Tavuk İşitsel Beyinsapındaki Ovo Elektroporasyonunda

Özet

Kuş ve memelilerin işitsel beyin sapı nöronları, normal işitme işlevleri için temel bir süreç olan hızlı sinirsel kodlama için uzmanlaşmıştır. Bu nöronlar, embriyonik arka bedenin belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. İşitme gelişiminde gen işlevini incelemek için tavuk embriyolarının arka bacasında genleri ifade etmek için elektroporasyon teknikleri sunuyoruz.

Özet

Elektroporasyon, genleri tavuk embriyo gibi biyolojik açıdan önemli organizmalara tanıtan bir yöntemdir. Tavuk embriyonunun işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik işlevlerini incelemek için etkili bir araştırma modeli olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Daha yakın zamanlarda, tavuk embriyo, işitme ile ilişkili gen ekspresyonu, düzenlenmesi ve işlevinin incelenmesinde özellikle değerli hale geldi. Ovo elektroporasyonu, son derece uzmanlaşmış işitme işlevlerinden sorumlu işitsel beyin sapı bölgelerini hedeflemek için kullanılabilir. Bu bölgeler tavuk çekirdeği magnocellularis (NM) ve çekirdek laminaris (NL) içerir. NM ve NL nöronları rhombomerlerin 5 ve 6 (R5 / R6) 'nın belirgin öncüllerinden kaynaklanmaktadır. Burada, bu bölgelerdeki gen ile ilgili özellikleri incelemek için plasmidle kodlanmış genlerin ovo elektroporasyonunda sunuluyoruz. Fonksiyonel fenotipin kazanılmasını veya kaybedilmesini teşvik eden, gen ifadesinin mekânsal ve zamansal kontrolü için bir yöntem gösteriyoruzes. R5 / R6 ile ilişkili işitsel nöral progenitör bölgeleri hedefleyerek, NM ve NL'de plazmid transfeksiyonunu gösteririz. Gen ekspresyonunun zamansal regülasyonu bir tet-on vektör sistemi benimseyerek başarılabilir. Bu, doksisiklinin (Dox) varlığında ilgilenilen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür. İn ovo elektroporasyon tekniği - ya biyokimyasal, farmakolojik ve / veya in vivo fonksiyonel testlerle - birlikte, işitsel nöron gelişimini ve buna bağlı patofizyolojik olayları incelemek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar.

Giriş

Sesin hızlı sinirsel kodlaması normal işitme işlevleri için gereklidir. Bunlar arasında ses lokalizasyon yetenekleri ¹ , gürültü ayırımı ^2'deki konuşma ve davranışsal olarak diğer iletişim sinyallerinin anlaşılması ^{3 bulunur} . Hem kuşların hem de memelilerin işitsel beyin sapında bulunan benzer nöronlar, hızlı sinirsel kodlama ⁴ için son derece uzmanlaşmıştır. Tavuk çekirdeği magnocellularis (NM), çekirdek laminaris (NL) ve bunların memeli analogları, anteroventral koklear çekirdek (AVCN) ve sırasıyla medial superior zeytin (MSO) ^{5 içerir} . Bununla birlikte, hızlı sinirsel kodlamayı düzenleyen gelişim mekanizmaları, işitsel beyin sapında çok az anlaşılmıştır. Bu nedenle, hızlı inal kodlamadan sorumlu belirli genleri au'da ifade, düzenleme ve işlevlerini daha iyi anlamak için incelemek avantajlıdırDitory gelişme.

