In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Riepilogo

I neuroni uditivi uditivi degli aviani e dei mammiferi sono specializzati per la codifica neuronale veloce, un processo fondamentale per le normali funzioni uditive. Questi neuroni nascono da precursori distinti dell'indietro embrionale. Presentiamo tecniche che utilizzano elettroporazione per esprimere i geni nell'hindbrain degli embrioni di pollo per studiare la funzione genica durante lo sviluppo uditivo.

Abstract

L'elettroporazione è un metodo che introduce geni di interesse in organismi biologicamente rilevanti come l'embrione di pollo. È da tempo stabilito che l'embrione di pollo è un modello di ricerca efficace per studiare le funzioni biologiche di base dello sviluppo del sistema uditivo. Più di recente, l'embrione di pollo è diventato particolarmente prezioso nello studio dell'espressione genica, della regolazione e della funzione associata all'udito. L' elettroporazione in ovo può essere impiegata per individuare le regioni del sistema cerebrale uditivo responsabili di funzioni uditive altamente specializzate. Queste regioni includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM) e nucleo laminaris (NL). Neuroni NM e NL derivano da precursori distinti di rombomeri 5 e 6 (R5 / R6). Qui, presentiamo l'elettroporazione in ovo in geni codificati da plasmidi per studiare proprietà correlate al gene in queste regioni. Mostriamo un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'espressione genica che favorisce il guadagno o la perdita di fenotipo funzionalees. Targetando regioni di progenitor neurali uditive associate a R5 / R6, mostriamo la transfezione plasmida in NM e NL. La regolazione temporale dell'espressione genica può essere ottenuta adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox). La tecnica di elettroporazione in ovo , insieme con i test funzionali biochimici, farmacologici e in vivo , fornisce un approccio innovativo per lo studio dello sviluppo del neurone uditivo e dei fenomeni patofisiologici associati.

Introduzione

La codifica neurale veloce del suono è essenziale per le normali funzioni uditive. Queste includono abilità di localizzazione sonora ¹ , discorso in discriminazione di rumore ² e comprensione di altri segnali di comunicazione rilevati dal comportamento ³ . I neuroni analoghi situati nel sistema cerebrale uditivo sia degli aviani che dei mammiferi sono altamente specializzati per la codifica neuronale veloce ⁴ . Questi includono il nucleo di pollo magnocellularis (NM), il nucleo laminaris (NL) ei loro analoghi dei mammiferi, il nucleo cocleare anteroventrale (AVCN) e l'olio superiore mediale (MSO) rispettivamente ⁵ . Tuttavia, i meccanismi di sviluppo che regolano la codifica neuronale veloce sono poco compresi nel sistema cerebrale uditivo. Pertanto è vantaggioso studiare geni specifici responsabili della codifica veloce veloce al fine di comprendere meglio la loro espressione, regolazione e funzionalità in auLo sviluppo dei dati.

L'embrione di pollo in fase di sviluppo è uno strumento di ricerca efficace e consolidato per studiare le questioni biologiche fondamentali dello sviluppo del sistema uditivo ^{6 , 7} . Recenti progressi molecolari hanno affrontato queste questioni biologiche nell'embrione di pollo in fase di sviluppo esprimendo o abbattendo geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo ^{8 , 9} . Indagare sul ruolo di regolamentazione di geni specifici è un progresso significativo nella comprensione delle patologie associate a deficit auditari. Qui presentiamo l'elettroporazione in ovo di geni codificati da plasmide nel tronco uditivo del pollo dove si verifica una veloce codifica neurale del suono ¹⁰ . Targetando regioni neuroni uditive uditive associate ai rombomeri 5 e 6 ^{11 , 12} (R5 /R6), mostriamo il controllo spaziale della transfezione plasmida in NM e NL. Inoltre, mostriamo la regolazione temporale dell'espressione adottando un sistema vettoriale tet-on. Si tratta di una procedura indotta da droga che esprime i geni di interesse in presenza di doxiciclina (Dox) ⁸ .

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati di istruzione e tutela degli animali istituzionali dell'Università Northwestern e sono stati eseguiti in conformità alle istruzioni nazionali di istruzione per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Gestione dell'uovo

1. Acquistate uova fecondate da un venditore locale. Conservare le uova a 13 ° C in frigorifero per non più di 5 giorni prima dell'incubazione. La vitalità dell'embrione diminuisce significativamente dopo una settimana.
2. Girare ogni uovo con il 70% di etanolo prima di impostare nell'incubatrice.
3. Impostare 1-2 dozzine di uova sui loro lati in un incubatore con la temperatura impostata a 38 ° C a ~ 50% di umidità. Ciò garantisce rispettivamente il posizionamento appropriato dell'embrione per l'elettroporazione e la resistenza ottimale.
   NOTA: Dopo 48-52 h di incubazione, le uova saranno a Hamburger-Hamilton (HH) stadio ~ 12-13 e pronte per l'elettroporazione.

