Modelo de Degeneração de Disco Intervertebral Lumbar Ovino Utilizando uma lesão retroperitoneal lateral

Resumo

A degeneração do disco intervertebral é um contribuinte significativo para dor nas costas e uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo. Existem numerosos modelos animais de degeneração de disco intervertebral. Demonstramos um modelo ovino de degeneração de disco intervertebral, utilizando uma broca, o que atinge uma lesão de disco consistente e nível reprodutível de degeneração de disco.

Resumo

A degeneração de disco intervertebral é um contribuinte significativo para o desenvolvimento de dores nas costas ea principal causa de incapacidade em todo o mundo. Inúmeros modelos animais de degeneração de disco intervertebral foram desenvolvidos. O modelo animal ideal deve imitar de perto o disco intervertebral humano no que se refere à morfologia, às propriedades biomecânicas e à ausência de células notocordais. O modelo de disco intervertebral lombar de ovelha cumpre esses critérios. Apresentamos um modelo ovino de degeneração de disco intervertebral utilizando uma lesão de broca através de uma abordagem retroperitoneal lateral. A abordagem lateral reduz significativamente a incisão e potencial morbidade associada à abordagem tradicional anterior à espinha ovina. A utilização de um método de ferimento de broca proporciona a capacidade de produzir uma lesão consistente e reprodutível, de dimensões precisas, que inicia um grau consistente de degeneração de disco intervertebral. A natureza focal daE o defeito do núcleo pulposo mais de perto imita a condição clínica da herniação focal do disco intervertebral. As ovelhas recuperam rapidamente após este procedimento e são tipicamente móveis e comendo dentro da hora. A degeneração do disco intervertebral ocorre e as ovelhas passam por necropsia e subsequente análise em períodos de oito semanas. Acreditamos que o modelo de lesão de broca de degeneração de disco intervertebral oferece vantagens sobre os modelos de lesões anulares mais convencionais.

Introdução

A dor lombar é a principal causa de incapacidade em todo o mundo ¹ . A degeneração discal intervertebral lombar associada à dor discogênica é considerada um contribuinte significativo para a dor lombar ² . Há uma demanda crescente por modelos animais confiáveis ​​de doença de disco intervertebral para ampliar a compreensão do processo degenerativo e para a investigação de terapias potenciais.

Existem numerosos modelos animais de degeneração de discos intervertebrais ³ . Os modelos de animais utilizados na investigação da doença degenerativa do disco variam em tamanho desde ratinhos ⁴ a mamíferos maiores tais como cães ⁵ , ovelhas ⁶ e primatas não humanos ⁷ . Os métodos utilizados para induzir degeneração de disco intervertebral podem ser amplamente classificados nas categorias de mecânica ( por exemplo, compressor de disco intervertebral N ⁸ ou lesão cirúrgica ⁶ ), química ( por exemplo, nucleólise química ⁵ ) ou, menos comumente, degeneração espontânea ( por exemplo, o rato de areia ⁹ ).

Dada a complexidade da degeneração do disco intervertebral humano, um modelo animal perfeito não existe. Contudo, foram identificadas considerações importantes na escolha de um modelo animal apropriado para imitar esta condição de perto ³ . Tais considerações incluem a ausência de células notocordais (células primitivas com possível função de células progenitoras ¹⁰ ausentes do núcleo adulto pulposo em humanos, ovelhas, cabras e cães condrodistróficos mas presentes na maioria dos mamíferos), semelhanças no tamanho do disco animal e do disco intervertebral em relação aos seres humanos, Forças biomecânicas comparáveis ​​à condição clínica, considerações mecanicistas e éticas ³ .

Os primatas não-humanos satisfazem muitos dos critérios acima descritos e foram descritos modelos de babuínos e macacos de degeneração espontânea de disco intervertebral ^{11 , 12 e 13.} Ambas as espécies passam grandes quantidades de tempo em posturas eretas ou semi-eretas - uma vantagem distinta Em relação a outros modelos animais, porém a consideração ética e prática ( por exemplo , despesa, moradia, atraso no início da degeneração espontânea) restringe seu uso em muitas instituições.

A espinha ovina é um modelo estabelecido de degeneração de disco intervertebral, com vantagens incluindo semelhanças celulares, biomecânicas e anatômicas com a coluna humana ^{10 , 14 , 15} . Apesar da estatura quadrupédica das ovelhas, o disco intervertebral lombar ovino é exposto a tensões semelhantes ao disco humanoS = "xref"> 14. O modelo ovino também é mais amplamente aceito, do ponto de vista ético, do que os modelos de primatas não-humanos. Métodos variados têm sido descritos para iniciar o processo degenerativo, muitos dos quais requerem acesso direto ao disco intervertebral. Devido à terminação da medula espinhal na região sacral e ossificação do ligamento longitudinal posterior na coluna lombar ovina, abordagens posteriores ao disco intervertebral são tecnicamente desafiadoras e menos comumente utilizadas nos ovinos ¹⁶ . As vias de acesso tradicionais à espinha lombar de ovelha, isto é , através de abordagens anterior ou anterolateral, requerem grandes incisões abdominais, apresentam riscos de hérnia e danos às vísceras internas e estruturas neurovasculares ¹⁶ . O uso de uma incisão lateral relativamente pequena longe das áreas abdominais dependentes pode diminuir tais riscos ¹⁷ .

Apresentamos uma moDel de doença de disco intervertebral lombar degenerativa usando ferimento de broca executada através de uma abordagem lateral minimamente invasiva e inspirado pelo trabalho de Zhang et. Al ¹⁸ . O objetivo deste protocolo é permitir que um modelo de lesão de disco lombar confiável que é prontamente reproduzível, produz uma lesão consistente, e é seguro e bem tolerado. Esta abordagem é bem adequada para os investigadores que procuram induzir um grau mais moderado de degeneração do disco intervertebral lombar do que a observada com a anulotomia cirúrgica tradicional (dados não publicados) para a investigação de degeneração de disco intervertebral ou terapias regenerativas. Estes resultados serão descritos numa próxima publicação.

Protocolo

O protocolo detalhado neste manuscrito segue as diretrizes de cuidados com animais da Universidade de Monash Ética animal. A aprovação ética animal para este protocolo foi concedida pela Monash University Animal Ethics. Número de aprovação ética: MMCA / 2014/55

1. Preparação de Ovinos

NOTA: Foram utilizadas ovelhas com idade entre dois e quatro anos.

1. Ovelha rápida por 18 h antes da anestesia. Fornecer aos animais acesso à água até 6-12 horas antes da operação ¹⁹ .
2. Sedate animais por injecção intravenosa de cloridrato de medetomidina (0,015-0,020 mg / kg) para facilitar a transferência para suite operacional.
   NOTA: O cloridrato de medetomidina serve para reduzir o estresse e agitação animal associados à separação de outros animais para transferência para a suíte operacional.
3. Injectar tiopentona (10-13 mL / kg) para a indução da anestesia à chegada ao conjunto operacional.
4. Administrar profilaxiaAntibióticos venosos (amoxicilina 1 g IV) imediatamente após a injeção de tiopentona.
5. Intubar os ovinos utilizando um tubo endotraqueal de tamanho 7,5-9 mm (diâmetro interno) ²⁰ .
6. Manter a anestesia utilizando isoflurano inalado (2-3%) em oxigénio a 100% a um caudal de 2 L / min. Anexar um oxímetro de pulso para a orelha de ovelha.
7. Monitorar de perto os sinais vitais da ovelha (freqüência cardíaca, freqüência respiratória e saturação de oxigênio por oxímetro de pulso e observação) e nível de consciência.
   NOTA: Os indicadores de anestesia leve, como mastigação espontânea, regurgitação ativa e movimentos espontâneos, devem aumentar o nível de anestesia. Sinais de bandeira vermelha indicando urgente alívio da anestesia incluem comprometimento respiratório e bradicardia grave. A rotação do olho não é um indicador consistente da profundidade da anestesia em ovinos ¹⁹ .

2. Nível do Disco e Incisão

1. Coletar asFerramentas de urgência necessárias para este procedimento: tosquiadeiras veterinárias, seringa Luer-lock de 20 mL, agulha 21G IV, alça de bisturi # 4, lâminas de bisturi # 22, pinça de tecido Gillies, tesoura de dissecção curvada Metzenbaum, retractor Deaver, Hoja retractor Hohmann 3,5 mm Brad Broca de perfuração, broca, broca, saco de broca veterinária autoclavável, suporte de agulha, suturas sintéticas sintéticas absorventes 2-0, sutura trançada sintética absorvível 3-0 e tesoura de sutura Mayo.
2. Prepare o conjunto operacional. Limpe a mesa operativa eo suporte do instrumento com etanol a 70%. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da operação. Realizar a anestesia pré-operatória.
3. Coloque a ovelha na mesa de operação na posição lateral direita.
4. Usando cortadores eletrônicos, raspar a região definida superiormente pelas costelas inferiores, inferiormente pelo osso ilíaco, medialmente pelos processos transversos lombares contralaterais e aproximadamente 10 cm lateral aos processos transversos lombares ipsilaterais.
5. Palpar a crista ilíaca, os processos transversos lombares (L1-6) eo ângulo costo-vertebral para os pontos de referência para o local da incisão cirúrgica. Marque esses pontos de referência com uma caneta estéril.
6. Preparar o abdome lateral por desinfecção com clorhexidina e álcool-iodeto lavagem anti-séptica.
7. Observe as técnicas assépticas cirúrgicas padrão durante toda a operação. A equipe cirúrgica esfrega antes da operação. Coloque uma cortina quadrada fenestrada estéril sobre o local cirúrgico, e um grande quadrado estéril drapeja sobre a mesa.
   1. Esterilize todos os itens a serem utilizados dentro do local operatório antes da operação. Monitorar e manter a esterilidade do local cirúrgico ao longo da operação. Assegurar que todos os itens introduzidos no campo estéril são estéreis e transferidos de forma estéril.
8. Use ampliação de lupa cirúrgica e um farol para facilitar a visualização durante o procedimento cirúrgico.
9. Fazer uma incisão longitudinalUsando a lâmina de bisturi # 22 ligada à alça de bisturi # 4 paralela a 1 cm anterior a um a dois processos transversais lombares acima e abaixo dos níveis de interesse do disco intervertebral.
   NOTA: Mais informações sobre o planejamento da incisão podem ser encontradas na discussão.
10. Use a diatermia monopolar para dividir o tecido subcutâneo subjacente eo aspecto lateral da musculatura da parede abdominal; Direcionar a dissecção para as pontas dos processos transversos lombares acima e abaixo dos discos intervertebrais de interesse.
11. Divida a fáscia toracolombar longitudinalmente em sua ligação aos processos transversais.
12. Visualize e preserve o quadratus lumborum subjacente , os músculos psoas e os feixes neurovasculares que atravessam.
13. Manter a hemostasia através do procedimento usando diatermia.
14. Varrer os dedos entre o plano do peritônio e a musculatura posterior da parede abdominal na região intervertebral exposta.Sc para realizar dissecção digital sem corte.
15. Retrair os músculos quadratus lumborum e psoas posterolateralmente usando um retractor de Deaver para expor ainda mais os discos intervertebrais.
16. Palpar para os corpos intervertebrais côncavos e os discos intervertebrais convexos.
17. Posicione os retractores imediatamente sobre os discos e tome cuidado para garantir que os vasos lombares não sejam danificados.
18. Usando ampliação de lupa cirúrgica com um farol, identificar os vasos lombares que estão localizados aproximadamente 1 cm caudal à placa de extremidade inferior.
19. Realizar uma radiografia lateral intraoperatória para confirmar o nível do disco. ²¹
    Nota: Configurações da radiografia: 47kV; 4 mAs ²¹
20. Dependendo dos níveis de disco desejados, exponha o disco intervertebral separando as estruturas circundantes e anexos como abaixo.
    1. Para os níveis L3 / 4 e acima, varre os anexos musculares sobre o diSc utilizando dissecções digitais sem corte.
    2. Para os níveis L4 / 5 e abaixo, dividir nitidamente os anexos musculares tendinosos mais grossos sobre o disco usando diatermia bipolar e tesoura.
       NOTA: O disco L6 / S1 pode ser de difícil acesso devido à obstrução pela crista ilíaca. Se o acesso não puder ser realizado através da abordagem lateral, uma abordagem anterior pode ser utilizada.

3. Ferimento de broca

NOTA: O planejamento pré-operatório inclui a alocação de níveis de lesão / tratamento e níveis de controle. Mais informações sobre alocação de nível podem ser encontradas na discussão.

1. Definir o ponto de entrada da broca observando as extremidades laterais e anteriores do disco intervertebral.
   NOTA: O ponto de entrada está localizado no ponto médio deste quadrante anterolateral esquerdo (definido pelas extremidades anterior e lateral do disco). A broca é inserida neste ponto de entrada com uma trajetóriaPara o centro dos discos intervertebrais e dirigido ligeiramente cranial a perpendicular.
2. Coloque uma broca Brad-ponto na broca de potência. Certifique-se de que o diâmetro da broca é ligeiramente inferior à altura do disco intervertebral, ou seja, 3,5 mm para o disco intervertebral lombar em 60-70 kg de ovinos.
   1. Aplicar um batente de broca para fornecer um comprimento de broca sem proteção de aproximadamente metade do diâmetro do disco intervertebral lombar ie ~ 12 mm para discos intervertebrais lombares em 60-70 kg de ovinos.
3. Aplique a broca no ponto de entrada e direcione-a em uma trajetória ligeiramente cranial para o centro do disco intervertebral. A ligeira angulação craniana é minimizar o risco de lesão na placa terminal.
4. Avance a broca lentamente no disco intervertebral com a broca em baixa potência por 1 s. Ajustar a trajetória de forma ligeiramente cranial ou caudal se for encontrada resistência excessiva
   NOTA: TalResistência excessiva provavelmente indica contato com a placa final.

4. Encerramento

1. Uma vez que a hemostasia é atingida, irrigar a ferida com solução de Ringers.
2. Realizar o fechamento em camadas, preferencialmente usando suturas sintéticas sintéticas absorvíveis 2-0 para os tecidos da parede abdominal lateral e sutura subcutânea trançada sintética absorvível não-tingida 3-0 contínua para a pele.

5. Gestão pós-operatória

1. Colocar um remendo transdérmico de fentanil (75 μg / h) na região inguinal para analgesia pós-cirúrgica durante 3 dias.
2. Além disso, use buprenorfina intravenosa (0,005-0,01 mg / kg) para analgesia de reposição, se necessário.
3. Cesse o anestésico inalatório. Quando ocorrer respiração espontânea, remova o tubo endotraqueal.
4. Permitir que o animal para recuperar em uma gaiola de exploração sob observação constante.
   NOTA: O animal não deve ser deixado sozinho até que ele tenha recuperado conscio suficienteUsness para manter recumbency esternal.
5. Uma vez que o animal está totalmente alerta e em pé, re-introduzir alimentos e água. Uma vez totalmente recuperado, devolva o animal à sua instalação operativa segurando caneta com outros animais.
6. Monitorar de perto durante 24 horas e continuar a observação durante uma semana. Monitorar a evidência de dor pós-cirúrgica ou angústia.
   NOTA: O adesivo transdérmico pós-operatório de fentanil aplicado durante três dias deve fornecer analgesia suficiente. Requisitos analgésicos adicionais devem levar à revisão dos animais.
7. Alimentar as ovelhas normalmente, e permitir que as ovelhas para realizar atividades normais, sem restrições. Observe as ovelhas para qualquer evidência de déficit neurológico, como claudicação.
   NOTA: O defeito do disco intervertebral produzido pelo método de lesão do broca é sobre a face ântero-lateral do disco ea profundidade da lesão é limitada pelo batente da broca ao núcleo médio. Como os elementos neurais estão localizados posterior / posterolateral ao disco intervertebral,O risco de comprometimento neural secundário ao núcleo pulposo sintomático é remoto. Esta característica anatômica do modelo impede o uso do exame neurológico para distinguir a degeneração do disco intervertebral com e sem herniação do núcleo pulposo.
8. Devolver as ovelhas à fazenda universitária para aguardar eutanásia e necropsia no final do período experimental.

6. Eutanásia

1. Realize a eutanásia dos ovinos em um intervalo de tempo apropriado após a lesão do disco intervertebral da broca.
2. Injectar pentobarbitona sódica por via intravenosa (> 100 mg / kg) para a eutanásia.

Resultados

Pré-operati- vamente, os ovinos foram submetidos a uma ressonância magnética 3T (MRI) para avaliação da morfologia e degeneração do disco intervertebral subjacente. Ovelhas foram submetidas a radiografia lateral intra-operatória adicional para confirmação do nível do disco intervertebral e cálculo do índice de altura do disco. Uma fatia de plano sagital pré-operatório de 3T MRI e uma radiografia intra-operatória são demonstrados na Figura 1 .

Discussão

Esta abordagem de acesso lateral minimamente invasiva é eficaz e segura, sem hérnia pós-operatória, deiscência de ferida abdominal ou infecção observada nesta série. A utilização do modelo de lesão de disco intervertebral com broca de perfuração com um batente de profundidade proporciona um método reprodutível de indução de uma lesão de disco intervertebral consistente de dimensão conhecida ( isto é, uma lesão de 3,5 mm de diâmetro x 12 mm de profundidade neste estudo). Em nossa experiênc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medetomidine Hydrochloride (10 mL Injection)	Therapon/Zoetis	PFIDOM10	Multiple suppliers: Zoetis/Ilium
Thiopentone	Troy	Triothiopentone	Multiple suppliers: Neon Laboratories, Jagsonphal Pharmaceuticals
Isoflurane (2 - 3 % in oxygen)	Baxter	AHN3636	Multiple suppliers: Baxter/VetOne
Amoxicillin parenteral	GlaxoSmithKline	JO1CA04	Multiple suppliers: GlaxoSmithKline/Merck
Bupivacaine (0.5% Injection 20 mL)	Pfizer	005BUP001	Multiple suppliers: Pfizer/AstraZeneca
PVD Iodine Solution	Jurox	61330	Multiple suppliers: Jurox/Orion
Chlorhexidine 5%w/v	Jurox	Chlorhex C 5L (SCRUB)	Multiple suppliers: Jurox/Pfizer
Transdermal Fental Patch (75 μg/h)	Janssen-Cilag	S8-Dur7.5	Multiple suppliers: Sandoz
Buprenorphine iv	Jurox	504410	Multiple suppliers: LGM Pharma
Atipamezole (Antisedan 0.06 mg/kg - 0.08 mg/kg)	Zoetis	PFIANT10	Multiple suppliers: Ilium
Oster Golden A5 2-Speed Clippers	Oster	078005-140-003	Oster
20 mL luer lock syringe	Terumo	6SS+20L	Multiple suppliers: Medshop Australia/Terumo
21 G IV needle	Terumo	SG3-1225	Multiple suppliers:Medshop Australia/Terumo
#4 scalpel handle	Austvet	AD010/04	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
#22 scalpel baldes	Austvet
Gillies tissue forceps	Austvet	AB430/15	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Metzenbaum curved dissecting scissors	Austvet	AC101/14	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Deaver retractor	Surgical Instruments	23.75.03	Multiple suppliers: Surgical Instrument/Austvet
Hohmann retractor	Austvet	KA173/35	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Mayo suture scissors	Austvet	AC911/14	Multiple suppliers: Austvet/SurgicalInstruments
Needleholder 14 cm	EliteMedical	18-1030	Multiple suppliers: EliteMedical/Austvet
CMT 3.5 mm Brad-Point Drill	Carbatec	516-035-51	Multiple suppliers: Southeast Tool/Carbatec
Drill Bit Stop 4 mm	Drill Warehouse	20121600	Multiple suppliers: Amazon
Bosch 10.8 V Cordless Angle Drill	Get Tools Direct	GWB10.8V-LIBB	Multiple suppliers:Bunnings/Get Tools Direct
Autoclavable veterinary drill bag	AustVet	DRA043-AV	AustVet
2-0 absorbable synthetic braided sutures	Ethicon	VCP335H	Ethicon
3-0 absorbable synthetic braided sutures	Ethicon	VCP232H	Ethicon
Siemens 3 Tesla Skyra Widebore MRI	Siemens	N/A	Siemens
9.4 Tesla Agilent (Varian) MRI	Agilent Technologies	N/A	Agilent Technologies
Atomscope HF 200 A Radiogaph	Radlink	330003A	Multiple Suppliers: Radlink/DLC Australia
Veterinary Pulse Oximiter	DLC	192500A	Multiple suppliers: DLC Australi Pty Ltd/AustVet