Gelişmekte olan tavuk embriyo, işitsel sistem gelişiminin temel biyolojik sorularını incelemek için etkili ve köklü bir araştırma aracıdır ^{6 , 7} . Son moleküler ilerlemeler, gelişmekte olan tavuk embriyosundaki bu biyolojik soruları , in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri çürüterek veya çürüterek ele almıştır ^8,9 . Spesifik genlerin düzenleyici rolünün araştırılması, işitsel açıklarla ilişkili patolojilerin anlaşılmasında önemli bir gelişmedir. Burada, plazmid kodlu genlerin, hızlı nöral ses kodlamasının gerçekleştiği tavuk işitme beyin sapı içine ovo elektroporasyonunda sunuyoruz. 5 ve 6 no.lu rhombomeres ^{11 , 12} ile birlikte görülen işitsel sinirsel progenitör bölgeleri hedef alarak (R5 /R6), biz NM ve NL plazmid transfeksiyon mekansal kontrol göstermektedir. Buna ek olarak, bir tet-on vektör sistemi benimseyerek ifadenin zamansal düzenlenişini gösteriyoruz. Bu, doksisiklinin (Dox) ⁸ varlığında ilgilenen genleri ifade eden bir uyuşturucu ile uyarılabilir prosedürdür.

Protokol

Tüm prosedürler Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanmış ve Ulusal Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Sağlık Rehberleri Ulusal Enstitüleri uyarınca gerçekleştirilmiştir.

1. Yumurta Taşıma

1. Gübrelenmiş yumurtaları yerel bir satıcıdan satın alın. Kuluçka öncesi en fazla 5 gün boyunca yumurtaları 13 ° C'de bir buzdolabında saklayın. Embriyo canlılığı, 1 hafta sonra belirgin şekilde azalır.
2. Kuluçka makinesi koymadan önce her yumurta% 70 etanol ile sürün.
3. Yaklaşık% 50 nemde sıcaklık 38 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde 1-2 düzine yumurta koyun. Bu, sırasıyla, elektroporasyon ve uygun canlılık için uygun embriyo konumlandırma sağlar.
   NOT: 48-52 saat kuluçkadan sonra, yumurtalar ~ 12-13 Hamburger-Hamilton (HH) evresinde olacak ve elektroporasyon için hazır olacaktır.

2. Hazırlık

1. Mi plazmasıxing
   1. Her 7 mcL DNA karışımı için 1 μL% 0.1 hızlı yeşil (18 MΩ deiyonize ve damıtılmış H2O [ddH2O] içinde% 0.1) ilave edin.
   2. Birden çok plazmitin birlikte elektroporasyonu için plazmidleri 1: 1 oranında karıştırın. Nihai DNA konsantrasyonu 5-8 μg / μL olmalıdır.
2. Dolgu Enjeksiyonlu Pipet
   1. Bir mikropipet çekicide pipetleri çekin. Bir 28G şırınga iğnesi kullanarak 1-2 mcL plazmid pipet doldurun.
   2. Forsep kullanarak pipet ucunu 10 - 20 μm'ye kadar kesin. Kırılmış pipet ucunun boyutunu belirlemenize yardımcı olması için bir mikroskop kullanın. Pikspiritör pipet tutucusuna pipet takın.

3. Pencereleme

NOT: Pencereleme prosedürü 13'ten önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen referans 13'e bakınız.

1. Tüm malzemeleri ve çalışma alanını% 70etanol.
2. Kuluçka makinesinden istenilen sayıda yumurta alın (6-10 arası), oda sıcaklığında bırakın ve ayrı ayrı% 70 etanol içeren yumurtaları sürün. Kuluçka makinesinin çıkartılmasından sonra yumurtalar en az 2 saat süreyle canlı kalır.
3. Embriyo konumlandırmayı tanımlamak için yumurtayı hafif bir aydınlatıcının üzerine yerleştirin. Karanlık bölgenin merkezini ( yani embriyo) bir kurşun kalemle daire haline getirin.
4. Bir 19G iğne kullanarak, yumurtanın künt ucundaki bir delik açın.
5. Yumurtanın sivri tarafındaki çizilmiş çemberin yakınındaki bir başka delik açın. 19G iğne ile dış yumurta kabı (yaklaşık 16 mm ² ) küçük bir parça çıkarın ve sonra forseps ile iç yumurta kabuğunun (yaklaşık 8 mm ² ) küçük bir parça çıkarın.
6. 19G'lik bir iğne takılmış 3 mL şırınga ile yumurtadan künt uç deliğinden 1.5-2.5 mL albümini geri çekin. İğneyi 45 ° açıyla aşağıya açtığınızdan emin olun.
7. Kör uç deliğini küçük bir bant parçası (1 cm x 1 cm) ile örtün. Çizilen daireyi veD ikinci deliğin bantla (2.5 cm x 4 cm).
8. Kıvrımlı makas (kesme kenarı = 2.5 cm) ile, bir pencereyi daire içinde kesin. Makas yumurta kabuğuna paralel olmalıdır ve pencerenin çapı 2 cm'den az olmalıdır.

4. Plasmid Enjeksiyonu

1. Pikristin cihazını açın. Basıncı 18 psi ve süresi 5 μs olarak ayarlayın. Diseksiyon mikroskopu için hava tankını ve lambayı açın.
2. Steril fosfat tamponlu salin (PBS) içinde karışık bir mağaza satın Hint mürekkebi 1: 10 seyreltme 30 ml stok solüsyonu olun. 4 ° C'de saklayın. Hint mürekkebinin enjeksiyonu, tavuk embriyonunun daha iyi görselleştirilmesi için önemli bir adımdır.
   1. Seyreltilmiş Hint mürekkebi çözeltisi ile 1 mL şırınga doldurun. 27G'lik bir iğne takın ve şırıngadaki mevcut kabarcığı dışarı atın.
   2. Embriyonun 2-3 mm kadar solüsyonunu hemen sarısı membranın altına yerleştirin ve ~ 0.2 mL Hint mürekkebi yavaşça embriyo altına enjekte edin. YapEmbriyonun sağkalımını azaltabileceğinden, Hint mürekkebinin 0.5 mL'den daha fazla enjekte edilmemelidir.
3. Pencere yumurta diseksiyon mikroskopu altında bir yumurta tutucu yerleştirin. Plazmid enjeksiyon bölgesinin en iyi görselleştirilmesi için en yüksek büyütmeyi kullanın.
4. Forseps kullanarak membranı enjeksiyon bölgesi üzerinden çıkarın. Dikkat çekici işitsel beyin sapı bölgeleri ( ör . NM ve NL) Rhombomeres 5 ve 6'dan (R5 / R6) ortaya çıkar. R5 / R6, R5 / R6 plasmid enjeksiyonları için yer işaretleri olarak görev yapan otokistlere (omurgalılarda embriyonik yapı, iç kulağa doğru gelişir) bitişik olarak bulunur.
5. DNA dolgulu pipeti, R5 / R6 bölgesini örten sinir tüpüne ve mikromanipülatörü kullanarak otokistler arasına indirin. Şekil 1A'da ideal yerleşim şeması gösterilmektedir.
6. Sinir tüpünde DNA çıkarmak için pikspritzerden hava basıncı (18 psi, 5 μs süre) uygulayın.

5. Elektroporasyon

1. Aç şunuO akım / voltaj uyarıcısı.
2. PBS ile 3 mL enjektör doldurun ve şırınga filtresini takın. Embriyo üzerine 1-2 damla PBS ekleyin.
3. Enjeksiyon yerinin üstünde negatif elektrot (medial) ve R5 / R6'ya ( Şekil 1A ) yan tarafta bulunan pozitif elektrot ile mikromanipülatörü kullanarak bipolar elektrodu embriyoya indirin. Embriyo ile doğrudan temastan kaçının. Elektrot malzemesinin platinyum iridyum olduğu yerde iki kutuplu elektrot kullanın. İpuçları arasındaki boşluğu forseps ile 0,5 mm'ye ayarlayın.
4. Bir akım / voltaj uyarıcısı kullanarak, 1 sn aralıklarla 1 ms için 50 V'de 20 kez darbe uygulayın.
5. Elektroporasyondan sonra, maruz kalan alanın üzerine bir damla PBS ekleyin. Nazikçe elektrodu çıkarın ve bir laboratuvar dokusu ve% 70 etanol ile temizleyin. Bez ile embriyo ortaya pencere kapatın.
6. Enjekte edilen plasmid tipi ve kuluçka tarihi ile yumurta kabuğunu etiketleyin.
7. Pencereyi yukarı gelecek şekilde yumurtaları kuluçka makinesine yerleştirin. 38 ° C'de 50 ° C'de inkübe edinİstenen gelişim aşamasına gelene kadar nem%.
8. Bir tet-on vektörü, gen ekspresyonunun zamansal kontrolü için elektroporasyona tabi tutulursa, gen ekspresyonunu başlatmak için 24 saatte bir Doxycycline (Dox) uygulayın (bkz. Bölüm 6).

