鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

要約

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。

要約

エレクトロポレーションは、ニワトリ胚のような生物学的に関連する生物に関心のある遺伝子を導入する方法である。ニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的機能を研究するための有効な研究モデルであることは長い間確立されている。より最近では、ニワトリ胚は、聴覚に関連する遺伝子発現、調節および機能の研究において特に価値があるようになった。 卵内では、エレクトロポレーションを用いて、高度に特殊化された聴覚機能を担う聴性脳幹領域を標的とすることができる。これらの領域は、ニワトリ核magnocellularis（NM）および核laminaris（NL）を含む。 NMおよびNLニューロンは、菱形5および6（R5 / R6）の別個の前駆体から生じる。ここでは、これらの領域における遺伝子関連特性を研究するために、プラスミドコード遺伝子の卵内エレクトロポレーションを提示する。我々は、機能的表現型の増加または減少のいずれかを促進する遺伝子発現の空間的および時間的制御のための方法を示すes。 R5 / R6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することにより、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションを示す。遺伝子発現の時間的調節は、tet-onベクターシステムを採用することによって達成することができる。これは、ドキシサイクリン（Dox）の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘発性の手順である。 インビボでのエレクトロポレーション技術は、生化学的、薬理学的、および/または生体内での機能アッセイとともに、聴覚ニューロン発達および関連する病態生理学的現象を研究する革新的なアプローチを提供する。

概要

正常な聴覚機能のためには、音声の高速神経符号化が不可欠です。これには、音の定位能力¹ 、騒音弁別^2の声音、および他の行動関連の通信信号^3の理解が含まれる。鳥類および哺乳動物の聴性脳幹に位置する類似のニューロンは、高速神経エンコーディングに高度に特化されています⁴ 。これらには、ニワトリ核大細胞膜（NM）、核薄片（NL）およびそれらの哺乳類類似体、前庭内蝸牛核（AVCN）および内上位オリーブ（MSO）が含まれる。しかし、聴性脳幹では、速い神経のコード化を制御する発達メカニズムはほとんど理解されていない。したがって、auにおける発現、調節および機能をよりよく理解するためには、速い神経のコード化に関与する特定の遺伝子を研究することが有利である誕生日の開発。

発育中のニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的問題を研究するための効果的かつ確立された研究ツール^{である 6,7} 。近年の分子進歩は、インビボ遺伝子機能を解析するために興味のある遺伝子を発現またはノックダウンすることにより、ニワトリ胚の発生におけるこれらの生物学的問題に対処している。特定の遺伝子の調節的役割を調べることは、聴力障害に関連する病理を理解する上で重要な進歩です。ここでは、プラスミドエンコードされた遺伝子の卵内電気穿孔法を、鶏の聴覚脳幹に提示し、速い神経のコード化が起こる¹⁰ 。菱形5および6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することによって11,12（R5 /R6）、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションの空間的制御を示す。さらに、tet-onベクターシステムを採用することにより、発現の時間的調節を示す。これは、ドキシサイクリン（Dox） ^8の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘導性の手順である。

プロトコル

すべての手順は、ノースウェスタン大学機関動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドラインに従って実施された。

1.卵の取り扱い

1. 地元の業者から受精卵を購入する。インキュベーションの5日前まで冷蔵庫に13°Cで卵を保管してください。胚の生存率は1週間後に著しく低下する。
2. インキュベーターにセットする前に各卵を70％エタノールで拭く。
3. インキュベーター内の温度を38℃に設定し、約50％の湿度で1~2ダースの卵を両側に置きます。これは、電気穿孔および最適生存率のための適切な胚の位置を確実にする。
   注：インキュベーションの48〜52時間後、卵はハンバーガー - ハミルトン（HH）ステージ〜12〜13にあり、エレクトロポレーションの準備ができます。

2.準備

1. プラスミドMi明
   1. DNA混合物7μLごとに1μLの0.1％高速緑色（18MΩ脱イオン化および蒸留H ₂ O [ddH ₂ O]中0.1％）を加える。
   2. 複数のプラスミドの同時エレクトロポレーションのために、プラスミドを1：1の比率で混合する。最終的なDNA濃度は5〜8μg/μLでなければなりません。
2. 注入ピペットを充填する
   1. マイクロピペットプーラーでピペットを引っ張ります。 28Gシリンジ針を用いて1-2μLのプラスミドでピペットを満たします。
   2. 鉗子を使用してピペットチップを10〜20μmに破る。壊れたピペットチップのサイズを決定するのを助けるために顕微鏡を使用してください。ピコスプライザーのピペットホルダーにピペットを取り付けます。

3.ウィンドウ処理

注：ウィンドウ処理手順は、 ¹³より前に公開されています。追加のビジュアル情報については、参考文献13を参照してください。

1. すべての楽器と作業領域を70％エタノール。
2. インキュベーターから所望の数の卵を取り出し（室温で放置）、70％エタノールで卵を個別に拭きます。インキュベーターを取り外した後、少なくとも2時間は卵を生存させる。
3. 胚の位置を特定するために卵を照明器具の上に置く。暗い領域（ すなわち 、胚）の中心を鉛筆で囲む。
4. 19G針を使用して、卵の鈍い端に穴を開ける。
5. 卵の尖った側に描かれた円の近くに別の穴を突き刺す。 19Gの針で外卵殻（約16mm ² ）の小さな部分を削除し、鉗子で内側の卵殻（約8mm ² ）の小さな部分を削除します。
6. 19G針を装着した3mLシリンジで、平滑末端の穴を通して卵から1.5-2.5mLのアルブミンを取り出します。ニードルを45°に傾けてください。
7. 平滑末端の穴を小さなテープ（1cm×1cm）で覆ってください。描かれた円を覆うテープで2番目の穴（2.5 cm x 4 cm）。
8. 湾曲したはさみ（刃先= 2.5cm）で、円内の窓を切断します。はさみは卵殻に平行で、窓の直径は2cm未満でなければなりません。

プラスミド注入

1. picospritzerをオンにします。圧力を18 psiに、持続時間を5μsに設定します。解剖顕微鏡用のエアータンクとランプを点灯させます。
2. 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に混合した店頭購入インディアンインクを1:10に希釈した30 mLストック溶液を調製する。 4℃で保存する。インディアンインクの注入は、ニワトリ胚のより良い可視化を得るための重要なステップです。
   1. 希釈したインディアンインク溶液で1 mLシリンジを満たします。 27Gの針を取り付けて、シリンジに入っている気泡を追い出す。
   2. 胚から2〜3mmの卵黄膜のすぐ下に針を挿入し、胚の下に約0.2mLのインディアンインクを注射する。行う胚の生存率を低下させる可能性があるため、インディアンインクを0.5 mL以上注入しないでください。
3. 解剖顕微鏡の下の卵のホルダーに窓の卵を置きます。プラスミドの注入部位を最もよく視覚化するには、最高倍率を使用します。
4. 鉗子を使用して、注入領域上の膜を除去する。興味のある聴性脳幹領域（NMおよびNL）はRhombomeres 5および6（R5 / R6）から生じる。 R5 / R6は、R5 / R6プラスミド注入のランドマークとして役立つ耳鞘（内耳に発生する脊椎動物の胚構造）に隣接して位置する。
5. マイクロマニピュレーターを使用して、R5 / R6領域と卵胞嚢の間にある神経管にDNA充填ピペットを下ろします。理想的な配置の模式図を図1Aに示します。
6. ピコスプライザーから空気圧（18psi、5μs持続時間）をかけて神経管内のDNAを放出させる。

5.エレクトロポレーション

1. tをオンにする彼は電流/電圧刺激装置である。
2. PBSで3 mLシリンジを満たし、シリンジフィルターを取り付けます。胚にPBSを1〜2滴加える。
3. 注射部位（内側）の上の陰性電極とR5 / R6（ 図1A ）の側方の陽電極とを有するマイクロマニピュレーターを用いて双極電極を胚に下げる。胚との直接接触を避ける。電極材料が白金イリジウムであるバイポーラ電極を使用する。鉗子で先端間の間隔を0.5 mmに調整する。
4. 電流/電圧刺激装置を使用して、50Vで1秒間に1秒の間隔で20回パルスする。
5. エレクトロポレーションの後、露出した領域に1滴のPBSを加える。静かに電極を取り出し、実験室の組織と70％エタノールで拭いてください。胚をテープで露出させたウィンドウを閉じます。
6. 注入されたプラスミドの種類と孵化日で卵殻にラベルを付ける。
7. ウインドウを上にしてインキュベーターに卵を戻します。 38℃で50℃でインキュベートする所望の発達段階に達するまで湿度％。
8. tet-onベクターを遺伝子発現の一時的な制御のためにエレクトロポレーションする場合、遺伝子発現を誘導するために24時間毎にDoxycycline（Dox）を適用する（セクション6参照）。

6.遺伝子発現の時間制御のためのテット・オン・システム

1. 以下のプラスミドを使用してください：
   pCAGGS-T2TP：プラスミドを発現するトランスポザーゼ。
   pT2K-CAGGS-rtTA-M2：Dox結合タンパク質を安定に発現するプラスミド。
   pT2K-BI-TRE-EGFP：EGFPレポーターおよび目的の第2の遺伝子の双方向tet-onプロモーター（TRE）駆動発現を含むプラスミド。
   注：上記3つのプラスミドは、1：1：1の比で共エレクトロポレーションする必要があります。
2. ストック溶液調製：
   1. Doxを滅菌PBSに溶解して、1 mg / mLのストック溶液を調製する。 -20℃で保存する。
3. Doxアプリケーション：
   1. 表現を誘導する24時間ごとにDoxを適用する。
   2. Doxを適用するときは、卵を取り出し、窓を開き、Dorox50μLを腎臓の腎臓の膜にピペットで移し、窓を閉じてインキュベーターに戻します。

脳幹スライスの解剖領域の準備

注記：以下のセクション（7-9）および手順は¹⁴日前に公開されています。追加のビジュアル情報については、これらの参考文献を参照してください。

1. 寒天溶液（40mg / mLアガロース、 すなわち ddH ₂ O中4％）を調製する。ペトリ皿に寒天溶液を注ぎ、室温で凝固させます。組織の脳幹スライスの間の将来の使用のために、寒天プレートを冷蔵庫に保存する。
2. 95％O ₂および5％CO ₂ （pH 7.2-7.4およびオスモル濃度：295〜310mOsm / L）を有する人工大脳脊髄液（ACSF）を連続的に泡立てる。
3. ワーキングエリアとビブラトームを70％EtOHで洗浄し、刃を蒸留水ですすいでください。
4. 適切な切開ツールを使用して、作業領域に清潔な液体吸収パッドを置きます。
5. 寒天プレートを冷蔵庫から取り出し、小さな寒天キューブ（10mm×10mm×8mm）を切断する。市販のスーパーグルーを使用して、寒天ブロックをビブラトームスライシングチャンバーのステージに接着します。

チキン聴覚脳幹の単離

1. テーピングされた窓の場所で卵を開きます。メスでメンブレン嚢を穿刺し、鶏の胚の頭を取り除く。
2. 鋭いはさみで鶏肉を断頭してください。
3. カミソリの先端を目のわずかに後方に置きます。吻側から尾側への頭蓋骨を通って切開する。胚の年齢に応じてわずかな圧力をかけます。より古い胚はより多くの圧力を必要とする。
4. 静かに頭蓋骨を露出させるために皮と羽を脇に押し、正中線カットを確認します。
5. sを適用するトロン圧、頭蓋骨の吻側部分をカミソリの刃でスライスします。直ちに目の後ろに刃を置き、頭蓋骨や脳の組織全体を切断します。
6. 頭の両側の頸部筋肉の少し前に、頭蓋骨の尾側領域のハサミで中線から横方向の切開を行い、頭蓋骨および過剰組織を引き離すことによって脳および小脳を露出させる。
7. はさみで脳幹に付着した組織を切除し、脳幹を自由に離します。

生体内電気生理学または画像化のための脳幹スライスの調製

1. 視神経を介して脳幹をピン止めする。
2. はさみで足を切断し、第4脳室の床を露出させて小脳を除去する。
3. ピンセットを使用して、膜組織および血管を脳幹表面から除去する。
4. 脳幹をブロックするには、4つの床の最も吻側の端に水平に切る心室の尾側に位置する。脳幹部を隔離するために、視神経乳頭を横切る横方向切断を行う。
5. 寒天ブロックの直前のビブラトームステージに少量のスーパーグルーを置きます。
6. ピンセットを使用して脊髄の脳幹を持ち上げ、鼓膜側を下に、背側をビブラトームの刃に向かってスーパー接着剤の上に置きます。実験室のティッシュペーパーまたは濾紙で余分な接着剤を除去する。
7. 酸素化されたACSFをビブラトームステージに注ぎます。ビブラトームの刃を20〜22°の角度に設定します。最大振幅振動でビブラトームを開始する。組織の上部がブレードと平行になるようにステージをブレードに向かって上に動かします。
8. 急速に脳幹組織に向かってブレードを動かす。ブレードが組織に接触する前にブレードをかなりゆっくりと下ろす。
9. 可能な限り遅い速度で組織をスライスします。ブレードが冠状組織切片全体を通過したら、移送ピペットを用いて穏やかにスライスを除去する
10. ステージを200〜300μm下げ、再びスライスします。聴覚核の解剖学的ランドマークが目に見えるようになるまで、例えばNLの別個の背側/腹側ニューロピル領域およびNLに対するNMの内側位置のように繰り返す。
11. ACFSでスライスを慎重に管理する。これは、温水浴を使用して、室温（22℃）または生理的条件に近い（〜41℃）で行うことができる。スライスの順序に注意してください。第1のスライスは組織の最も尾側の領域に対応し、最後のスライスは最も吻側領域に対応する。これは、大まかに言えば、低周波から高周波数の符号化領域からの聴覚脳幹のトモシンピック構成をそれぞれ表す。

結果

我々は、卵子でエレクトロポレーションが正常に発生する生物系における遺伝子発現を可能にすることをここに示す。プラスミドにコードされた遺伝子は、R5 / R6の上にある神経管に局所的に注射される。重要な解剖学的マーカーに対する電極およびピペット配置の概略的な例を図1Aに示す 。プラスミド注入の正確な位置は、エレクトロポレーションの24?...

ディスカッション

卵内エレクトロポレーションでは、 in vivo遺伝子機能を解析するために目的の遺伝子を発現またはノックダウンする方法^8,9 。ニワトリの胚では、それはプラスミドにコードされた遺伝子を異なる聴性脳幹領域に発現させる革新的な方法です⁸ 。最適な発現を確保するためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、卵胞嚢がはっきり?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm