El Modelo Invertido del Corazón para la Colección de Transudado Intersticial del Corazón de la Rata Aislada

Resumen

Este protocolo describe un método para recoger fluido intersticial cardíaco del corazón de rata perfundido aislado. Para separar físicamente el transudato intersticial del perfusado de efluente venoso coronario, se invierte el corazón perfundido de Langendorff y se recoge el transudato (líquido intersticial) formado en la superficie cardiaca usando un tapón de látex blando.

Resumen

El presente protocolo describe un enfoque único que permite la recolección de transudado cardíaco (TC) del corazón de rata aislado, con solución salina perfundida. Después del aislamiento y la perfusión retrógrada del corazón de acuerdo con la técnica de Langendorff, el corazón se invierte en una posición invertida y se estabiliza mecánicamente mediante un catéter de balón insertado en el ventrículo izquierdo. Luego, se coloca una tapa delgada de látex - previamente moldeada para que coincida con el tamaño promedio del corazón de la rata - sobre la superficie epicárdica. La salida de la tapa de látex está conectada a tubos de silicio, con la abertura distal 10 cm por debajo del nivel de base del corazón, creando una ligera succión. La TC producida continuamente en la superficie epicárdica se recoge en viales enfriados con hielo para un análisis posterior. La tasa de formación de TC varió de 17 a 147 μL / min (n = 14) en los corazones control y en infarto, lo que representa 0,1-1% del perfusato de efluente venoso coronario. Análisis proteómico y alto perfoLa cromatografía líquida de rmance (HPLC) reveló que la CT recogida contiene un amplio espectro de proteínas y metabolitos purinérgicos.

Introducción

La insuficiencia cardíaca (IC) es la principal causa de muerte en humanos en todo el mundo ¹ . La IC suele producirse a causa de miocarditis, inseminación isquémica al miocardio y remodelado ventricular izquierdo, lo que lleva al deterioro progresivo de la función contráctil cardíaca ya la calidad de vida de los pacientes. Aunque los avances en cardiología y cirugía cardíaca han reducido notablemente la mortalidad por HF, sirven meramente como "retardadores" transitorios de un proceso de enfermedad inevitablemente progresivo que tiene una morbilidad significativa. Por lo tanto, la falta actual de tratamiento efectivo subraya la necesidad de identificar nuevos objetivos moleculares que pueden prevenir o incluso revertir la IC. Esto incluye cambios en la matriz extracelular, la respuesta inmune no controlada del corazón, y las interacciones entre las células cardíacas y no cardíacas [ ^2] .

Es importante reconocer que el microambiente que las células cardíacas están expuestas a la direcciónTamente la respuesta inmune y regenerativa del corazón lesionado. En el corazón aislado, de perfusión salina, se genera CT en la superficie del corazón en forma de pequeñas gotitas que se derivan del espacio intersticial fluido ( es decir, microambiente), tanto en condiciones fisiológicas como fisiopatológicas ^{3 , 4 , 5} . Por lo tanto, el análisis de la CT ( es decir, el líquido intersticial) puede ayudar a identificar los factores que regulan el metabolismo cardíaco y la función contráctil ⁶ o influyen en las funciones de las células inmunes después de la migración en el corazón lesionado. Potencialmente, esto puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas para el tratamiento de la IC.

La recolección de TC a partir de corazones murinos es técnicamente difícil. En los corazones normales de Langendorff-perfundidos, la colección exclusiva de CT es difícil debido a que la mezcla de la CT con la coronariaEl perfusato de efluente venoso diluye impredeciblemente cualquier concentración de metabolitos / enzimas liberados del espacio intersticial. Una estrategia posible para superar esta limitación es excluir el efluente venoso mediante la cánula pulmonar y la ligadura simultánea de la vena pulmonar ⁷ . Sin embargo, este método enfrenta dificultades asociadas con la canulación y la ligadura de la arteria y vena pulmonar, provocando una fuga potencial de efluente venoso en el transudado cardíaco. El concepto de usar un modelo de corazón reverso fue introducido por primera vez por el grupo de Kammermeier, que invirtió el corazón aislado y perfundido en una posición invertida y colocó una delgada capa de látex en la superficie epicárdica para tomar continuamente CT sin la contaminación del efluente venoso ^{8 , 9} . Usando este procedimiento, se demostró que la TC proporciona una medida muy sensible de los metabolitos liberados desde el corazón ⁹ ,La transferencia capilar de ácidos grasos ⁸ , y partículas virales ¹⁰ .

Más recientemente, los factores parácrinos que pueden regular la respuesta inmune local y aumentar la angiogénesis cardíaca ¹¹ se han implicado en los efectos beneficiosos de la terapia basada en células madre para la enfermedad cardíaca. El análisis de la TC en el corazón invertido puede ayudar a identificar químicamente estos factores paracrinos individuales. Además, la TC puede ayudar a identificar los factores implicados en la activación in vivo de las células inmunes en el corazón.

La descripción detallada de la colección de CT desde la superficie del corazón, proporcionada aquí, es experimentalmente útil para los investigadores que estudian la interacción de células inmunitarias, fibroblastos, células endoteliales y cardiomiocitos en relación con la función cardíaca global. Como se mencionó anteriormente, el fluido intersticial lleva la información para la comunicación de célula a célula dentro del corazón,Que se puede evaluar convenientemente mediante la recolección de CT. La descripción técnica detallada, incluyendo un protocolo de vídeo de cómo recolectar CT del corazón invertido, debe facilitar la aplicación futura de esta técnica única.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por la agencia reguladora local ( LANUV de Nordrhein-Westfalen, Alemania) y se realizaron de acuerdo con las directrices de uso animal. Los animales fueron alimentados con una dieta estándar de chow y recibieron agua del grifo ad libitum . Todos los equipos y productos químicos necesarios para cada paso del experimento están disponibles en la Tabla de Materiales .

1. Preparación de la Caperuza de Látex y del Balón Intraventricular

1. Haga un molde de aluminio usando una fresadora que coincida con el tamaño promedio del corazón de la rata (peso corporal de 300-350 g). Pulir el molde con papel de esmeril superfino (10/0).
   NOTA: Las métricas detalladas del molde se muestran en la Figura 1A .
2. Fije verticalmente el cuello del molde de aluminio a la fresadora para preparar la tapa de látex.
   NOTA: La fresadora hace que el molde gire lentamente. Alternativamente, se puede usar un motor eléctrico. Li
3. Verter 20 ml de látex líquido (adquirido comercialmente, véase la tabla de materiales ) en un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml.
4. Baje el molde hasta que todo el cuerpo del molde se sumerja en la solución de látex.
5. Levante lentamente el molde (5 cm / min) mientras gira.
6. Mantenga girando el molde durante 15 min más, hasta que el látex en la superficie del molde se solidifique.
7. Añadir alrededor de 1 g de talco en polvo a la superficie del molde (ya cubierto por una fina película de látex) para evitar daños mientras se desprende.
8. Desprenda suavemente con los dedos la tapa de látex ya secada de la superficie del molde; La tapa de látex está ahora lista para su uso ( Figura 1B ).
9. Conecte la salida de la tapa de látex a una tubería de silicio de 15 cm (ID = 0,2 mm), utilizada posteriormente para la recolección de CT.
10. Llenar el globo de látex ventricular con agua y fijarlo firmemente en una cánula metálica en forma de L conectada a una jeringa llena de agua de 1 ml (> Figura 1C).
    NOTA: Esto se usará para asegurar el posicionamiento vertical del corazón (ver abajo).
11. Asegúrese de que el globo esté hermético realizando varias pruebas de desinflado / inflado con la jeringa de 1 mL adjunta.
12. Conecte la cánula, a través de una parada de tres vías, a un transductor de presión para la futura medición de la presión desarrollada intraventricular ( Figura 1C ).

2. Preparación del tampón de Krebs-Henseleit (KHB) y del sistema de perfusión de Langendorff

1. Configure un sistema de perfusión Langendorff utilizando el modo de flujo constante (impulsado por una bomba de rodillo) o de presión constante (generado por la presión estática en una columna de vidrio).
   NOTA: Los detalles de la preparación del corazón de Langendorff se han descrito previamente ¹² .
2. Preparar 2 L de un KHB modificado (en mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO4,7H2O, 1,21 K2HPO4 , 2,52 CaCl $ _₂ $ 2H $ _₂ $ O, 24,88 NaHCO _$ ₃ _$ , 8,30 D-glucosa y 2,0 piruvato sódico).
   1. Pesar todos los productos químicos, pero CaCl ₂ y disolverlos en 1,8 L de agua doblemente destilada en un matraz de 2-L.
   2. Burbujear el medio con carbógeno (95% O ₂ /5% CO ₂ ) durante al menos 5 min para equilibrar (pH: 7,4) bajo agitación magnética.
   3. Se a~naden 0,74 g de CaCl2.2H2O y se lleva el volumen total a 2 l con agua doblemente destilada.
   4. Seguir agitando y burbujeando el medio con carbógeno durante 5 minutos adicionales.
   5. Filtrar el KHB a través de un filtro de 0,2 μm para eliminar partículas pequeñas que pueden obstruir la microcirculación del corazón.
3. Preparación del sistema de perfusión de Langendorff.
   1. Colocar el KHB filtrado en un baño de agua precalentado (38 ° C); Seguir burbujeando con carbógeno para generar una presión de 100 cmH ₂ O insidEl depósito KHB.
   2. Conecte el depósito a la columna de vidrio para establecer una presión hidrostática de 100 cmH ₂ O para la perfusión de Langendorff con KHB; Continuar burbujeando el KHB dentro de la columna con carbógeno.
   3. Ajuste la temperatura del sistema de calentamiento para que la temperatura en la salida de la cánula aórtica sea 37 ° C.
   4. Asegúrese de que el sistema de tubos esté libre de burbujas.
   5. Oxígene el KHB con carbógeno durante 5 minutos más, hasta que el PO ₂ en el KHB alcance 500-600 mmHg (medido por un analizador de gases de sangre).
4. Configurar el sistema de perfusión para funcionar ya sea a una presión constante de 100 cmH ₂ O o con un flujo constante de alrededor de 10-20 ml / min mediante conmutación manual. Alternativamente, utilice un controlador de bomba intercambiable STH para cambiar instantáneamente al modo de perfusión.

3. Aislamiento y Canulación del Corazón

NOTA: ratas Wistar macho con pesos corporales de 300-350 g, de manera que los tamaños de los corazones coincidían con el tapón de látex pre-moldeado. Las ratas se sometieron a una ligadura de la izquierda arterial descendente (LAD) durante 50 minutos, seguido de reperfusión o fueron operados simulada. Detalles de la metodología para la inducción de infarto de miocardio (IM) se informó en otro lugar [ ^13] . Los experimentos de corazón invertido en los animales de infarto se realizaron 5 días después de la operación.

1. Anestesiar las ratas usando un vaporizador de isoflurano (2% V / V) conectado a una cámara de retención de animales (20 L).
2. Transferir las ratas a una mesa de operaciones (no a temperatura controlada) después de una anestesia profunda.
3. Levante la piel y el músculo justo debajo del esternón usando fórceps y corte alrededor del borde inferior de las costillas con tijeras pesadas.
4. Usando unas tijeras finas, haga un pequeño corte en el diafragma, en el borde de la costilla. Corte las costillas caudalmente para hacer una solapa de toda la pared ventral del pecho.
5. Agarre suavemente el corazón con el pulgarNd índice y dedos del medio y levantar lentamente hacia arriba para que los vasos cardíacos se vuelven ligeramente estirado.
6. Excise el corazón hasta que la aorta esté totalmente expuesta.
7. Colocar el corazón en un vaso de precipitados de 100 ml que contiene 50 ml de KHB helado (4 ° C) y moverlo al aparato de perfusión.
8. Inmediatamente monte el corazón a través de la aorta en una cánula de goteo y apriétela firmemente con una sutura (4-0). Evite las burbujas de aire que entren en el corazón.
9. Aplicar presión de perfusión constante (100 cmH ₂ O). Alternativamente, puede aplicarse un caudal completo (comenzando con 20 ml / min).
   Nota: El tiempo desde la apertura del tórax hasta la fijación del corazón a la cánula de perfusión debe tomar unos 3 min en manos de un operador experimentado.

4. Modelo de corazón invertido

1. Gire suavemente la cánula aórtica hasta que la pared posterior del corazón esté en la vista frontal .
2. Quitar el tejido conectivo con tijerasPara exponer la apertura de la aurícula izquierda, haciéndola lista para la canulación intraventricular.
3. Inserte el globo de látex desinflado unido a un catéter rígido a través de la aurícula izquierda en el ventrículo izquierdo.
4. Inflar el globo hasta que llene toda la cavidad ventricular (el volumen de inflado está pre-marcado en la jeringa).
5. Invertir el corazón hasta que esté al revés, apoyándolo por el catéter de balón intraventricular.
6. Como se demuestra en la figura 1C , estabilizar mecánicamente el corazón invertido en posición vertical usando el balón intraventricular con un catéter metálico rígido.
7. Ajustar la posición del corazón para evitar la torsión excesiva de la raíz aórtica.
8. Ajustar la presión diastólica a 3-5 mmHg (medida por el balón intraventricular, ver Figura 1C ).
9. Observe la superficie epicárdica del corazón y asegúrese de que se formen gotitas pequeñas.
10. Coloque la tapa de látexNto la superficie del corazón empujándola suavemente para cubrir el corazón entero usando los dedos.
11. Asegúrese de que la tapa de látex cubra la mayor parte de la superficie ventricular.
12. Retire las burbujas de aire, si las hubiere, dentro de la tapa y el tubo, succionando suavemente con una jeringa de 1 ml.
13. Ajustar la abertura distal de la tubería que deja CT a 10 cm por debajo del nivel horizontal del corazón.
    NOTA: Este procedimiento asegura una ligera succión por presión hidrostática negativa.
14. Recoger las gotas de CT en un tubo de recogida de 1,5 ml colocado en hielo mezclado 1: 1 con NaCl. Recoger alrededor de 0.15-1.5 ml de CT.
    NOTA: La mezcla de hielo / NaCl estabiliza la temperatura en el tubo de recolección por debajo de cero (aproximadamente -4 ° C).
    NOTA: El tiempo de muestreo depende del propósito experimental. El caudal de la TC es de aproximadamente 27 ± 20 μL / min en animales simulados (n = 3) y 100 ± 47 μL / min para los animales coronarios (n = 11).
15. Pesar y congelar instantáneamente muestras CTEn nitrógeno líquido y almacenarlos a -80 ° C para mediciones posteriores.

5. Análisis de la CT

1. Utilizar el líquido CT para el análisis de metabolitos, dependiendo de la pregunta científica.
   NOTA: Los datos mostrados en la Figura 2 y la Figura 3 se recogieron de una perfusión de presión constante (100 cmH2O), y se recogieron aproximadamente 0,15-1,5 ml de líquido CT en un periodo de 10 min. Este tiempo y volumen fueron suficientes para el análisis proteómico (mínimo: 50 μl, Figura 2 ) ¹⁴ y HPLC (mínimo: 20 μl, Figura 3 ) ¹⁵ de varias purinas.

Resultados

El modelo de corazón invertido permite la recolección de transudado intersticial cardíaco en un corazón de rata aislado, retro-perfundido ( Figura 1A- C ). Cuando se perfundía a una presión constante de 100 cmH $ _₂ $ O, la velocidad de formación de líquido intersticial varió entre 17 y 147 μL / min, llegando a 0,1-1% del efluente venoso coronario en el corazón aislado.

Discusión

El modelo de corazón invertido se basa en la bien establecida técnica de perfusión de corazón de Langendorff ¹² y se realiza simplemente invirtiendo el corazón en una posición invertida y manteniendo esta posición usando un catéter de balón intra-ventricular rígido. De esta manera, el transudato intersticial cardíaco puede separarse físicamente del perfusado de efluente venoso coronario, goteando por gravedad desde la base del corazón ⁹ . El CT se puede recoge...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Reverse heart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Reverse heart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Reverse heart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Reverse heart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemicals
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemicals
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemicals
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemicals
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Reverse heart model