6. Gen İfadesinin Zamansal Kontrolü için Tet-On Sistemi

1. Aşağıdaki plazmidleri kullanın:
   PCAGGS-T2TP: bir transposaz ifade eden plasmid.
   PT2K-CAGGS-rtTA-M2: Dox bağlayıcı proteini istikrarlı bir şekilde ifade eden bir plazmid.
   PT2K-BI-TRE-EGFP: EGFP raportörünün ve ilgili ikinci bir genin çift yönlü tet-on promotörünü (TRE) tetikleyen ekspresyonunu içeren bir plazmid.
   NOT: Yukarıdaki üç plasmidin 1: 1: 1 oranla birlikte elektroporasyona tabi tutulması gerekir.
2. Stok çözeltisi hazırlama:
   1. 1 mg / mL stok çözeltisi üretmek için Dox steril PBS'de eritilir. -20 ° C'de saklayın.
3. Dox uygulaması:
   1. Ekspiroyu teşvik etmekBelirli gelişim evreleri boyunca ilgilenilen genin n'si Dox'u 24 saatte bir uygulayın.
   2. Dox uygularken, yumurtayı çıkarın, pencereyi açın, 50 uL Dox'u koryoarotomatik zara pipetleyin, pencereyi kapatın ve kuluçka makinesine yumurtayı geri koyun.

7. Beyin Fırtınası Dilimleri İçin Diseksiyon Alanının Hazırlanması

NOT: Aşağıdaki bölümler (7 - 9) ve prosedürler 14'den önce yayınlanmıştır. Ek görsel bilgi için lütfen bu referanslara bakın.

1. Bir agar solüsyonu hazırlayın (40 mg / mL agaroz, yani % 4 ddH20). Agar solüsyonunu bir Petri kabına dökün ve oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Dokunun beyin sapı dilimlemesi sırasında gelecekte kullanılmak üzere kapalı agar plakasını buzdolabında saklayın.
2. Yapay serebral omurga sıvısı (ACSF)% 95 O ₂ ve% 5 CO ₂ (pH 7.2-7.4 ve ozmolarite: 295-310 mOsm / L) sürekli kabarcıklar.
3. Çalışma alanını ve vibratomu% 70 EtOH ile temizleyin ve bıçağı damıtılmış su ile durulayın.
4. Uygun diseksiyon aletleri ile çalışma alanına temiz bir sıvı emici ped koyun.
5. Agar plakasını buzdolabından alın, küçük bir agar küveti kesin (10 mm x 10 mm x 8 mm). Ticari olarak mevcut superglue kullanarak bir vibratome dilimleme odasının aşamasına agar blok Tutkal.

8. Tavuk İşitsel Beyin Fırtınasının İzolasyonu

1. Yumurtayı bantlanmış pencere alanından açın. Membran kese bir neşter ile delin ve tavuk embriyo başını çıkarın.
2. Tavuğu keskin makasla kes.
3. Tıraş bıçağı ucunu gözlerin arkasından hafifçe yerleştirin. Kafatası ile kaudal orta çizgide kafatası yoluyla incise edin. Embriyonun yaşına bağlı olarak hafif basınç uygulayın. Eski embriyolar daha fazla baskı gerektirir.
4. Kafatasını ortaya çıkarmak ve orta hat kesimini doğrulamak için yavaşça cildi ve tüyleri itin.
5. UygulanıyorTrunk basıncında, kafatasının rostral bölümünü bir ustura bıçağı ile kes. Bıçağı hemen gözlerin arkasına yerleştirin ve tüm kafatası ve beyin dokusunu kesin.
6. Başın iki yanındaki boyun kaslarının biraz önündeki, kafatasının kaudal bölgesindeki makasla orta hattan insana insizyon yapın.Kafatasını ve fazla dokuyu çekerek beyin ve beyinciği açığa çıkarın.
7. Makasla beyin sapına yapışmış dokuyu kesin ve kafatasından rahatça ayıran beyin sapını çıkarın.

9. İnvivo Elektrofizyoloji veya Görüntüleme için Beyin Fırtınası Dilimlerinin Hazırlanması

1. Beyin sapını optik tectadan geçirin.
2. Serebellumu, dördüncü ventrikülün zemini açığa vurarak, makaslarla pedankülleri keserek çıkarın.
3. Cımbız kullanarak, membranöz doku ve kan damarlarını beyin sapı yüzeyinden çıkarın.
4. Beyin kökeneğini engellemek için, dört katın en rostral ucunda yatay bir kesim yapınKortekste sadece kaudal olan ventrikül. Beyin sapını izole etmek için optik tecta lateral kesikler dikey yapın.
5. Agar bloğunun hemen önündeki vibratome sahnesine az miktarda süper tutkal yerleştirin.
6. Cımbız kullanarak omurgadaki beyin sapını kaldırın ve rostral yüzü aşağı bakan ve dorsal tarafı vibratome bıçağına doğru tutturun. Fazla tutkal bir laboratuvar dokusu veya filtre kağıdı ile çıkarın.
7. Vibrasyonlu sahneye oksijenli ACSF dökün. Vibrasyonlu bıçağı 20-22 ° açı ile ayarlayın. Maksimum genlik salınımında vibratome başlatın. Sahneyi bıçağa doğru yukarı hareket ettirin, böylece dokunun üst kısmı bıçakla paraleldir.
8. Bıçağı beyin sapı dokusuna doğru hızla hareket ettirin. Bıçağın doku ile temasından önce bıçağı yavaşça yavaşlatın.
9. Doku mümkün olan en yavaş ilerleme hızıyla kes. Bıçak tüm koronal doku bölümünden geçtikten sonra, bir transfer pipetini kullanarak dilimi hafifçe çıkarın.
10. Aşamayı 200-300 μm altına indirin ve tekrar dilimleyin. İşitsel çekirdeklerin anatomik işaretleri görünene kadar tekrarlayın; örneğin, NL'nin belirgin dorsal / ventral nöropil bölgesi ve NM'nin NL'ye göre medial konumu.
11. ACFS'de dilimleri dikkatlice muhafaza edin. Bu oda sıcaklığında (22 ° C) veya fizyolojik koşulların (~ 41 ° C) sıcak su banyosu kullanılarak yapılabilir. Dilimleme sırasına dikkat edin. İlk dilim en kaudal doku bölgesine karşılık gelir ve son dilim en rostral bölgeye karşılık gelir. Bu kabaca sırasıyla düşük frekanslı frekans bölgelerinden yüksek frekanslı kodlama bölgelerine yapılan işitsel beyin sapının tonotopik organizasyonunu temsil eder.

Sonuçlar

Ovo elektroporasyonunda normal olarak gelişen bir biyolojik sistemde gen ifadesine izin verdiğini burada gösteriyoruz. Plasmid ile kodlanmış genler, R5 / R6 üzerinde bulunan sinir tüpüne fokal olarak enjekte edilir. Önemli anatomik belirteçlere göre elektrod ve pipet yerleşimlerinin şematik bir örneği Şekil 1A'da gösterilmiştir. Plazmid enjeksiyonunun doğru konumu, elektroporasyondan 24 saat sonra doğrulanır ve Şekil 1B'de

Tartışmalar

Ovo elektroporasyonunda in vivo gen fonksiyonunu analiz etmek için ilgi genleri eksprese eden veya yere seren bir yöntem ^{8 , 9} . Tavuk embriyosunda plazmid kodlu genleri farklı işitsel beyin sapı bölgelerinde ifade etmek için yenilikçi bir yöntem ⁸ . Optimal ifade sağlamak için birkaç kritik adım gereklidir. İlk olarak, yalnızca otokistleri açıkça görülen embriyolar enjekte edin. Otokistler görünür...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm