側方腹腔ドリルビット傷害を利用した羊の腰椎椎間板変性モデル

要約

椎間円板の変性は、背痛および世界的な障害の主要な原因に大きく寄与する。椎間板変性の多くの動物モデルが存在する。一貫した椎間板損傷および再現性のある椎間板変性を達成するドリルビットを利用して、椎間板変性のヒツジモデルを実証する。

要約

椎間板の変性は、背痛の発症および世界的な障害の主要原因に大きく寄与する。椎間板変性の数多くの動物モデルが開発されている。理想的な動物モデルは、形態、生体力学的性質、および脊索細胞の欠如に関して、ヒト椎間板を酷似して模倣すべきである。ヒツジ腰椎椎間板モデルは、これらの基準を満たす。本発明者らは、横方向の後腹膜アプローチによるドリルビット損傷を利用した椎間板変性のヒツジモデルを提示する。側方アプローチは、ヒツジ背骨への伝統的な前方アプローチに伴う切開および潜在的な罹患率を有意に減少させる。ドリルビットの損傷方法を利用することにより、一定の程度の椎間板変性を開始する、正確で寸法の一貫した再現性のある損傷を生成する能力が得られる。環状の焦点の性質核脊髄欠損は、焦点椎間板ヘルニアの臨床状態をより密接に模倣する。羊はこの手順に従って急速に回復し、通常は移動して1時間以内に食べています。椎間板変性が起こり、羊は8週間の期間で検死およびその後の分析を受ける。我々は、椎間板変性のドリルビット損傷モデルが、従来の環状損傷モデルよりも利点があると考えている。

概要

腰痛は世界中の障害の主要原因です¹ 。腰椎椎間板変性に関連する椎間板形成性疼痛は、腰痛の重大な原因と考えられている² 。変性プロセスの理解を広げ、潜在的な治療法の研究のために、椎間板疾患の信頼できる動物モデルに対する需要が高まっている。

椎間板変性の数多くの動物モデルが存在する³ 。変性椎間板疾患の研究に用いられる動物モデルは、マウス^4から 、イヌ⁵ 、ヒツジ⁶ 、および非ヒト霊長類⁷などのより大きな哺乳動物までの大きさの範囲にある。椎間板変性を誘発するために使用される方法は、機械的（ 例えば、椎間板の圧迫 （ 例えば、化学的核分解⁵ ）、またはそれほど一般的ではない自発的変性（ 例えば 、砂ラット⁹ ）を含むが、これらに限定されない。

人間の椎間板変性の複雑さを考えると、完璧な動物モデルは存在しない。しかし、この状態を模倣するために適切な動物モデルを選択する際の重要な考慮事項が確認されている³ 。このような考察には、脊索細胞（ヒト、羊、ヤギおよび軟骨異形成犬の成体核膿瘍には存在しないが、ほとんどの哺乳類には存在する可能性のある前駆細胞機能¹⁰を有する原始細胞）、ヒトおよび動物に対する椎間板および椎間板の類似性、臨床的状態と同等の生体力学的力、機械的および倫理的考察³ 。

jove_content ">ヒト以外の霊長類は、上記の基準の多くを満たしています。自然発生した椎間板変性症のBaboonとmacaqueモデルは、11,12,13に記載されています。どちらの種も、直立姿勢または半直立姿勢しかし、倫理的かつ実践的な考慮（ 例えば、費用、住宅、自発的変性の発症の遅延）は、多くの機関でその使用を制限している。

ヒツジ背骨は、ヒトの背骨10,14,15との細胞、生体力学的および解剖学的類似性を含む利点を有する、椎間板変性の確立されたモデルである。ヒツジの4倍の体格にもかかわらず、羊の腰椎椎間板はヒトの椎間板と同様のストレスを受けるs = "xref"> 14。ヒツジモデルは、非ヒト霊長類モデルよりも、倫理的観点からより広く受け入れられている。変性プロセスを開始するための様々な方法が記載されており、その多くは椎間板への直接アクセスを必要とする。仙骨領域における脊髄の終結およびヒツジ腰椎における後縦靭帯の骨化のために、椎間板への後方アプローチは技術的に困難であり、ヒツジ¹⁶ではそれほど一般的ではない。羊の腰椎への伝統的な接近ルート、 すなわち 、前部または前外側アプローチを介して、大きな腹部の切開が必要であり、ヘルニアのリスクを伴い、内臓の内臓および神経血管構造に損傷を与える¹⁶ 。従属腹部領域から離れた比較的小さい側方切開部の使用は、そのようなリスクを減少させる可能性がある¹⁷ 。

私たちは羊毛を提示する最小侵襲性側方アプローチを介して実施されたドリルビット損傷を使用した変性腰椎椎間板疾患の1例を経験し、Zhang らの研究によって触発された。 ¹⁸ 。このプロトコールの目標は、容易に再現性があり、一貫した傷害を生じ、安全で耐容性が高い信頼性の高い腰椎椎間板損傷モデルを可能にすることである。このアプローチは、椎間板変性または再生療法の研究のための伝統的な外科的切除法（未発表データ）で観察されたものより軽度の腰椎椎間板変性を誘導しようとする研究者に適している。これらの知見は、今後の刊行物に記載される。

プロトコル

この原稿で詳述されているプロトコルは、Monash University Animal Ethicsの動物保護ガイドラインに従っています。このプロトコルに関する動物倫理の承認は、Monash University動物倫理によって認められています。倫理承認番号：MMCA / 2014/55

1.羊の準備

注：2〜4歳のEwesを使用した。

1. 麻酔前18時間の高速羊。操作^19の前に6-12時間まで動物に水を供給する。
2. 手術室への移送を容易にするために、塩酸メデトミジン（0.015-0.020mg / kg）の静脈注射により動物を鎮静させる。
   注：メデトミジン塩酸塩は、手術室への移送のために、他の動物との分離に伴う動物のストレスおよびかき混ぜを軽減するのに役立つ。
3. 手術室への到着時に麻酔を誘導するためにチオペンオン（10〜13mL / kg）を注入する。
4. 予防的イントラを管理する静脈内抗生物質（アモキシシリン1g IV）をチオペンタール注射直後に投与する。
5. 気管内チューブ²⁰内径7.5〜9mmの挿管羊。
6. 2L /分の流速で100％酸素中で吸入イソフルラン（2〜3％）を用いて麻酔を維持する。羊の耳にパルスオキシメータを取り付けます。
7. 羊のバイタルサイン（心拍数、呼吸数、酸素飽和度、パルスオキシメーター、観察）と意識レベルを密接に監視します。
   注：自発的な咀嚼、活動的な逆流、および自発的な動きなどの軽い麻酔の指標は、麻酔のレベルの上昇を促すはずです。緊急の麻酔の軽減を示す赤旗の徴候には、呼吸障害および重度の徐脈が含まれる。目の回転は、羊¹⁹の麻酔深度の一貫した指標ではありません。

ディスクレベルと切開

1. sを集める獣医クリッパー、20mLルアーロックシリンジ、21G IV針、＃4メスハンドル、＃22メスブレード、Gillies組織鉗子、メッツェンバム湾曲解剖はさみ、Deaverリトラクター、Hohmannリトラクターブレード、3.5mm Bradドリルビットストップ、ドリル、オートクレーブ可能な獣医ドリルバッグ、針ホルダー、2-0吸収性合成編組縫合糸、3-0吸収性合成編組縫合糸およびMayo縫合はさみを含む。
2. 操作スイートを準備します。 70％エタノールで手術台と計器スタンドを掃除してください。手術前にすべての手術器具をオートクレーブする。術前麻酔検査を行う。
3. 羊を右の横の位置で手術台の上に置きます。
4. 電子クリッパを使用して、下側肋骨によって上方に定義された領域を、腸骨によって下側に、対側腰部横断プロセスによって内側に、同側腰部横断プロセスに対して約10cm横に剃る。
5. 外科切開部位のランドマークのための腸骨稜、腰部横断プロセス（L1〜6）および肋骨 - 脊柱角を触診する。これらのランドマークを無菌ペンでマークしてください。
6. クロルヘキシジンとアルコール性ヨウ素消毒洗浄液で消毒することにより、側方腹部を準備する。
7. 手術中の標準的な手術無菌技術を観察する。手術チームは手術前にスクラブを行う。外科手術部位の上に滅菌有孔の四角いドレープを置き、オーバーヘッドテーブルに大きな滅菌四角いドレープを置きます。
   1. 操作の前に手術部位内で使用されるすべての項目を滅菌する。手術中の手術部位の無菌性を監視し、維持する。滅菌現場に導入されたすべての品目が滅菌され、滅菌された状態で移送されるようにする。
8. 外科的処置中に視覚化を容易にするために、手術用ルーペの倍率およびヘッドライトを使用する。
9. 縦切開する＃4のメスに取り付けられた＃22のメスブレードを、椎骨間の関心対象レベルの上下に1cmから2cmの腰の横方向のプロセスと平行に使用する。
   注：切開計画に関する詳細は、ディスカッションに記載されています。
10. 下にある皮下組織と腹部の筋肉組織の側面を分けるために、単極ジアテルミーを使います。関心のある椎間板の上下の腰部横断プロセスの先端に向けて解剖を指示する。
11. 胸腰部筋膜を横方向のプロセスへの取り付け時に縦に分割する。
12. 基礎となる四肢腰部 、腰筋、および横行神経血管束を視覚化し、保存する。
13. ジアテルミーを使用して止血を維持する。
14. 露出した椎間diで腹膜の平面と後部腹壁の筋肉の間で指を掃引するscレベルを用いてデジタル鈍的切開を行う。
15. 椎間円板をさらに露出させるために、Deaverリトラクターを使用して四分円腰部および腰筋を後部後退させる。
16. 凹型椎体および凸状椎間板のための触角。
17. リトラクタをディスクのすぐ上に置き、腰部血管が損傷しないように注意してください。
18. ヘッドライト付きの手術用ルーペ倍率を使用して、下側の終板に対して約1cmの尾側に位置する腰部血管を特定する。
19. 術中X線を行い、椎間板のレベルを確認します。 ²¹
    注：ラジオグラフ設定：47kV; 4mAs ²¹
20. 必要なディスクレベルに応じて、周囲の構造と添付ファイルを以下のように分離して椎間板を露出させます。
    1. レベルL3 / 4以上では、筋肉のアタッチメントをディscを使用した。
    2. レベルL4 / 5以下の場合は、双極性のジアテルミーとはさみを使用して、厚い筋肉のアタッチメントをディスク上に鋭く分割します。
       注：L6 / S1ディスクは、腸骨稜の閉塞のためにアクセスするのが難しい場合があります。側方アプローチを介してアクセスが達成できない場合、前方アプローチを利用することができる。

3.ドリルビットの傷害

注：術前計画には、傷害/治療レベルおよびコントロールレベルの割り当てが含まれます。レベル配分に関するさらなる情報は、ディスカッションで見つけることができます。

1. 椎間円板の左の側方および前方の四肢を観察することによって、ドリルビットの進入点を定義する。
   注：エントリーポイントは、この左前側四分円（ディスクの前側および側端で定義される）の中間点に位置しています。ドリルビットは、この進入点に、目的の軌跡で挿入されます椎間板の中心に向けて、頭側から鉛直方向にわずかに向けられる。
2. ブラッドポイントのドリルビットをパワードリルに合わせます。ドリルビットの直径が椎間板の高さよりわずかに小さいこと、 すなわち 60-70kgのヒツジの腰椎椎間板の場合〜3.5mmであることを確認する。
   1. ドリルビットストップを適用して、腰椎の直径の約半分の保護されていないドリルビット長、 すなわち 60-70kgのヒツジの腰椎椎間板の〜12mmを提供する。
3. エントリーポイントにドリルビットを適用し、椎間板の中心にわずかに頭蓋骨のある軌跡で指示します。わずかな頭蓋の角度は、終板損傷のリスクを最小限にすることである。
4. ドリルビットを1秒間低出力でドリルで椎間板にゆっくりと進めます。過度の抵抗に遭遇した場合、わずかな頭蓋または尾の様式で軌道を調整する
   注：そのような過度の抵抗はエンドプレートとの接触を示している可能性があります。

4.閉鎖

1. 止血が達成されたら、Ringersの溶液で傷口を洗浄します。
2. 外側の腹壁組織に2-0の吸収性合成編組縫合糸を使用し、皮膚に連続した3-0個の未染色吸収性合成編組皮下縫合糸を使用して、層状閉鎖を行うのが好ましい。

5.術後管理

1. 術後鎮痛のために鼠径部にフェンタニル経皮パッチ（75μg/ h）を3日間置く。
2. さらに、必要に応じて、静脈内投与のブプレノルフィン（0.005-0.01 mg / kg）を使用してください。
3. 吸入麻酔薬を止める。自発呼吸が起こったら、気管内チューブを外す。
4. 一定の観察の下で動物を保持ケージ内で回復させる。
   注：動物は十分な注意を回復するまで無人で放置しないでください胸骨臥位を保持するためのusness。
5. 動物が完全に警戒し立ったら、食物と水を再導入する。完全に回復したら、動物を他の動物とペンを持っている手術施設に戻してください。
6. 24時間綿密に監視し、1週間の観察を続ける。術後の痛みや苦痛の証拠を監視する。
   注：術後経皮フェンタニルパッチを3日間適用すると、十分な鎮痛作用が得られるはずです。追加の鎮痛薬の要求は、動物のレビューを促すはずである。
7. 正常に羊を供給し、羊が制限なく通常の活動を行うことを許可する。跛行のような神経学的欠損の兆候がないか羊を観察する。
   注記：ドリルビット損傷法による椎間板欠損は、椎間板の前外側面にあり、損傷深さはドリルビットストップによって中核に制限されます。神経要素は、椎間板の後方/後方側に位置するので、症候性髄核に続発する神経妥協のリスクは遠隔である。モデルのこの解剖学的特徴は、髄核ヘルニアの有無にかかわらず、椎間板変性を区別するための神経学的検査の使用を排除する。
8. 実験期間の終わりに安楽死と剖検を待つために、羊を大学の農場に戻してください。

6.安楽死

1. ドリルビット椎間板損傷後の適切な時間間隔でヒツジ安楽死を実施する。
2. 安楽死のために静脈内ペントバルビトンナトリウム（> 100 mg / kg）を注入する。

結果

術前に、ヒツジは根底にある椎間板の形態および変性の評価のためのベースライン3T磁気共鳴画像法（MRI）を受けた。羊は、椎間板レベルの確認および椎間板高さ指数の計算のために、追加の術中側方X線撮影を受けた。 図1に 、3T MRIの術前矢状面スライスと術中X線写真を示します。

ディスカッション

この最小侵襲性の側方アクセスアプローチは、このシリーズで観察された術後ヘルニア、腹部裂開または感染症がなく、有効かつ安全である。深さ止めを有するドリルビット椎間板損傷モデルの使用は、既知の寸法（ すなわち 、本研究では直径3.5mm×深さ12mmの損傷）の一貫した椎間板損傷を誘発する再現可能な方法を提供する。我々の経験では、この方法は、従来の卵形メス刃の腰椎...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine Hydrochloride (10 mL Injection)	Therapon/Zoetis	PFIDOM10	Multiple suppliers: Zoetis/Ilium
Thiopentone	Troy	Triothiopentone	Multiple suppliers: Neon Laboratories, Jagsonphal Pharmaceuticals
Isoflurane (2 - 3 % in oxygen)	Baxter	AHN3636	Multiple suppliers: Baxter/VetOne
Amoxicillin parenteral	GlaxoSmithKline	JO1CA04	Multiple suppliers: GlaxoSmithKline/Merck
Bupivacaine (0.5% Injection 20 mL)	Pfizer	005BUP001	Multiple suppliers: Pfizer/AstraZeneca
PVD Iodine Solution	Jurox	61330	Multiple suppliers: Jurox/Orion
Chlorhexidine 5%w/v	Jurox	Chlorhex C 5L (SCRUB)	Multiple suppliers: Jurox/Pfizer
Transdermal Fental Patch (75 μg/h)	Janssen-Cilag	S8-Dur7.5	Multiple suppliers: Sandoz
Buprenorphine iv	Jurox	504410	Multiple suppliers: LGM Pharma
Atipamezole (Antisedan 0.06 mg/kg - 0.08 mg/kg)	Zoetis	PFIANT10	Multiple suppliers: Ilium
Oster Golden A5 2-Speed Clippers	Oster	078005-140-003	Oster
20 mL luer lock syringe	Terumo	6SS+20L	Multiple suppliers: Medshop Australia/Terumo
21 G IV needle	Terumo	SG3-1225	Multiple suppliers:Medshop Australia/Terumo
#4 scalpel handle	Austvet	AD010/04	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
#22 scalpel baldes	Austvet
Gillies tissue forceps	Austvet	AB430/15	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Metzenbaum curved dissecting scissors	Austvet	AC101/14	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Deaver retractor	Surgical Instruments	23.75.03	Multiple suppliers: Surgical Instrument/Austvet
Hohmann retractor	Austvet	KA173/35	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Mayo suture scissors	Austvet	AC911/14	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Needleholder 14 cm	EliteMedical	18-1030	Multiple suppliers: EliteMedical/Austvet
CMT 3.5 mm Brad-Point Drill	Carbatec	516-035-51	Multiple suppliers: Southeast Tool/Carbatec
Drill Bit Stop 4 mm	Drill Warehouse	20121600	Multiple suppliers: Amazon
Bosch 10.8 V Cordless Angle Drill	Get Tools Direct	GWB10.8V-LIBB	Multiple suppliers:Bunnings/Get Tools Direct
Autoclavable veterinary drill bag	AustVet	DRA043-AV	AustVet
2-0 absorbable synthetic braided sutures	Ethicon	VCP335H	Ethicon
3-0 absorbable synthetic braided sutures	Ethicon	VCP232H	Ethicon
Siemens 3 Tesla Skyra Widebore MRI	Siemens	N/A	Siemens
9.4 Tesla Agilent (Varian) MRI	Agilent Technologies	N/A	Agilent Technologies
Atomscope HF 200 A Radiogaph	Radlink	330003A	Multiple Suppliers: Radlink/DLC Australia
Veterinary Pulse Oximiter	DLC	192500A	Multiple suppliers: DLC Australi Pty Ltd/AustVet