Modelo de Degeneración de Disco Intervertebral Lumbar Ovino Utilizando una Lesión Lateral Retroperitoneal Lateral

Resumen

La degeneración del disco intervertebral es un factor importante en el dolor de espalda y una de las principales causas de discapacidad en todo el mundo. Existen numerosos modelos animales de degeneración de los discos intervertebrales. Demostramos un modelo ovino de degeneración de disco intervertebral, utilizando una broca, que logra una lesión de disco consistente y nivel reproducible de degeneración de disco.

Resumen

La degeneración del disco intervertebral es un factor importante en el desarrollo del dolor de espalda y la principal causa de discapacidad en todo el mundo. Se han desarrollado numerosos modelos animales de degeneración de discos intervertebrales. El modelo animal ideal debe simular de cerca el disco intervertebral humano con respecto a la morfología, las propiedades biomecánicas y la ausencia de células notocordales. El modelo de disco intervertebral lumbar de oveja cumple estos criterios. Presentamos un modelo ovino de degeneración de disco intervertebral utilizando una lesión de taladro mediante un abordaje retroperitoneal lateral. El abordaje lateral reduce significativamente la incisión y la morbilidad potencial asociada con el abordaje anterior tradicional a la espina dorsal ovina. La utilización de un método de perforación de broca proporciona la capacidad de producir una lesión consistente y reproducible, de dimensiones precisas, que inicie un grado consistente de degeneración de disco intervertebral. La naturaleza focal del anilloY el defecto del núcleo pulposo más de cerca imita la condición clínica de la hernia focal del disco intervertebral. Las ovejas se recuperan rápidamente siguiendo este procedimiento y son típicamente móviles y comen dentro de la hora. La degeneración del disco intervertebral se produce y las ovejas se someten a la necropsia y el análisis subsiguiente en períodos de ocho semanas. Creemos que el modelo de la lesión del taladro de la perforación de la degeneración del disco intervertebral ofrece ventajas sobre modelos más convencionales de la lesión anular.

Introducción

El dolor de espalda es la principal causa de discapacidad en todo el mundo ¹ . La degeneración del disco intervertebral lumbar asociada al dolor discogénico se considera un factor importante en el dolor de espalda ² . Existe una creciente demanda de modelos animales fiables de la enfermedad del disco intervertebral para ampliar la comprensión del proceso degenerativo y para la investigación de terapias potenciales.

Existen numerosos modelos animales de degeneración de los discos intervertebrales ³ . Los modelos de animales utilizados en la investigación de la enfermedad degenerativa del disco varían en tamaño desde ratones ⁴ , a mamíferos más grandes como perros ⁵ , ovejas ⁶ y primates no humanos ⁷ . Los métodos utilizados para inducir la degeneración del disco intervertebral pueden clasificarse ampliamente en las categorías de mecánica ( p. Ej ., Compresión de discos intervertebrales N ⁸ o lesión quirúrgica ⁶ ), química ( por ejemplo, nucleólisis química ⁵ ) o, menos comúnmente, degeneración espontánea ( por ejemplo, la rata de arena ⁹ ).

Dada la complejidad de la degeneración del disco intervertebral humano, no existe un modelo animal perfecto. Sin embargo, se han identificado consideraciones importantes en la elección de un modelo animal apropiado para imitar esta condición de cerca ³ . Tales consideraciones incluyen la ausencia de células notocordales (células primitivas con posible función de células progenitoras ¹⁰ ausentes del núcleo pulposo adulto en seres humanos, ovejas, cabras y perros condrodistróficos, pero presentes en la mayoría de los mamíferos), similitudes en el tamaño de los discos animales e intervertebrales en relación con los seres humanos, Fuerzas biomecánicas comparables a la condición clínica, consideraciones mecánicas y éticas ³ .

Los primates no humanos cumplen con muchos de los criterios anteriores: se han descrito modelos de babuinos y macacos de degeneración espontánea de los discos intervertebrales ^{11 , 12 , 13.} Ambas especies pasan grandes cantidades de tiempo en posturas erectas o semi-erectas - una clara ventaja En comparación con otros modelos animales, pero la consideración ética y práctica ( por ejemplo , gasto, vivienda, retraso en la aparición de la degeneración espontánea) restringe su uso en muchas instituciones.

La espina dorsal ovina es un modelo establecido de degeneración de disco intervertebral, con ventajas que incluyen similitudes celulares, biomecánicas y anatómicas a la columna vertebral humana ^{10 , 14 , 15} . A pesar de la estatura cuadrúpeda de las ovejas, el disco intervertebral lumbar ovino está expuesto a tensiones similares al disco humanoS = "xref"> 14. El modelo ovino también es más ampliamente aceptado, desde una perspectiva ética, que los modelos de primates no humanos. Se han descrito métodos variados para iniciar el proceso degenerativo, muchos de los cuales requieren acceso directo al disco intervertebral. Debido a la terminación de la médula espinal en la región sacra ya la osificación del ligamento longitudinal posterior en la columna lumbar ovina, las aproximaciones posteriores al disco intervertebral son técnicamente desafiantes y menos utilizadas en las ovejas ¹⁶ . Las vías de acceso tradicionales a la espina lumbar de oveja, es decir , por vía anterior o anterolateral, requieren incisiones abdominales grandes, con riesgos de hernia y daños en las vísceras internas y en las estructuras neurovasculares ¹⁶ . El uso de una incisión lateral relativamente pequeña lejos de áreas abdominales dependientes puede disminuir tales riesgos ¹⁷ .

Presentamos una moDel de la enfermedad de disco intervertebral lumbar degenerativa utilizando la lesión de la broca de perforación realizada a través de un acercamiento lateral mínimamente invasivo, e inspirado en el trabajo de Zhang et. Al ¹⁸ . El objetivo de este protocolo es permitir un modelo de lesión de disco lumbar confiable que sea fácilmente reproducible, produzca una lesión consistente y sea seguro y bien tolerado. Este enfoque es muy adecuado para los investigadores que buscan inducir un grado más leve de degeneración del disco intervertebral lumbar que el observado con anulotomía quirúrgica tradicional (datos no publicados) para la investigación de la degeneración del disco intervertebral o terapias regenerativas. Estos hallazgos se describirán en una próxima publicación.

Protocolo

El protocolo detallado en este manuscrito sigue las pautas del cuidado animal de la ética animal de la universidad de Monash. La aprobación ética animal para este protocolo ha sido otorgada por Monash University Animal Ethics. Número de aprobación ética: MMCA / 2014/55

1. Preparación de las ovejas

NOTA: Se utilizaron ovejas de dos a cuatro años de edad.

1. Oveja rápida durante 18 h antes de la anestesia. Proporcionar a los animales acceso al agua hasta las 6-12 h antes de la operación ¹⁹ .
2. Sedate a los animales por inyección intravenosa de clorhidrato de medetomidina (0,015-0,020 mg / kg) para facilitar la transferencia a la sala de operaciones.
   NOTA: El hidrocloruro de medetomidina sirve para reducir el estrés animal y la agitación asociada con la separación de otros animales para su transferencia a la sala de operaciones.
3. Inyectar thiopentone (10-13 mL / Kg) para la inducción de la anestesia al llegar a la sala de operaciones.
4. Administrar profilaxis intraAntibióticos venosos (amoxicilina 1 g IV) inmediatamente después de la inyección de tiopental.
5. Intubar ovejas utilizando un tubo endotraqueal de tamaño 7,5-9 mm (diámetro interno) ²⁰ .
6. Mantener la anestesia con isoflurano inhalado (2-3%) en oxígeno al 100% a un caudal de 2 l / min. Conecte un oxímetro de pulso a la oreja de oveja.
7. Vigilar de cerca los signos vitales de las ovejas (frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria y saturación de oxígeno mediante oxímetro de pulso y observación) y nivel de conciencia.
   NOTA: Los indicadores de anestesia ligera como la masticación espontánea, la regurgitación activa y los movimientos espontáneos deben provocar un aumento en el nivel de anestesia. Los signos de la bandera roja que indican un alivio urgente de la anestesia incluyen compromiso respiratorio y bradicardia grave. La rotación del ojo no es un indicador consistente de profundidad de anestesia en ovejas ¹⁹ .

2. Nivel de disco e incisión

1. Recoger lasHerramientas urgentes necesarias para este procedimiento: tijeras para veterinarios, jeringa Luer-Lock de 20 ml, aguja 21G IV, mango de escalpelo nº 4, cuchillas para bisturí # 22, pinzas para tejidos Gillies, tijeras curvadas Metzenbaum, retractor Deaver, hoja retractor Hohmann de 3,5 mm Broca de taladro, taladro, bolsa de perforación veterinaria autoclavable, soporte de aguja, suturas trenzadas sintéticas absorbibles 2-0, sutura trenzada sintética absorbible 3-0 y tijeras de sutura Mayo.
2. Prepare el paquete operativo. Limpie la mesa operativa y el soporte del instrumento con etanol al 70%. Autoclave todos los instrumentos quirúrgicos antes de la operación. Realizar el control anestésico preoperatorio.
3. Coloque la oveja sobre la mesa de operaciones en la posición lateral derecha.
4. Usando cortadoras electrónicas, afeitarse la región definida superiormente por las costillas inferiores, inferiormente por el hueso ilíaco, medialmente por los procesos transversos lumbares contralaterales y aproximadamente 10 cm laterales a los procesos transversos lumbares ipsolaterales.
5. Palpar la cresta ilíaca, los procesos transversos lumbares (L1-6) y el ángulo costo-vertebral de los puntos de referencia para el sitio de la incisión quirúrgica. Marque estos puntos de referencia con una pluma estéril.
6. Preparar el abdomen lateral mediante la desinfección con clorhexidina y lavado antiséptico con yoduro alcohólico.
7. Observe las técnicas quirúrgicas asépticas estándar durante toda la operación. El equipo quirúrgico se friega antes de la operación. Coloque una cortina cuadrada fenestrada estéril sobre el sitio quirúrgico, y un gran cubre cuadrado estéril en la mesa de arriba.
   1. Esterilizar todos los elementos que se van a utilizar dentro del sitio operativo antes de la operación. Monitorear y mantener la esterilidad del sitio quirúrgico durante toda la operación. Asegúrese de que todos los artículos introducidos en el campo estéril son estériles y se transfieren de manera estéril.
8. Use lupa quirúrgica y un faro para facilitar la visualización durante el procedimiento quirúrgico.
9. Hacer una incisión longitudinalUsando la cuchilla # 22 del bisturí unida al mango del escalpelo # 4 paralelo a y 1 cm anterior a uno a dos procesos transversales lumbares por encima y por debajo de los niveles del disco intervertebral de interés.
   NOTA: Puede encontrar más información sobre la planificación de incisiones en la discusión.
10. Utilizar la diatermia monopolar para dividir el tejido subcutáneo subyacente y el aspecto lateral de la musculatura de la pared abdominal; Dirigir la disección hacia las puntas de los procesos transversos lumbares por encima y por debajo de los discos intervertebrales de interés.
11. Divida la fascia toracolumbar longitudinalmente en su unión a los procesos transversales.
12. Visualice y preserve el cuadrado lumbar subyacente , los músculos del psoas y los haces neurovasculares que atraviesan.
13. Mantenga la hemostasia a través del procedimiento usando diatermia.
14. Barrer los dedos entre el plano del peritoneo y la musculatura posterior de la pared abdominal en la zona intervertebralSc para realizar la disección digital.
15. Retirar los músculos cuadrado lumborum y psoas posterolateralmente usando un retractor de Deaver para exponer aún más los discos intervertebrales.
16. Palpar para los cuerpos intervertebrales cóncavos y los discos convexos intervertebrales.
17. Coloque los retractores inmediatamente sobre los discos y asegúrese de que los vasos lumbares no estén dañados.
18. Utilizando el aumento de la lupa quirúrgica con un faro, identifique los vasos lumbares que están situados aproximadamente 1 cm caudal a la placa terminal inferior.
19. Realice una radiografía lateral intraoperatoria para confirmar el nivel del disco. ²¹
    Nota: Configuración de la radiografía: 47kV; 4 mAs ²¹
20. Dependiendo de los niveles de disco deseados, exponga el disco intervertebral separando las estructuras circundantes y los accesorios como se muestra a continuación.
    1. Para los niveles L3 / 4 y superiores, barrer los accesorios musculares sobre los diSc usando disecciones rojas digitales.
    2. Para los niveles L4 / 5 e inferiores, divida bruscamente los apegos musculares tendinosos más gruesos sobre el disco usando diatermia bipolar y tijeras.
       NOTA: El disco L6 / S1 puede ser de difícil acceso debido a la obstrucción de la cresta ilíaca. Si no se puede lograr el acceso mediante el abordaje lateral, se puede utilizar un abordaje anterior.

3. Lesión de la broca

NOTA: La planificación preoperatoria incluye la asignación de niveles de lesión / tratamiento y niveles de control. Puede encontrar más información sobre la asignación de niveles en la discusión.

1. Defina el punto de entrada de la broca observando las extremidades laterales y anteriores izquierdas del disco intervertebral.
   NOTA: El punto de entrada se localiza en el punto medio de este cuadrante anterolateral izquierdo (definido por las extremidades anterior y lateral del disco). La broca se inserta en este punto de entrada con una trayectoriaHacia el centro de los discos intervertebrales y dirigido ligeramente craneal a perpendicular.
2. Coloque una broca de punto Brad en el taladro eléctrico. Asegúrese de que el diámetro de la broca es ligeramente inferior a la altura del disco intervertebral, es decir, 3,5 mm para el disco intervertebral lumbar en 60-70 kg de oveja.
   1. Aplicar un tope de taladro para proporcionar una longitud de broca no protegida de aproximadamente la mitad del diámetro del disco intervertebral lumbar, es decir, 12 mm para discos intervertebrales lumbares en ovejas de 60-70 kg.
3. Aplicar la broca al punto de entrada y dirigirla en una trayectoria ligeramente craneal al centro del disco intervertebral. La ligera angulación craneal es minimizar el riesgo de lesión en la placa terminal.
4. Avance la broca poco a poco en el disco intervertebral con el taladro en baja potencia durante 1 s. Ajustar la trayectoria de una ligera forma craneal o caudal si se encuentra resistencia excesiva
   NOTA: TalUna resistencia excesiva probablemente indica contacto con la placa final.

4. Cierre

1. Una vez que se logre la hemostasia, irrigar la herida con la solución de Ringers.
2. Realizar un cierre estratificado, preferiblemente usando suturas trenzadas sintéticas absorbibles 2-0 a los tejidos laterales de la pared abdominal y una sutura subcutánea trenzada sintética absorbible sin teñir continua 3-0 a la piel.

5. Manejo postoperatorio

1. Coloque un parche transdérmico de fentanilo (75 μg / h) en la región inguinal para analgesia postquirúrgica durante 3 días.
2. Además, use buprenorfina intravenosa (0,005-0,01 mg / kg) para la analgesia de recarga si es necesario.
3. Cese el anestésico inhalatorio. Cuando ocurre la respiración espontánea, retire el tubo endotraqueal.
4. Permita que el animal se recupere en una jaula de retención bajo observación constante.
   NOTA: El animal no debe dejarse desatendido hasta que haya recuperado el conscio suficienteUsness para conservar la recumbencia esternal.
5. Una vez que el animal está completamente alerta y de pie, reintroduzca el alimento y el agua. Una vez que se haya recuperado completamente, devuelva el animal a su centro operatorio con otros animales.
6. Vigilar de cerca durante 24 h y continuar la observación durante una semana. Monitorear la evidencia de dolor post-quirúrgico o angustia.
   NOTA: El parche de fentanilo transdérmico postoperatorio aplicado durante tres días debe proporcionar suficiente analgesia. Los requerimientos analgésicos adicionales deben hacer que los animales sean revisados.
7. Alimentar a las ovejas normalmente, y permitir que las ovejas para llevar a cabo las actividades normales sin restricción. Observe a las ovejas de cualquier evidencia de déficit neurológico, como la cojera.
   NOTA: El defecto del disco intervertebral producido por el método de lesión de la broca está en el aspecto anterolateral del disco y la profundidad de la lesión está limitada por el tope del taladro al núcleo central. Como los elementos neurales se localizan posterior / posterolateral al disco intervertebral,El riesgo de compromiso neural secundario al núcleo sintomático pulposo es remoto. Esta característica anatómica del modelo impide el uso del examen neurológico para distinguir la degeneración del disco intervertebral con y sin herniación del núcleo pulposo.
8. Devolver las ovejas a la granja de la universidad para esperar la eutanasia y necropsia al final del período experimental.

6. Eutanasia

1. Realizar la eutanasia de las ovejas en un intervalo de tiempo apropiado después de la lesión del disco intervertebral de la broca.
2. Inyectar pentobarbitona sódica intravenosa (> 100 mg / kg) para la eutanasia.

Resultados

Antes de la operación, las ovejas se sometieron a la resonancia magnética (IRM) basal 3T para la evaluación de la morfología y la degeneración del disco intervertebral subyacente. Las ovejas fueron sometidas a radiografía lateral intraoperatoria adicional para la confirmación del nivel del disco intervertebral y el cálculo del índice de altura del disco. Un plano sagital preoperatorio rebanada de 3T MRI y un intra-operatorio radiografía se demuestran en la Figura 1

Discusión

Este enfoque de acceso lateral mínimamente invasivo es eficaz y seguro, sin hernias postoperatorias, dehiscencia de la herida abdominal o infección observada en esta serie. El uso del modelo de lesión de disco intervertebral de la broca con un tope de profundidad proporciona un método reproducible de inducir una lesión consistente del disco intervertebral de dimensión conocida ( es decir , una lesión de 3,5 mm de diámetro x 12 mm de profundidad en este estudio). En nuestra experiencia, este método prod...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine Hydrochloride (10 mL Injection)	Therapon/Zoetis	PFIDOM10	Multiple suppliers: Zoetis/Ilium
Thiopentone	Troy	Triothiopentone	Multiple suppliers: Neon Laboratories, Jagsonphal Pharmaceuticals
Isoflurane (2 - 3 % in oxygen)	Baxter	AHN3636	Multiple suppliers: Baxter/VetOne
Amoxicillin parenteral	GlaxoSmithKline	JO1CA04	Multiple suppliers: GlaxoSmithKline/Merck
Bupivacaine (0.5% Injection 20 mL)	Pfizer	005BUP001	Multiple suppliers: Pfizer/AstraZeneca
PVD Iodine Solution	Jurox	61330	Multiple suppliers: Jurox/Orion
Chlorhexidine 5%w/v	Jurox	Chlorhex C 5L (SCRUB)	Multiple suppliers: Jurox/Pfizer
Transdermal Fental Patch (75 μg/h)	Janssen-Cilag	S8-Dur7.5	Multiple suppliers: Sandoz
Buprenorphine iv	Jurox	504410	Multiple suppliers: LGM Pharma
Atipamezole (Antisedan 0.06 mg/kg - 0.08 mg/kg)	Zoetis	PFIANT10	Multiple suppliers: Ilium
Oster Golden A5 2-Speed Clippers	Oster	078005-140-003	Oster
20 mL luer lock syringe	Terumo	6SS+20L	Multiple suppliers: Medshop Australia/Terumo
21 G IV needle	Terumo	SG3-1225	Multiple suppliers:Medshop Australia/Terumo
#4 scalpel handle	Austvet	AD010/04	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
#22 scalpel baldes	Austvet
Gillies tissue forceps	Austvet	AB430/15	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Metzenbaum curved dissecting scissors	Austvet	AC101/14	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Deaver retractor	Surgical Instruments	23.75.03	Multiple suppliers: Surgical Instrument/Austvet
Hohmann retractor	Austvet	KA173/35	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Mayo suture scissors	Austvet	AC911/14	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Needleholder 14 cm	EliteMedical	18-1030	Multiple suppliers: EliteMedical/Austvet
CMT 3.5 mm Brad-Point Drill	Carbatec	516-035-51	Multiple suppliers: Southeast Tool/Carbatec
Drill Bit Stop 4 mm	Drill Warehouse	20121600	Multiple suppliers: Amazon
Bosch 10.8 V Cordless Angle Drill	Get Tools Direct	GWB10.8V-LIBB	Multiple suppliers:Bunnings/Get Tools Direct
Autoclavable veterinary drill bag	AustVet	DRA043-AV	AustVet
2-0 absorbable synthetic braided sutures	Ethicon	VCP335H	Ethicon
3-0 absorbable synthetic braided sutures	Ethicon	VCP232H	Ethicon
Siemens 3 Tesla Skyra Widebore MRI	Siemens	N/A	Siemens
9.4 Tesla Agilent (Varian) MRI	Agilent Technologies	N/A	Agilent Technologies
Atomscope HF 200 A Radiogaph	Radlink	330003A	Multiple Suppliers: Radlink/DLC Australia
Veterinary Pulse Oximiter	DLC	192500A	Multiple suppliers: DLC Australi Pty Ltd/AustVet