2. Preparazione

1. Plasmide Mixing
   1. Aggiungere 1 μl di 0,1% verde veloce (0,1% in 18 MΩ deionizzati e distillati H ₂ O [ddH ₂ O]) per ogni 7 μL di miscela DNA.
   2. Per la co-elettroporazione di plasmidi multipli, mescolare i plasmidi in un rapporto 1: 1. La concentrazione finale del DNA dovrebbe essere di 5-8 μg / μL.
2. Riempire la pipetta di iniezione
   1. Tirare pipette su un estrattore a micropipetti. Riempire la pipetta con 1-2 μL di plasmidi utilizzando un ago 28G a siringa.
   2. Piegare la punta della pipetta a 10 - 20 μm utilizzando le pinze. Utilizzare un microscopio per aiutare a determinare la dimensione della punta pipetta rotta. Fissare la pipetta sul supporto della pipetta del picospritzer.

3. Windowing

NOTA: La procedura di finitura è stata pubblicata prima del ¹³ . Per ulteriori informazioni visive, vedere il riferimento 13.

1. Pulire tutti gli strumenti e l'area di lavoro con il 70%etanolo.
2. Prendere il numero desiderato di uova impostate dall'incubatrice (tra 6-10), lasciare a temperatura ambiente e nuovamente sostituire le uova con il 70% di etanolo. Le uova rimangono vitali per almeno 2 ore dopo la rimozione dell'incubatrice.
3. Posizionare l'uovo in cima ad un illuminatore luminoso per identificare il posizionamento degli embrioni. Cerchi il centro della zona oscura ( cioè , embrione) con una matita.
4. Usando un ago da 19G, pungere un buco nella fine punta dell'uovo.
5. Punta un altro foro vicino al cerchio disegnato sul lato appuntito dell'uovo. Rimuovere un piccolo pezzo del guscio d'uovo esterno (circa 16 mm ² ) con l'ago 19G e quindi rimuovere un piccolo pezzo di guscio d'uovo interno (circa 8 mm ² ) con le pinze.
6. Con una siringa da 3 ml dotata di ago da 19G, prelevare 1,5-2,5 ml di albumina dall'uovo attraverso il foro a punta. Assicurarsi di inclinare l'ago a 45 °.
7. Coprire il foro a punta aperta con un piccolo pezzo di nastro (1 cm x 1 cm). Coprire il cerchio disegnato aD il secondo foro con nastro (2,5 cm x 4 cm).
8. Con forbici curve (bordo di taglio = 2,5 cm), tagliare una finestra all'interno del cerchio. Forbici devono essere parallele al guscio d'uovo e il diametro della finestra dovrebbe essere inferiore a 2 cm.

4. Iniezione del plasmide

1. Accendere il picospritzer. Impostare la pressione a 18 psi e la durata a 5 μs. Accendere il serbatoio dell'aria e la lampada per il microscopio di dissezione.
2. Preparare una soluzione di 30 ml di una diluizione 1:10 di inchiostro indiano acquistato in negozio mescolato in soluzione salina fosfata tamponata sterile (PBS). Conservare a 4 ° C. L'iniezione dell'inchiostro indiano è un passo importante per ottenere una migliore visualizzazione dell'embrione di pollo.
   1. Riempire una siringa da 1 ml con la soluzione di inchiostro indiana diluita. Fissare un ago 27G ed espellere tutte le bolle presenti nella siringa.
   2. Inserisci l'ago appena sotto la membrana di tuorlo ~ 2 - 3 mm dall'embrione e inietta ~ 0,2 ml di inchiostro indiano delicatamente sotto l'embrione. FareNon iniettare più di 0,5 ml dell'inchiostro indiano in quanto potrebbe diminuire la sopravvivenza dell'embrione.
3. Posizionare l'uovo finestra su un supporto di uova sotto il microscopio di dissezione. Utilizzate l'ingrandimento più elevato per ottenere una migliore visualizzazione del sito di iniezione del plasmide.
4. Usando le pinze, rimuovere la membrana nell'area di iniezione. Le regioni di interesse cerebrale uditivo di interesse (NM, NL) derivano dai Rhombomers 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 si trovano adiacenti agli otocisti (una struttura embrionale in vertebrati che si sviluppa nell'orecchio interno) che servono da punto di riferimento per le iniezioni di plasmidi R5 / R6.
5. Abbassare la pipetta riempita di DNA nel tubo neurale sovrastante la regione R5 / R6 e tra gli otociti usando il micromanipolatore. Uno schema di posizionamento ideale è mostrato in Figura 1A .
6. Applicare la pressione dell'aria (18 psi, 5 μs di durata) dal picospritzer per espellere il DNA nel tubo neurale.

5. Elettroporazione

1. Accendere tStimolatore corrente / tensione.
2. Riempire una siringa da 3 ml con PBS e fissare il filtro della siringa. Aggiungere 1-2 gocce di PBS sull'embrione.
3. Abbassare l'elettrodo bipolare sull'embrione utilizzando il micromanipolatore con l'elettrodo negativo sopra il sito di iniezione (mediale) e l'elettrodo positivo lateralmente all'R5 / R6 ( Figura 1A ). Evitare il contatto diretto con l'embrione. Usare elettrodi bipolari in cui il materiale dell'elettrodo è iridio di platino. Regolare la distanza tra le punte a 0,5 mm con le pinze.
4. Usando uno stimolatore di corrente / tensione, impulsi 20 volte a 50 V per 1 ms a intervalli di 1 s.
5. Dopo l'elettroporazione, aggiungere una goccia di PBS sopra l'area esposta. Rimuovere delicatamente l'elettrodo e pulirlo con un tessuto di laboratorio e il 70% di etanolo. Chiudere la finestra che espone l'embrione con nastro.
6. Etichetta guscio d'uovo con il tipo di plasmide iniettato e la data di apertura.
7. Riporre le uova in incubatore con il lato rivolto verso l'alto. Incubare a 38 ° C con 50% Di umidità fino a raggiungere la fase di sviluppo desiderata.
8. Se un vettore tet-on è elettroporato per il controllo temporale dell'espressione genica, applicare Doxycycline (Dox) ogni 24 h per indurre l'espressione del gene (vedere Sezione 6).

6. Sistema Tet-on per il controllo temporale dell'espressione di geni

1. Utilizzare i seguenti plasmidi:
   PCAGGS-T2TP: un plasmide esprimente di transposasi.
   PT2K-CAGGS-rtTA-M2: un plasmide che esprime in modo stabile la proteina legante Dox.
   PT2K-BI-TRE-EGFP: un plasmide che contiene un promotore bidirezionale di tet-on (TRE) -dirivante espressione del reporter di EGFP e di un secondo gene di interesse.
   NOTA: i tre plasmidi di cui sopra devono essere co-elettroporati in un rapporto 1: 1: 1.
2. Preparazione della soluzione di base:
   1. Sciogliere Dox in PBS sterile per produrre una soluzione di stock di 1 mg / ml. Conservare a -20 ° C.
3. Applicazione Dox:
   1. Per indurre l'espressioneN del gene di interesse durante alcune fasi di sviluppo, applicare Dox ogni 24 h.
   2. Quando si applica Dox, prelevare l'uovo, aprire la finestra, pipettare 50 μL Dox sulla membrana chorioallointoica, chiudere la finestra e mettere l'uovo in incubatore.

7. Preparazione dell'area di dissection per le fette del Brainstem

NOTA: Le seguenti sezioni (7 - 9) e le procedure sono state pubblicate prima del ¹⁴ . Consultare questi riferimenti per ulteriori informazioni visive.

1. Preparare una soluzione agar (40 mg / mL agarosio, ossia 4% in ddH2O). Versare la soluzione agarica in un piatto di Petri e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente. Conservare la piastra agar coperta in frigorifero per un uso futuro durante la tranciatura del tessuto cerebrale.
2. Fluido spinale cerebrale artificiale (ACSF) con 95% O ₂ e 5% CO ₂ (pH 7,2-7,4 e osmolarità: 295-310 mOsm / L).
3. Pulire l'area di lavoro e vibratome con il 70% EtOH e sciacquare la lama con acqua distillata.
4. Mettere un rilievo di assorbimento del liquido pulito sull'area di lavoro con strumenti appropriati di dissezione.
5. Prendete il piatto agar fuori dal frigorifero, tagliate un piccolo cubo di agar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Incollare il blocco agar allo stadio di una camera di taglio vibratome utilizzando superglue commercialmente disponibili.

8. Isolamento del Brainstem auditory del pollo

1. Apri l'uovo al sito della finestra con tappa. Puntare il sacchetto di membrana con un bisturi e togliere la testa dell'embrione di pollo.
2. Decapitate il pollo con forbici affilate.
3. Posizionare la punta della lama del rasoio leggermente posteriore agli occhi. Incise attraverso il cranio alla linea mediana rostral-caudale. Applicare una leggera pressione a seconda dell'età dell'embrione. Gli embrioni più anziani richiedono maggiore pressione.
4. Spingere delicatamente la pelle e le piume per esporre il cranio e verificare la taglia della linea mediana.
5. Applicare sPressione del tronco, tagliare la porzione rostrale del cranio con una lama di rasoio. Immediatamente posizionare la lama posteriore agli occhi e tagliare tutto il cranio e il tessuto cerebrale.
6. Fare incisioni midline-to-lateral con forbici nella zona caudale del cranio, leggermente anteriori ai muscoli del collo su entrambi i lati della testa. Esponete il cervello e il cervelletto tirando via il cranio e il tessuto in eccesso.
7. Tagliare il tessuto attaccato al tronco cerebrale con forbici e rimuovere il tronco cerebrale, che si libera liberamente dal cranio.

9. Preparazione delle fette del Brainstem per l'elettrofisiologia o l'imaging in vivo

1. Infilare il cervello attraverso la tecnica ottica.
2. Rimuovere il cervelletto tagliando peduncle con forbici, esponendo il pavimento del quarto ventricolo.
3. Usando le pinzette, rimuovete i tessuti membranosi e i vasi sanguigni dalla superficie cerebrale.
4. Per bloccare il sistema cerebrale, fare un taglio orizzontale all'estremità più rostrale del pavimento dei quattroVentricolo, appena caudale alla corteccia. Fare tagli laterali perpendicolari attraverso l'ottica tecta per isolare il sistema cerebrale.
5. Posizionare una piccola quantità di colla super sullo stadio vibrativo direttamente di fronte al blocco agar.
6. Sollevare il tronco cerebrale al midollo spinale usando le pinzette e posizionarlo sulla colla super con il lato rostralo verso il basso e il lato dorsale verso la lama vibratome. Rimuovere la colla in eccesso con un tessuto di laboratorio o carta filtrante.
7. Versare l'ACSF ossigenato nella fase vibratome. Impostare la lama del vibratore ad un angolo di 20-22 °. Avviare il vibratore ad oscillazione massima-ampiezza. Spostare il palco verso la lama in modo che la parte superiore del tessuto sia parallela alla lama.
8. Spostare rapidamente la lama verso il tessuto cerebrale. Rallenta lentamente la lama prima del contatto della lama con il tessuto.
9. Togliere il tessuto con la velocità di avanzamento più lenta possibile. Una volta che la lama attraversa l'intera sezione del tessuto coronale, rimuovere delicatamente la fetta usando una pipetta di trasferimento/ Li>
10. Abbassare lo stadio 200-300 μm e tagliare di nuovo. Ripetere fino a quando non saranno visibili punti di riferimento anatomici dei nuclei uditivi, ad esempio la distinta regione nervosa dorsale / ventrale della NL e la posizione media di NM rispetto alla NL.
11. Conservare con attenzione le fette in ACFS. Ciò può essere fatto a temperatura ambiente (22 ° C) o vicino a condizioni fisiologiche (~ 41 ° C) usando un bagno d'acqua caldo. Notare l'ordine di affettatura. La prima fetta corrisponde alla regione più caudale del tessuto e l'ultima fetta corrisponde alla regione più rostrale. Questo rappresenta approssimativamente l'organizzazione tonotopica del sistema cerebrale uditivo, da regioni di codifica a bassa frequenza ad alta frequenza.

Risultati

Qui mostriamo che l'elettroporazione in ovo consente l'espressione genica in un sistema biologico normalmente sviluppato. I geni codificati con plasmide vengono iniettati focalamente nel tubo neurale sovrastante R5 / R6. Un esempio schematico delle posizioni dell'elettrodo e delle pipette relative a importanti marcatori anatomici è mostrato nella figura 1A . La posizione corretta dell'iniezione del plasmide è confermata 24 h dopo l'elettrop...

Discussione

L' elettroporazione in ovo è un metodo per esprimere o abbattere i geni di interesse per analizzare la funzione genica in vivo ^{8 , 9} . Nell'embrione di pollo, è un metodo innovativo per esprimere geni codificati da plasmide in diverse regioni del sistema cerebrale uditivo ⁸ . Per garantire un'espressione ottimale, sono necessari diversi passaggi critici. In primo luogo, solo iniettare gli embrioni ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm