Em Ovo Electroporation no Brainstem Auditivo da Galinha

Resumo

Os neurônios auditivos de tronco encefálico de aves e mamíferos são especializados para codificação neural rápida, um processo fundamental para funções auditivas normais. Esses neurônios surgem de precursores distintos do antígeno cervical embrionário. Apresentamos técnicas que utilizam eletroporação para expressar genes no colo de embriões de frango para estudar a função genética durante o desenvolvimento auditivo.

Resumo

A eletroporação é um método que introduz genes de interesse em organismos biologicamente relevantes como o embrião de frango. Está estabelecido há muito tempo que o embrião de frango é um modelo de pesquisa eficaz para estudar as funções biológicas básicas do desenvolvimento do sistema auditivo. Mais recentemente, o embrião de frango tornou-se particularmente valioso no estudo da expressão gênica, regulação e função associada à audição. A eletroporação no ovo pode ser usada para direcionar as regiões auditivas do tronco encefálico responsáveis ​​por funções auditivas altamente especializadas. Estas regiões incluem o núcleo de galinha magnocellularis (NM) e o núcleo laminaris (NL). Os neurônios NM e NL surgem de precursores distintos de rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos para estudar propriedades relacionadas a genes nessas regiões. Mostramos um método para o controle espacial e temporal da expressão gênica que promove o ganho ou a perda de fenótipo funcionalEs. Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com R5 / R6, mostramos transfecção plasmídica em NM e NL. A regulação temporal da expressão gênica pode ser conseguida através da adoção de um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox). A técnica de eletroporação in ovo - juntamente com ensaios funcionais bioquímicos, farmacológicos e in vivo - fornece uma abordagem inovadora para estudar o desenvolvimento de neurônios auditivos e fenômenos fisiopatológicos associados.

Introdução

A codificação neural rápida do som é essencial para funções auditivas normais. Estas incluem habilidades de localização de som ¹ , fala na discriminação de ruído ² e a compreensão de outros sinais de comunicação relevantes ao comportamento ³ . Os neurônios análogos localizados no tronco encefálico auditivo de aves e mamíferos são altamente especializados para codificação neural rápida ⁴ . Estes incluem o núcleo de galinha magnocellular (NM), o núcleo laminaris (NL) e seus análogos de mamíferos, o núcleo coclear anteroventral (AVCN) e a azeitona mediana superior (MSO), respectivamente ⁵ . No entanto, os mecanismos de desenvolvimento que regulam a codificação neural rápida são mal compreendidos no tronco encefálico auditivo. Portanto, é vantajoso estudar genes específicos que são responsáveis ​​pela codificação neural rápida, a fim de melhor compreender a sua expressão, regulação e função no auDesenvolvimento de distritos.

O embrião de frango em desenvolvimento é uma ferramenta de pesquisa eficaz e bem estabelecida para estudar questões biológicas básicas de desenvolvimento do sistema auditivo ^{6 , 7} . Avanços moleculares recentes abordaram essas questões biológicas no embrião de frango em desenvolvimento, expressando ou derrubando genes de interesse para analisar a função de genes in vivo ^{8 , 9} . Investigar o papel regulador de genes específicos é um avanço significativo na compreensão de patologias associadas aos déficits auditivos. Aqui, apresentamos na eletroporação ovo de genes codificados por plasmídeos no tronco encefálico de frango onde ocorre uma rápida codificação neural de som ¹⁰ . Ao direcionar as regiões progenitoras neuronais auditivas associadas com os fômulos 5 e 6 ^{11 , 12} (R5 /R6), mostramos o controle espacial da transfecção do plasmídeo em NM e NL. Além disso, mostramos a regulação temporal da expressão adotando um sistema de vetores tet-on. Este é um procedimento induzível por drogas que expressa os genes de interesse na presença de doxiciclina (Dox) ⁸ .

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Northwestern e realizados de acordo com as Diretrizes de Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.

1. Manuseio de ovos

1. Compre ovos fertilizados de um fornecedor local. Armazene os ovos a 13 ° C na geladeira por não mais de 5 dias antes da incubação. A viabilidade do embrião diminui significativamente após 1 semana.
2. Espume cada ovo com etanol a 70% antes de se estabelecer na incubadora.
3. Configure 1-2 dúzias de ovos em seus lados em uma incubadora com a temperatura ajustada para 38 ° C a ~ 50% de umidade. Isso garante o posicionamento adequado do embrião para eletroporação e viabilidade ideal, respectivamente.
   NOTA: Após 48-52 h de incubação, os ovos estarão no estágio Hamburger-Hamilton (HH) ~ 12-13 e pronto para eletroporação.

2. Preparação

1. Plasmid MiXing
   1. Adicione 1 μL de 0,1% de verde rápido (0,1% em 18 MΩ desionado e H ₂ O destilado [ddH ₂ O]) por cada 7 μL de mistura de DNA.
   2. Para co-electroporação de plasmídeos múltiplos, misture plasmídeos em proporção 1: 1. A concentração final de DNA deve ser 5-8 μg / μL.
2. Pipeta de injeção de preenchimento
   1. Puxe pipetas em um extractor de micropipetas. Encha a pipeta com 1-2 μL de plasmídeos usando uma agulha de seringa 28G.
   2. Deslize a ponta da pipeta para 10 a 20 μm usando fórceps. Use um microscópio para ajudar a determinar o tamanho da ponta de pipeta quebrada. Anexe a pipeta ao titular da pipeta do picospritzer.

3. Windowing

NOTA: O procedimento de janelas foi publicado antes de ¹³ . Consulte a referência 13 para obter informações visuais adicionais.

1. Limpe todos os instrumentos e a área de trabalho com 70%etanol.
2. Pegue o número desejado de ovos estabelecidos para fora da incubadora (entre 6-10), deixe à temperatura ambiente e colete ovos com 70% de etanol novamente. Os ovos permanecem viáveis ​​por pelo menos 2 h após a remoção da incubadora.
3. Coloque o ovo em cima de um iluminador leve para identificar o posicionamento do embrião. Circule o centro da área escura ( ou seja , embrião) com um lápis.
4. Usando uma agulha 19G, puxa um buraco na extremidade contundente do ovo.
5. Puxar outro buraco perto do círculo desenhado no lado aguçado do ovo. Remova um pequeno pedaço da casca de ovo exterior (cerca de 16 mm ² ) com a agulha 19G e, em seguida, remova uma pequena peça da casca de ovo interior (cerca de 8 mm ² ) com fórceps.
6. Com uma seringa de 3 mL equipada com uma agulha 19G, retire 1,5-2,5 mL de albumina do ovo através do buraco sem corte. Certifique-se de inclinar a agulha para baixo a 45 °.
7. Cubra o orifício sem corte com um pequeno pedaço de fita (1 cm x 1 cm). Cubra o círculo desenhado eD o segundo furo com fita adesiva (2,5 cm x 4 cm).
8. Com tesoura curvada (corte = 2,5 cm), corte uma janela dentro do círculo. As tesouras devem ser paralelas à casca do ovo e o diâmetro da janela deve ser inferior a 2 cm.

4. Injeção de plasmídeo

1. Ligue o picospritzer. Ajuste a pressão para 18 psi e a duração para 5 μs. Ligue o tanque de ar e a lâmpada para o microscópio de dissecação.
2. Faça uma solução de reserva de 30 mL de uma diluição 1:10 de tinta indiana comprada na loja misturada com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Armazenar a 4 ° C. A injeção de tinta indiana é um passo importante para obter uma melhor visualização do embrião de frango.
   1. Encha uma seringa de 1 mL com a solução diluída de tinta indiana. Anexe uma agulha 27G e expulse as bolhas que estão presentes na seringa.
   2. Insira a agulha logo abaixo da membrana da gema ~ 2 - 3 mm do embrião e injete suavemente 0,2 mL de tinta indiana sob o embrião. FazNão injetar mais de 0,5 mL da tinta indiana, pois pode diminuir a sobrevivência do embrião.
3. Coloque o ovo com janelas em um suporte de ovo sob o microscópio de dissecação. Use a maior ampliação para melhor visualização do local de injeção de plasmídeo.
4. Usando fórceps, remova a membrana sobre a área de injeção. Regiões auditivas de tronco encefálico de interesse ( ou seja , NM e NL) surgem de Rhombomeres 5 e 6 (R5 / R6). R5 / R6 estão localizados adjacentes aos otocistos (uma estrutura embrionária em vertebrados que se desenvolve na orelha interna) que servem como marcos para injeções plasmáticas R5 / R6.
5. Abaixe a pipeta cheia de DNA no tubo neural que cobre a região R5 / R6 e entre otocistos usando o micromanipulador. Um esquema da colocação ideal é mostrado na Figura 1A .
6. Aplique pressão de ar (18 psi, 5 μs de duração) do picospritzer para expulsar o DNA no tubo neural.

5. Electroporação

1. Ativar tO estimulador de corrente / tensão.
2. Encha uma seringa de 3 mL com PBS e prenda o filtro da seringa. Adicione 1-2 gotas de PBS no embrião.
3. Abaixe o eletrodo bipolar para o embrião usando o micromanipulador com o eletrodo negativo acima do local da injeção (medial) e o eletrodo positivo lateral ao R5 / R6 ( Figura 1A ). Evite o contato direto com o embrião. Use eletrodos bipolares onde o material do eletrodo é iridio de platina. Ajuste o espaçamento entre as pontas para 0,5 mm com fórceps.
4. Usando um estimulador de corrente / tensão, pulso 20 vezes a 50 V por 1 ms a intervalos de 1 s.
5. Após a eletroporação, adicione uma gota de PBS sobre a área exposta. Remova cuidadosamente o eletrodo e limpe-o com um tecido de laboratório e 70% de etanol. Feche a janela expondo o embrião com fita adesiva.
6. Marque a casca de ovo com o tipo de plasmídeo injetado e a data da escotilha.
7. Coloque os ovos de volta na incubadora com a janela voltada para cima. Incube a 38 ° C com 50% De umidade até atingir o estágio de desenvolvimento desejado.
8. Se um vetor tet-on é eletroporizado para o controle temporal da expressão gênica, aplique Doxiciclina (Dox) a cada 24 h para induzir a expressão gênica (ver Seção 6).

6. Sistema Tet-on para Controle Temporal de Expressão Genética

1. Use os seguintes plasmídeos:
   PCAGGS-T2TP: um plasmídeo que expressa transposase.
   PT2K-CAGGS-rtTA-M2: um plasmídeo que expressa de forma estável a proteína de ligação de Dox.
   PT2K-BI-TRE-EGFP: um plasmídeo que contém uma expressão de promotor tet-on bidirecional bidireccional (TRE) do repórter EGFP e um segundo gene de interesse.
   NOTA: Os três plasmídeos acima mencionados precisam ser co-electroporados em uma proporção de 1: 1: 1.
2. Preparação da solução de estoque:
   1. Dissolver Dox em PBS estéril para produzir uma solução de reserva de 1 mg / mL. Armazenar a -20 ° C.
3. Aplicação Dox:
   1. Para induzir o expressioN do gene de interesse durante certos estágios de desenvolvimento, aplique Dox a cada 24 h.
   2. Ao aplicar o Dox, retire o ovo, abra a janela, pipette 50 μL de Dox na membrana corioalointoica, feche a janela e coloque o ovo novamente na incubadora.

7. Preparação da área de dissecação para fatias do tronco encefálico

NOTA: As seguintes seções (7-9) e procedimentos foram publicados antes de ¹⁴ . Veja essas referências para obter informações visuais adicionais.

1. Prepare uma solução de ágar (40 mg / mL de agarose, ou seja , 4% em ddH ₂ O). Despeje a solução de ágar numa placa de Petri e deixe-a solidificar à temperatura ambiente. Armazene a placa de ágar coberta na geladeira para uso futuro durante o corte de tecido do tronco encefálico.
2. Fluido espinhal cerebral artificial contínuo (ACSF) com 95% de O2 e 5% de CO ₂ (pH 7,2-7,4 e osmolaridade: 295-310 mOsm / L).
3. Limpe a área de trabalho e vibratome com 70% de EtOH e enxágue a lâmina com água destilada.
4. Coloque uma almofada de absorção de fluido limpa na área de trabalho com ferramentas de dissecação adequadas.
5. Retire a placa de ágar da geladeira, corte um pequeno cubo de ágar (10 mm x 10 mm x 8 mm). Cola o bloco de agar até o estágio de uma câmara de corte de vibratoma usando superglue comercialmente disponível.

8. Isolamento do Brainstem Auditivo de Frango

1. Abra o ovo no local da janela gravada. Puncione o saco de membrana com um bisturi e remova a cabeça do embrião de frango.
2. Decapite o frango com tesoura afiada.
3. Coloque a ponta da lâmina de barbear ligeiramente posterior aos olhos. Incise através do crânio na linha média rostral-caudal. Aplique uma ligeira pressão dependendo da idade do embrião. Os embriões mais antigos exigem mais pressão.
4. Empurre suavemente a pele e as penas para expor o crânio e verificar o corte da linha média.
5. Aplicando sTrong pressure, corte a porção rostral do crânio com uma lâmina de barbear. Coloque imediatamente a lâmina posterior aos olhos e corte todo o tecido do crânio e do cérebro.
6. Faça incisões de linha a lateral com tesouras na região caudal do crânio, ligeiramente anterior aos músculos do pescoço em ambos os lados da cabeça. Exponha cérebro e cerebelo puxando o crânio e o excesso de tecido.
7. Corte o tecido ligado ao tronco cerebral com uma tesoura e remova o tronco encefálico, que se desprende livremente do crânio.

9. Preparação de fatias de tronco encefálico para eletrofisiologia ou imagem in vivo

1. Desligue o tronco cerebral através da tela óptica.
2. Retire o cerebelo cortando pedúnculos com tesoura, expondo o piso do quarto ventrículo.
3. Usando pinças, remova qualquer tecido membranoso e vasos sanguíneos da superfície do tronco encefálico.
4. Para bloquear o tronco encefálico, faça um corte horizontal na extremidade mais rostral do chão dos quatroVentrículo, apenas caudal ao córtex. Faça cortes laterais perpendiculares através da tela óptica para isolar o tronco encefálico.
5. Coloque uma pequena quantidade de super cola na fase de vibração diretamente na frente do bloco de ágar.
6. Levante o tronco encefálico na medula espinhal usando pinças e coloque-o na super cola com o lado rostral para baixo e o lado dorsal em direção à pá vibratoma. Remova o excesso de cola com um papel de laboratório ou papel de filtro.
7. Despeje a ACSF oxigenada no estágio de vibração. Coloque a lâmina vibratoma em um ângulo de 20-22 °. Comece vibratome na oscilação de amplitude máxima. Mova o andar em direção à lâmina para que a parte superior do tecido seja paralela à lâmina.
8. Mova rapidamente a lâmina para o tecido do tronco encefálico. Deslize a lâmina lentamente antes do contato da lâmina com o tecido.
9. Corte o tecido com a velocidade de avanço mais lenta possível. Uma vez que a lâmina atravessa toda a seção de tecido coronal, remova suavemente a fatia usando uma pipeta de transferência.
10. Abaixe o palco 200-300 μm e faite novamente. Repita até que os marcos anatômicos dos núcleos auditivos se tornem visíveis, por exemplo, a região distinta de neuropil dorsal / ventral de NL e a localização medial do NM em relação à NL.
11. Mantenha cuidadosamente as fatias no ACFS. Isso pode ser feito a temperatura ambiente (22 ° C) ou perto de condições fisiológicas (~ 41 ° C) usando um banho de água quente. Observe a ordem de cortar. A primeira fatia corresponde à região mais caudal do tecido e a última fatia corresponde à região mais rostral. Isso representa grosseiramente a organização tonotópica do tronco auditivo auditivo, de regiões de codificação de baixa a alta freqüência, respectivamente.

Resultados

Mostramos aqui que em ovo a eletroporação permite a expressão gênica em um sistema biológico normalmente desenvolvido. Os genes codificados por plasmídeo são injetados focalmente no tubo neural que cobre R5 / R6. Um exemplo esquemático das colocações de eletrodo e pipeta em relação aos marcadores anatômicos importantes é mostrado na Figura 1A . A localização correta da injeção do plasmídeo é confirmada 24 h após a eletroporação e mostrada ...

Discussão

A electroporação in ovo é um método para expressar ou derrubar genes de interesse para analisar a função de genes in vivo ^{8 , 9} . No embrião de frango, é um método inovador para expressar genes codificados por plasmídeos em diferentes regiões do tronco encefálico ⁸ . Para garantir a expressão ideal, são necessárias várias etapas críticas. Em primeiro lugar, apenas injete embriões cujos otocisto...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fertilized white leghorn chicken eggs	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, single or dual channel
Current/voltage stimulator	Grass Technologies	SD9	SD9
Microfil syringe needles	World Precision Instruments	MF28G67-5	28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)
Electrode holder	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Non-Electrical Pressure Applications
Stimulating microelectrode	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Air tank/regulator	NU Laboratory Services		Air dry 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Clear plastic tape	Scotch	191
Doxycycline hyclate	Sigma Aldrich	D9891-1G
Egg refrigerator	Vissani Wine Refrigerator		13.3-16.1° C (56-61° F)
Incubator	Hova-Bator		37.8° C (100° F), ~50% humidity
Dissection scope	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X
Cold-light source	Zeiss	4.36E+15	CL6000 LED
Micromanipulators	Narishige Japan	Model: MM-3	2 Micromanipulators
Capillary tubes	Sutter Instrument	BF150-86-10	Thick-walled borosilicate (dimensions)
Syringes			1 mL, 3 mL
Needles	BD Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Forceps	Stoelting		No. 5 Super Fine Dumont
Egg holder	Custom Made		Clay base works as well
Micropipette puller	Sutter Instrument		Model P-97
Syringe filter	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μm