JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Слуховые нейроны головного мозга птиц и млекопитающих специализируются на быстром нейронном кодировании, фундаментальном процессе нормальных слуховых функций. Эти нейроны возникают из разных предшественников эмбрионального заднего мозга. Мы представляем методы, использующие электропорацию для экспрессии генов в заднем мозге куриных эмбрионов для изучения функции генов во время слухового развития.

Аннотация

Электропорация представляет собой метод, который вводит гены, представляющие интерес, в биологически соответствующие организмы, такие как куриный эмбрион. Уже давно установлено, что куриный эмбрион является эффективной исследовательской моделью для изучения основных биологических функций развития слуховой системы. В последнее время куриный эмбрион стал особенно ценным при изучении экспрессии генов, регуляции и функции, связанных с слухом. В ovo электропорация может использоваться для лечения слуховых областей головного мозга, ответственных за высокоспециализированные слуховые функции. Эти области включают ядро ​​цыпленка magnocellularis (NM) и ламинариум ядра (NL). Нейроны NM и NL возникают из разных предшественников ромбомеров 5 и 6 (R5 / R6). Здесь мы приводим в оо электропорации генов, кодируемых плазмидой, для изучения связанных с генами свойств в этих регионах. Мы показываем метод пространственного и временного контроля экспрессии генов, который способствует либо усилению, либо потере функционального фенотипаэс. Ориентируясь на слуховые области нервных предшественников, связанные с R5 / R6, мы показываем трансфекцию плазмид в NM и NL. Временная регуляция экспрессии генов может быть достигнута путем применения векторной системы tet-on. Это лекарственная индуцибельная процедура, которая выражает гены, представляющие интерес в присутствии доксициклина (Dox). Методика электропорации в ovo - вместе с биохимическими, фармакологическими и / или in vivo функциональными анализами - обеспечивает инновационный подход к изучению развития слухового нейрона и связанных с ним патофизиологических явлений.

Введение

Быстрое нейронное кодирование звука имеет важное значение для обычных слуховых функций. Они включают в себя возможности локализации звука 1 , речь в шумовой дискриминации 2 и понимание других поведенческих релевантных сигналов связи. 3 . Аналогичные нейроны, расположенные в слуховом стволе мозга как у птиц, так и у млекопитающих, являются высокоспециализированными для быстрого нейронного кодирования 4 . К ним относятся ядра цыпленка magnocellularis (NM), ламинарины ядра (NL) и их аналогов млекопитающих, антевровентральное кохлеарное ядро ​​(AVCN) и медиальная превосходная оливковая (MSO), соответственно 5 . Однако механизмы развития, регулирующие быстрое нейронное кодирование, плохо изучены в слуховом стволе мозга. Поэтому выгодно изучать специфические гены, которые ответственны за быстрое нейронное кодирование, чтобы лучше понять их выражение, регуляцию и функцию в auРазвитие.

Развивающийся куриный эмбрион является эффективным и хорошо зарекомендовавшим себя инструментом исследования для изучения основных биологических вопросов развития слуховой системы 6 , 7 . Недавние молекулярные успехи затронули эти биологические вопросы у развивающегося куриного эмбриона, выразив или сбив гены, представляющие интерес, для анализа генных функций in vivo 8 , 9 . Изучение регуляторной роли конкретных генов является значительным продвижением в понимании патологий, связанных с слуховым дефицитом. Здесь мы представляем в электроэлектронике генов, кодируемых плазмидой, в слуховой мозг мозга курицы, где происходит быстрое нейронное кодирование звука 10 . Ориентируясь на слуховые области нервных предшественников, связанные с ромбомерами 5 и 6 11 , 12 (R5 /R6), мы показываем пространственный контроль трансфекции плазмиды в NM и NL. Кроме того, мы показываем временную регуляцию выражения, применяя векторную систему tet-on. Это лекарственная индуцируемая процедура, которая выражает гены, представляющие интерес, в присутствии доксициклина (Dox) 8 .

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетами по уходу и использованию животных в Северо-западном университете и проводились в соответствии с Руководством Национального института здоровья для ухода и использования лабораторных животных.

1. Обработка яиц

  1. Покупайте оплодотворенные яйца у местного продавца. Храните яйца при температуре 13 ° C в холодильнике не более чем за 5 дней до инкубации. Жизнеспособность эмбрионов значительно снижается через 1 неделю.
  2. Варозируйте каждое яйцо с 70% этанолом перед установкой в ​​инкубатор.
  3. Установите 1-2 дюжины яиц по бокам в инкубаторе с температурой, установленной до 38 ° C при влажности ~ 50%. Это обеспечивает правильное позиционирование эмбрионов для электропорации и оптимальной жизнеспособности, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ. После 48-52 ч инкубации яйца будут находиться на стадии Гамбурга-Гамильтона (HH) ~ 12-13 и готовы к электропорации.

2. Подготовка

  1. Плазмида Мисин
    1. Добавьте 1 мкл 0,1% быстрого зеленого (0,1% в 18 МОм деионизированной и дистиллированной H 2 O [ddH 2 O]) для каждых 7 мкл смеси ДНК.
    2. Для совместной электропорации множественных плазмид смешивают плазмиды в соотношении 1: 1. Конечная концентрация ДНК должна составлять 5-8 мкг / мкл.
  2. Пипетка для инъекций
    1. Потяните пипетки на съемник микропипетки. Заполните пипеткой 1-2 мкл плазмид, используя иглу 28G шприца.
    2. Разбейте наконечник пипетки до 10 - 20 мкм с помощью щипцов. Используйте микроскоп, чтобы помочь определить размер сломанного наконечника пипетки. Прикрепите пипетку к держателю пипетки пикоприцера.

3. Окно

ПРИМЕЧАНИЕ. Процедура оконнения была опубликована до 13 . Дополнительную визуальную информацию см. В ссылке 13.

  1. Протрите все инструменты и рабочую зону на 70%спирт этиловый.
  2. Возьмите желаемое количество яиц из инкубатора (между 6-10), оставьте при комнатной температуре и отдельно вымойте яйца с 70% этанолом. Яйца остаются жизнеспособными в течение как минимум 2 ч после удаления инкубатора.
  3. Поместите яйцо поверх светового прожектора, чтобы определить положение эмбриона. Обведите центр темной области ( т . Е. Эмбрион) карандашом.
  4. Используя иглу 19G, высуньте отверстие в тупой конец яйца.
  5. Высуньте еще одно отверстие возле вытянутого круга на заостренной стороне яйца. Удалите небольшой кусочек наружной яичной скорлупы (около 16 мм 2 ) с помощью иглы 19G, а затем удалите небольшой кусочек внутренней яичной скорлупы (около 8 мм 2 ) с помощью щипцов.
  6. С помощью 3-мл шприца, снабженного иглой 19G, выведите 1,5-2,5 мл альбумина из яйца через отверстие тупого конца. Обязательно поднимите иглу на 45 °.
  7. Накройте отверстие тупым концом маленьким кусочком ленты (1 см х 1 см). Покройте нарисованный кругD второе отверстие с лентой (2,5 см х 4 см).
  8. С изогнутыми ножницами (режущая кромка = 2,5 см) вырежьте окно внутри круга. Ножницы должны быть параллельны яичной скорлупе, а диаметр окна должен быть менее 2 см.

4. Инъекция плазмиды

  1. Включите пикопринт. Установите давление до 18 фунтов на квадратный дюйм и продолжительность до 5 мкс. Включите воздушный резервуар и лампу для рассекательного микроскопа.
  2. Сделайте 30 мл исходного раствора 1:10 разведения купленных в магазине индийских чернил, смешанных в стерильном забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Хранить при температуре 4 ° C. Инъекция индийских чернил является важным шагом для лучшей визуализации куриного эмбриона.
    1. Заполните 1 мл шприца разбавленным раствором индийской краски. Прикрепите иглу 27G и вытащите любые пузырьки, которые присутствуют в шприце.
    2. Вставьте иглу непосредственно под мембрану желтка на 2-3 мм от эмбриона и аккуратно вставьте 0,2 мл индийских чернил под эмбрион. ДелатьНе вводят более 0,5 мл индийских чернил, так как это может снизить выживание эмбрионов.
  3. Поместите яичко на яйцо на подставку для яиц под рассекающим микроскопом. Используйте максимальное увеличение для лучшей визуализации места инъекции плазмиды.
  4. Используя щипцы, удалите мембрану над областью инъекции. Слуховые области головного мозга, представляющие интерес ( т. Е. NM и NL), возникают из Rhombomeres 5 и 6 (R5 / R6). R5 / R6 расположены рядом с отоцистами (эмбриональная структура позвоночных, которые развиваются во внутреннее ухо), которые служат ориентирами для инъекций плазмиды R5 / R6.
  5. Опустите пипетку, заполненную ДНК, в нервную трубку, расположенную над областью R5 / R6, и между отоцистами, использующими микроманипулятор. Схема идеального размещения показана на рисунке 1A .
  6. Примените давление воздуха (18 фунтов на квадратный дюйм, 5 мкс) от пикоприцера для извлечения ДНК в нервной трубке.

5. Электропорация

  1. Включить tОн ток / напряжение стимулятор.
  2. Заполните 3 мл шприца PBS и присоедините фильтр шприца. Добавьте 1-2 капли PBS на эмбрион.
  3. Опустите биполярный электрод на эмбрион с помощью микроманипулятора с отрицательным электродом над местом инъекции (медиальный) и положительным электродом, боковым по отношению к R5 / R6 ( рис. 1А ). Избегайте прямого контакта с эмбрионом. Используйте биполярные электроды, где материалом электрода является платиновый иридий. Отрегулируйте расстояние между наконечниками до 0,5 мм с помощью пинцета.
  4. Используя стимулятор тока / напряжения, импульс 20 раз при 50 В в течение 1 мс с интервалом 1 с.
  5. После электропорации добавьте одну каплю PBS поверх открытой области. Аккуратно удалите электрод и очистите его лабораторной тканью и 70% этанолом. Закройте окно, обнажив эмбрион с помощью ленты.
  6. Оболочка яичной скорлупы с инъецированным плазмидным типом и датой люка.
  7. Поместите яйца обратно в инкубатор со стороной окна вверх. Инкубируйте при 38 ° С с 50% Влажности до достижения желаемого этапа развития.
  8. Если вектор tet-on является электропорированным для временного контроля экспрессии генов, применяйте доксициклин (Dox) каждые 24 часа, чтобы индуцировать экспрессию гена (см. Раздел 6).

6. Tet-on-система для временного контроля экспрессии генов

  1. Используйте следующие плазмиды:
    PCAGGS-T2TP: транспезаза, экспрессирующая плазмиду.
    PT2K-CAGGS-rtTA-M2: плазмида, стабильно экспрессирующая Dox-связывающий белок.
    PT2K-BI-TRE-EGFP: плазмида, содержащая двунаправленную промотор-промотор tet-on (TRE) -рецептора EGFP-репортера и второй интересующий ген.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Вышеуказанные три плазмиды должны быть совместно с электроприводом в соотношении 1: 1: 1.
  2. Подготовка исходного раствора:
    1. Растворить Dox в стерильном PBS для получения исходного раствора 1 мг / мл. Хранить при -20 ° C.
  3. Приложение Dox:
    1. Чтобы побудить экспрессиоN интересующего гена на определенных стадиях развития, применяют Dox каждые 24 часа.
    2. При нанесении Dox выньте яйцо, откройте окно, налейте 50 мкл Dox на хориоалкоинтоническую мембрану, закройте окно и верните яйцо в инкубатор.

7. Подготовка зоны рассечения для кусочков мозговой оболочки

ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие разделы (7 - 9) и процедуры были опубликованы до 14 . Пожалуйста, ознакомьтесь с этими ссылками для получения дополнительной визуальной информации.

  1. Подготовьте раствор агара (40 мг / мл агарозы, т.е. 4% в ddH 2 O). Налейте раствор агара в чашку Петри и дайте ему застыть при комнатной температуре. Храните покрытую пластину агара в холодильнике для последующего использования во время срезания ткани мозга.
  2. Постоянно пузырьковая искусственная мозговая спинальная жидкость (ACSF) с 95% O 2 и 5% CO 2 (рН 7,2-7,4 и осмолярность: 295-310 мОсм / л).
  3. Очистите рабочую зону и вибрацию с помощью 70% EtOH и ополосните лезвие дистиллированной водой.
  4. Поместите чистую абсорбирующую подушку для жидкости на рабочую зону с помощью соответствующих инструментов для рассечения.
  5. Выньте агарную пластину из холодильника, вырежьте небольшой куб агара (10 мм x 10 мм x 8 мм). Приклеить блок агара к камере вибрационной камеры, используя коммерчески доступный суперклей.

8. Выделение куриного слухового мозга

  1. Откройте яйцо на месте наклеенного окна. Проколоте мембранный мешочек скальпелем и удалите головку куриного эмбриона.
  2. Обезглавьте курицу острыми ножницами.
  3. Поместите наконечник лезвия бритвы слегка назад к глазам. Вырезать череп на рострально-каудальной средней линии. Прикладывайте небольшое давление в зависимости от возраста эмбриона. Старшие эмбрионы требуют большего давления.
  4. Осторожно отодвиньте кожу и перья, чтобы выставить череп и проверить срединный срез.
  5. Применение sTrong pressure, нарежьте ростральную часть черепа лезвием бритвы. Немедленно поместите лезвие назад в глаза и прорежьте весь череп и ткань мозга.
  6. Делайте срединно-боковые разрезы с ножницами в хвостовой области черепа, слегка перед мышцами шеи с обеих сторон головы. Выставляйте мозг и мозжечок, вытягивая череп и лишнюю ткань.
  7. Отрежьте ткань, прикрепленную к стволу мозга ножницами, и удалите ствол мозга, который свободно отделяется от черепа.

9. Подготовка кусочков мозговой оболочки для электрофизиологии или визуализации in vivo

  1. Привяжите мозговой штурм через оптическую тектону.
  2. Удалите мозжечок, отрезая цветоножки ножницами, обнажая пол четвертого желудочка.
  3. Используя пинцет, удалите из мембраны мембранную ткань и кровеносные сосуды.
  4. Чтобы заблокировать мозговой штурм, сделайте горизонтальный разрез на самом ростральном конце пола четырехЙ желудочек, только хвостовой к коре. Сделайте латеральные разрезы перпендикулярно оптической текторе, чтобы изолировать ствол мозга.
  5. Поместите небольшое количество супер клея на ступень вибрации непосредственно перед блоком агара.
  6. Поднимите мозговой шприц на спинном мозге с помощью пинцета и поместите его на суперклей с ростральной стороной вниз и дорзальной стороной к вибрационному лезвию. Удалите лишний клей с помощью лабораторной ткани или фильтровальной бумаги.
  7. Залить кислородсодержащий ACSF в стадию вибрации. Установите вибрационное лезвие под углом 20-22 °. Запустите вибрацию при колебаниях максимальной амплитуды. Переместите сцену вверх к лезвию, чтобы верх ткани был параллелен лезвию.
  8. Быстро перемещайте лезвие по направлению к мозговой ткани. Замедляйте лезвие значительно до контакта лезвия с тканью.
  9. Срезанная ткань с наименьшей возможной скоростью вперед. Как только лезвие пройдет через всю секцию корональной ткани, аккуратно удалите срез с помощью переносной пипетки.
  10. Опустите сцену 200-300 мкм и снова нарезайте. Повторяйте до тех пор, пока не станут заметны анатомические ориентиры слуховых ядер, например, отчетливая дорсальная / вентральная нейропиловая область NL и медиальное расположение НМ относительно NL.
  11. Тщательно поддерживайте срезы в ACFS. Это можно сделать при комнатной температуре (22 ° C) или вблизи физиологических условий (~ 41 ° C) с использованием теплой водяной бани. Обратите внимание на порядок нарезки. Первый срез соответствует самой каудальной области ткани, а последний срез соответствует самой ростральной области. Это примерно соответствует тонотопической организации слухового ствола мозга, от областей с низкой и высокой частотой кодирования, соответственно.

Результаты

Мы показываем здесь, что в электроэлектронике ovo разрешается экспрессия генов в нормально развивающейся биологической системе. Гены, кодируемые плазмидой, вводят фокально в нервную трубку поверх R5 / R6. Схематический пример расположения электродов и пипетки ...

Обсуждение

В ovo электропорация представляет собой метод выражения или сбивания генов, представляющих интерес, для анализа функции гена vivo 8 , 9 . В курином эмбрионе это инновационный метод для экспрессии генов, кодированных плазмидой, в разные области слухо...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить доктора. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria и Mrs. Ximena Optiz-Araya за начальную помощь в установлении протокола и предоставлении плазмид. Эта работа была поддержана грантом NJH / NIDCD DC013841 (JTS).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Fertilized white leghorn chicken eggsSunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
PicospritzerParker Hannifin052-0500-900Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulatorGrass TechnologiesSD9SD9
Microfil syringe needlesWorld Precision InstrumentsMF28G67-528 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holderWarner Instruments64-1280MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrodeFHCPBSA1075PBSA1075
Air tank/regulatorNU Laboratory ServicesAir dry 300 CF
Fast greenSigma AldrichF7258-25GF7258-25G
Clear plastic tapeScotch191
Doxycycline hyclateSigma AldrichD9891-1G
Egg refrigeratorVissani Wine Refrigerator13.3 - 16.1 °C (56-61° F)
IncubatorHova-Bator38 ° C (100 ° F), ~50% humidity
Dissection scopeZeiss4.35E+15SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light sourceZeiss4.36E+15CL6000 LED
MicromanipulatorsNarishige JapanModel: MM-32 Micromanipulators
Capillary tubesSutter InstrumentBF150-86-10Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes1 mL, 3 mL
NeedlesBD Precision Glide 27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
ForcepsStoeltingNo. 5 Super Fine Dumont
Egg holderCustom MadeClay base works as well
Micropipette pullerSutter InstrumentModel P-97
Syringe filterUltra Cruzsc-358811PVDF 0.22 μm

Ссылки

  1. Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. Mechanisms of sound localization in mammals. Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).
  2. Anderson, S., et al. Neural timing is linked to speech perception in noise. J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).
  3. Shannon, R. V., et al. Speech recognition with primarily temporal cues. Science. 270 (5234), 303-304 (1995).
  4. Carr, C. E., et al. Evolution and development of time coding systems. Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).
  5. Carr, C. E., Soares, D. Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system. Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).
  6. Rubel, E. W., Parks, T. N. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).
  7. Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris. J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).
  8. Schecterson, L. C., et al. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).
  9. Chesnutt, C., Niswander, L. Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo. Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).
  10. Oertel, D. Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates. Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).
  11. Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).
  12. Cramer, K. S., et al. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).
  13. Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J Vis Exp. (8), e306 (2007).
  14. Sanchez, J. T., et al. Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices. J Vis Exp. (49), (2011).
  15. Jhaveri, S., Morest, D. K. Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study. Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).
  16. Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain. PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).
  17. Koppl, C. Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies. J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).
  18. Hyson, R. L. The analysis of interaural time differences in the chick brain stem. Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).
  19. Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. Emergence of hearing in the chicken embryo. J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).
  20. Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick. Brain Res. 63, 59-74 (1973).
  21. Woolf, N. K., Ryan, A. F. The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil. Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).
  22. Walsh, E. J., McGee, J. Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens. Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).
  23. Uziel, A., Romand, R., Marot, M. Development of cochlear potentials in rats. Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124magnocellularis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены