estructura embrionaria en vertebrados que se desarrolla en el oído interno) que sirven como puntos de referencia para las inyecciones de plásmido R5 / R6.
5. Baje la pipeta llena de ADN en el tubo neural que recubre la región R5 / R6 y entre los otocitos usando el micromanipulador. En la figura 1A se muestra un esquema de colocación ideal.
6. Aplicar presión de aire (18 psi, 5 μs de duración) desde el picospritzer para expulsar el ADN en el tubo neural.

5. Electroporación

1. EncenderEl estimulador de corriente / voltaje.
2. Llene una jeringa de 3 ml con PBS y coloque el filtro de la jeringa. Añadir 1-2 gotas de PBS en el embrión.
3. Baje el electrodo bipolar al embrión utilizando el micromanipulador con el electrodo negativo por encima del punto de inyección (medial) y el electrodo positivo lateral al R5 / R6 ( Figura 1A ). Evite el contacto directo con el embrión. Utilice electrodos bipolares donde el material del electrodo sea platino iridio. Ajuste la distancia entre las puntas a 0,5 mm con pinzas.
4. Utilizando un estimulador de corriente / voltaje, pulse 20 veces a 50 V durante 1 ms a intervalos de 1 s.
5. Después de la electroporación, añadir una gota de PBS sobre el área expuesta. Retire suavemente el electrodo y límpielo con un tejido de laboratorio y etanol al 70%. Cierre la ventana exponiendo el embrión con cinta adhesiva.
6. Etiquetar la cáscara de huevo con el tipo de plásmido inyectado y la fecha de eclosión.
7. Coloque los huevos en la incubadora con el lado de la ventana hacia arriba. Incubar a 38 ° C con 50% De humedad hasta que se alcance la fase de desarrollo deseada.
8. Si un vector tet-on es electroporado para el control temporal de la expresión génica, aplique Doxycycline (Dox) cada 24 h para inducir la expresión génica (ver Sección 6).

6. Sistema Tet-on para el control temporal de la expresión génica

1. Utilizar los siguientes plásmidos:
   PCAGGS-T2TP: un plásmido que expresa la transposasa.
   PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plásmido que expresa de manera estable la proteína de unión a Dox.
   PT2K-BI-TRE-EGFP: un plásmido que contiene una expresión promotora de tet-on bidireccional (TRE) del reportero EGFP y un segundo gen de interés.
   NOTA: Los tres plásmidos anteriores tienen que ser co-electroporados en una relación 1: 1: 1.
2. Preparación de la solución madre:
   1. Disolver el Dox en PBS estéril para producir una solución madre de 1 mg / mL. Almacenar a -20 ° C.
3. Aplicación Dox:
   1. Para inducir el expresioN del gen de interés durante ciertas etapas de desarrollo, aplicar Dox cada 24 h.
   2. Al aplicar Dox, saque el huevo, abra la ventana, pipetee 50 μL de Dox sobre la membrana corioalointoica, cierre la ventana y vuelva a colocar el huevo en la incubadora.

7. Preparación de la zona de disección para las rebanadas de tronco encefálico

NOTA: Los siguientes apartados (7 - 9) y procedimientos han sido publicados antes de ¹⁴ . Consulte estas referencias para obtener información visual adicional.

1. Preparar una solución de agar (40 mg / ml de agarosa, es decir , 4% en ddH ₂ O). Vierta la solución de agar en una placa de Petri y deje que se solidifique a temperatura ambiente. Guarde la placa de agar cubierta en el refrigerador para su uso futuro durante el corte del tallo cerebral del tejido.
2. Flujo espinal cerebral artificial de burbujas continuas (ACSF) con 95% de O ₂ y 5% de CO ₂ (pH 7,2-7,4 y osmolaridad: 295-310 mOsm / L).
3. Limpiar el área de trabajo y vibratome con EtOH al 70% y enjuagar la cuchilla con agua destilada.
4. Coloque una almohadilla de absorción de líquidos limpia en el área de trabajo con las herramientas de disección apropiadas.
5. Saque la placa de agar de la nevera, corte un pequeño cubo de agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Pegue el bloque de agar a la etapa de una cámara vibratome-slicing usando superglue comercialmente disponible.

8. Aislamiento del tronco encefálico auditivo del pollo

1. Abra el huevo en el sitio de la ventana grabada. Perfore el saco de membrana con un bisturí y retire la cabeza del embrión de pollo.
2. Decapitar el pollo con las tijeras afiladas.
3. Coloque la punta de la hoja de afeitar ligeramente posterior a los ojos. Inciso a través del cráneo en la línea media rostral a caudal. Aplique una ligera presión dependiendo de la edad del embrión. Los embriones más viejos requieren más presión.
4. Empuje suavemente la piel y las plumas para exponer el cráneo y verifique el corte de la línea media.
5. AplicandoPresione la parte rostral del cráneo con una cuchilla de afeitar. Coloque inmediatamente la hoja posterior a los ojos y corte a través de todo el cráneo y el tejido cerebral.
6. Haga incisiones de la línea media a la lateral con tijeras en la región caudal del cráneo, ligeramente anterior a los músculos del cuello de ambos lados de la cabeza, exponiendo el cerebro y el cerebelo retirando el cráneo y el exceso de tejido.
7. Corte el tejido unido al tronco cerebral con unas tijeras y retire el tronco encefálico, que se desprende libremente del cráneo.

9. Preparación de rebanadas de tronco encefálico para la electrofisiología o imagenología in vivo

1. Pin abajo del tronco encefálico a través de la tecta óptica.
2. Retire el cerebelo cortando los pedúnculos con una tijera, exponiendo el suelo del cuarto ventrículo.
3. Usando pinzas, retire cualquier tejido membranoso y vasos sanguíneos de la superficie del tronco encefálico.
4. Para bloquear el tronco encefálico, haga un corte horizontal en el extremo más rostral del piso de los cuatroVentricular, sólo caudal a la corteza. Hacer cortes laterales perpendiculares a través de la tecta óptica para aislar el tronco encefálico.
5. Coloque una pequeña cantidad de super pegamento en la etapa vibratome directamente en frente del bloque de agar.
6. Levante el tronco encefálico en la médula espinal con pinzas y colóquelo en el super pegamento con el lado rostral hacia abajo y el lado dorsal hacia la lámina vibratomo. Retire el exceso de pegamento con un papel de laboratorio o papel de filtro.
7. Vierta ACSF oxigenado en la etapa vibratome. Coloque la cuchilla vibratome en un ángulo de 20-22 °. Comience vibratome en la oscilación de máxima amplitud. Mueva el escenario hacia la cuchilla para que la parte superior del tejido esté paralela a la hoja.
8. Rápidamente mueva la cuchilla hacia el tejido del tronco encefálico. Reduzca lentamente la hoja considerablemente antes de que la cuchilla entre en contacto con el tejido.
9. Corte el tejido con la velocidad de avance más lenta posible. Una vez que la cuchilla esté a través de toda la sección de tejido coronal, retire suavemente la rebanada usando una pipeta de transferencia
10. Baje la platina 200-300 μm y corte nuevamente. Repita hasta que las marcas anatómicas de los núcleos auditivos se vuelvan visibles, por ejemplo, la región distinta del neuropilo dorsal / ventral de NL y la localización medial de NM con respecto a NL.
11. Mantenga cuidadosamente las rebanadas en ACFS. Esto se puede hacer a temperatura ambiente (22 ° C) o cerca de condiciones fisiológicas (~ 41 ° C) usando un baño de agua caliente. Observe el orden de corte. La primera rebanada corresponde a la región más caudal del tejido y la última rebanada corresponde a la región más rostral. Esto representa aproximadamente la organización tonotópica del tronco encefálico auditivo, de regiones de codificación de baja a alta frecuencia, respectivamente.

Resultados

Se muestra aquí que en la electroporación ovo permite la expresión génica en un sistema biológico que se desarrolla normalmente. Los genes codificados por plásmidos se inyectan focalmente en el tubo neural que recubre R5 / R6. En la Figura 1A se muestra un ejemplo esquemático de las colocaciones de electrodo y pipeta con respecto a marcadores anatómicos importantes. La ubicación correcta de la inyección de plásmido se confirma 24 horas despu?...

Discusión

In ovo electroporación es un método de expresar o derribar los genes de interés con el fin de analizar in vivo la función génica [ ^{8 , 9]} . En el embrión de pollo, es un método innovador para expresar genes codificados por plásmidos en diferentes regiones auditivas del tronco cerebral ⁸ . Para asegurar una expresión óptima, se requieren varios pasos críticos. En primer lugar, sólo inyectar embriones cuyos oto...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm