O modelo do coração invertido para a coleta de transudados intersticiais do coração de rato isolado

Resumo

Este protocolo descreve um método para coletar fluido intersticial cardíaco a partir do coração de rato perfundido e isolado. Para separar fisicamente o transudado intersticial do perfusado de efluente venoso coronário, o coração perfundido de Langendorff é invertido e o transudado (fluido intersticial) formado na superfície cardíaca é coletado usando um tampão de látex macio.

Resumo

O presente protocolo descreve uma abordagem única que permite a coleta de transudado cardíaco (TC) a partir do coração de rato isolado e com solução salina perfundida. Após o isolamento e a perfusão retrógrada do coração de acordo com a técnica de Langendorff, o coração é invertido em uma posição de cabeça para baixo e é mecanicamente estabilizado por um cateter de balão inserido no ventrículo esquerdo. Então, uma fina tampa de látex - previamente moldada para coincidir com o tamanho médio do coração do rato - é colocada sobre a superfície epicárdica. A saída da tampa de látex está conectada a tubos de silício, com a abertura distal 10 cm abaixo do nível de base do coração, criando leve sucção. O CT produzido continuamente na superfície epicárdica é coletado em frascos refrigerados com gelo para análise posterior. A taxa de formação de CT variou de 17 a 147 μL / min (n = 14) no coração de controle e infarto, o que representa 0,1-1% do perfusado de efluente venoso coronário. Análise proteômica e alto perfoA cromatografia líquida rmance (HPLC) revelou que a TC coletada contém um amplo espectro de proteínas e metabolitos purinérgicos.

Introdução

A insuficiência cardíaca (HF) é a principal causa de morte em seres humanos em todo o mundo ¹ . HF freqüentemente ocorre devido a miocardite, insetos isquêmicos ao miocárdio e remodelamento ventricular esquerdo, levando à deterioração progressiva da função contrátil cardíaca e da qualidade de vida dos pacientes. Embora os avanços em cardiologia e cirurgia cardíaca tenham diminuído notavelmente a mortalidade por insuficiência cardíaca, eles apenas servem como "retardantes" transitórios de um processo de doença inevitavelmente progressivo que traz morbidade significativa. Portanto, a atual falta de tratamento efetivo ressalta a necessidade de identificar novos alvos moleculares que podem prevenir ou mesmo reverter a HF. Isso inclui mudanças na matriz extracelular, resposta imune cardíaca não controlada e interações entre células cardíacas e não cardíacas ² .

É importante reconhecer que o microambiente que as células cardíacas estão expostas à direçãoForja as respostas imunes e regenerativas do coração ferido. No coração isolado, perfumado com solução salina, a TC é gerada na superfície do coração sob a forma de pequenas gotículas derivadas do espaço fluídico intersticial ( ou seja, microambiente), tanto em condições fisiológicas quanto fisiopatológicas ^{3 , 4 , 5} . Portanto, a análise da TC ( ou seja, o fluido intersticial) pode ajudar a identificar fatores que regulam o metabolismo cardíaco e a função contrátil ⁶ ou influenciam as funções das células imunes após a migração para o coração ferido. Potencialmente, isso pode levar ao desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da HF.

A coleção de CT de corações murinos é tecnicamente desafiadora. Em corações regulares de Langendorff, a coleção exclusiva de TC é difícil porque a mistura da TC com coronarO perfusor de efluente venoso dilata imprevisivelmente qualquer concentração de metabolitos / enzimas liberadas do espaço intersticial. Uma possível estratégia para superar esta limitação é excluir o efluente venoso por canulação do pulmão e simultaneamente ligando a veia pulmonar ⁷ . No entanto, esse método enfrenta dificuldades associadas à canulação e à ligação da artéria pulmonar e da veia, causando potencial vazamento de efluente venoso no transudado cardíaco. O conceito de usar um modelo de coração reverso foi introduzido pela primeira vez pelo grupo de Kammermeier, que inverteu o coração isolado e perfundido em uma posição de cabeça para baixo e colocou uma fina tampa de látex na superfície epicárdica para amostrar continuamente a TC sem a contaminação do efluente venoso ^{8 , 9} . Usando este procedimento, a CT mostrou fornecer uma medida muito sensível dos metabolitos liberados do coração ⁹ ,A transferência capilar de ácidos gordurosos ⁸ e partículas virais ¹⁰ .

Mais recentemente, fatores paracrinos que podem regular a resposta imune local e aumentar a angiogênese cardíaca ¹¹ foram implicados nos efeitos benéficos da terapia com células-tronco para doenças cardíacas. A análise da TC no coração invertido pode ajudar a identificar quimicamente esses fatores paracrinos individuais. Além disso, a TC pode ajudar a identificar os fatores envolvidos na ativação in vivo de células imunes no coração.

A descrição detalhada da coleta de CT da superfície do coração, fornecida aqui, é experimentalmente útil para pesquisadores que estudam a interação de células imunes, fibroblastos, células endoteliais e cardiomiócitos em relação à função cardíaca geral. Como mencionado acima, o fluido intersticial carrega a informação para comunicação célula a célula dentro do coração, whQue pode ser convenientemente avaliado pela coleção de CT. A descrição técnica detalhada, incluindo um protocolo de vídeo de como coletar CT a partir do coração invertido, deve facilitar a aplicação futura desta técnica única.

Protocolo

Todas as experiências foram aprovadas pela agência reguladora local ( LANUV de Nordrhein-Westfalen, Alemanha) e foram realizadas de acordo com as diretrizes de uso animal. Os animais foram alimentados com uma dieta normal e recebiam água da torneira ad libitum . Todos os equipamentos e produtos químicos necessários para cada etapa do experimento estão disponíveis na Tabela de Materiais .

1. Preparação do tampão de látex e balão intraventricular

1. Faça um molde de alumínio usando uma fresadora que corresponda ao tamanho médio do coração do rato (peso corporal de 300 a 350 g). Polvilhe o molde com papel de esmeril superfino (10/0).
   NOTA: As métricas detalhadas do molde são mostradas na Figura 1A .
2. Coloque verticalmente o pescoço do molde de alumínio na fresadora para preparar a tampa de látex.
   NOTA: A fresadora faz com que o molde gire lentamente. Alternativamente, um motor elétrico pode ser usado. Li>
3. Despeje 20 mL de látex líquido (comercialmente comprado, veja a Tabela de Materiais ) em um copo de vidro de 50 mL.
4. Abaixe o molde até que todo o corpo do molde esteja imerso na solução de látex.
5. Levante lentamente o molde (5 cm / min) enquanto gira.
6. Continue girando o molde por mais 15 minutos, até o látex sobre a superfície do molde se solidificar.
7. Adicione cerca de 1 g de pó de talco à superfície do molde (já coberto por uma fina película de látex) para evitar danos durante a separação.
8. Deslize suavemente com os dedos a tampa de látex já seca da superfície do molde; A tampa de látex está agora pronta para uso ( Figura 1B ).
9. Conecte a saída da tampa de látex a tubos de silício de 15 cm (ID = 0,2 mm), usados ​​mais tarde para a coleta de CT.
10. Encha o balão ventricular de látex com água e fixe-o firmemente sobre uma cânula metálica em forma de L conectada a uma seringa cheia de água de 1 ml (> Figura 1C).
    NOTA: Isto será usado para garantir o posicionamento vertical do coração (veja abaixo).
11. Certifique-se de que o balão é hermético através da realização de vários testes de deflação / inflado com a seringa anexada de 1 mL.
12. Conecte a cânula, através de uma parada de três vias, a um transdutor de pressão para a futura medição da pressão desenvolvida intraventricular ( Figura 1C ).

2. Preparação do tampão Krebs-Henseleit (KHB) e do sistema de perfusão de Langendorff

1. Configure um sistema de perfusão de Langendorff usando o modo de fluxo constante (impulsionado por uma bomba de rolo) ou pressão constante (gerada por pressão estática em uma coluna de vidro).
   NOTA: Os detalhes da preparação do coração de Langendorff foram descritos anteriormente ¹² .
2. Preparar 2 L de um KHB modificado (em mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1,21 K ₂ HPO ₄ 2,52 CaCl2 · 2H2O, 24,88 NaHCO3, 8,30 D-glucose e 2,0 piruvato de sódio).
   1. Pesar todos os produtos químicos, mas o CaCl ₂ e dissolvê-los em 1,8 L de água duplamente destilada em um balão de 2 litros.
   2. Bolha do meio com carbogénio (95% de O2 / 5% de CO ₂ ) durante pelo menos 5 min para equilíbrio (pH: 7,4) sob agitação magnética.
   3. Adicionar 0,74 g de CaCl2.2H ₂ O e elevar o volume total para 2 L com água destilada.
   4. Continue mexendo e borbulhando o meio com carbogênio por mais 5 min.
   5. Filtra o KHB através de um filtro de 0,2 μm para eliminar pequenas partículas que podem obstruir a microcirculação do coração.
3. Preparação do sistema de perfusão de Langendorff.
   1. Coloque o KHB filtrado em um banho de água pré-aquecido (38 ° C); Continue borbulhando com carbógeno para gerar uma pressão de 100 cmH ₂ O insidE o reservatório KHB.
   2. Conecte o reservatório à coluna de vidro para estabelecer pressão hidrostática de 100 cmH ₂ O para a perfusão de Langendorff com KHB; Continue borbulhando o KHB dentro da coluna com carbógeno.
   3. Ajuste a temperatura do sistema de aquecimento de modo que a temperatura na saída da cânula aórtica seja de 37 ° C.
   4. Certifique-se de que o sistema de tubulação não tenha bolhas.
   5. Oxigenar o KHB com carbogênio por 5 minutos adicionais, até que o PO ₂ no KHB atinja 500-600 mmHg (medido por um analisador de sangue-gás).
4. Configure o sistema de perfusão para funcionar a uma pressão constante de 100 cmH ₂ O ou a um fluxo constante de cerca de 10-20 mL / min usando a comutação manual. Alternativamente, use um controlador de bomba intercambiável STH para alternar instantaneamente para o modo de perfusão.

3. Isolamento e Cannulação do Coração

NOTA: Ratos Wistar machos com peso corporal de 30Foram utilizados 0-350 g para que os tamanhos de corações correspondiam à tampa de látex pré-moldada. Os ratos sofreram uma ligadura da descendência arterial esquerda (LAD) durante 50 min, seguida de reperfusão ou foram simuladas. Os detalhes da metodologia para indução de infarto do miocárdio (IM) foram relatados em outro lugar ¹³ . As experiências do coração invertido nos animais do infarto foram realizadas 5 dias após a operação.

1. Anestesiar ratos usando um vaporizador de isoflurano (2% V / V) conectado a uma câmara de retenção de animais (20 L).
2. Transfira os ratos para uma tabela de operação (não controlada pela temperatura) após a anestesia profunda ser atingida.
3. Levante a pele e os músculos logo abaixo do esterno usando fórceps e corte ao redor da margem inferior das costelas com tesoura pesada.
4. Usando tesoura fina, faça um pequeno corte no diafragma, na margem da costela. Corte as costelas caudalmente para fazer uma aba de toda a parede torácica ventral.
5. Agarre delicadamente o coração com o polegar aE índice e dedos do meio e lentamente levante-o para cima, de modo que os vasos cardíacos se tornem levemente esticados.
6. Esqueça o coração até a aorta estiver totalmente exposta.
7. Coloque o coração em um copo de 100 mL contendo 50 mL de KHB gelado (4 ° C) e mova-o para o aparelho de perfusão.
8. Monte imediatamente o coração através da aorta em uma cânula de gotejamento e aperte-o com segurança com uma sutura (4-0). Evite as bolhas de ar que entram no coração.
9. Aplique pressão de perfusão constante (100 cmH ₂ O). Alternativamente, pode ser aplicada uma taxa de fluxo total (começando com 20 mL / min).
   Nota: O tempo desde a abertura do tórax até a fixação do coração à cânula de perfusão deve demorar cerca de 3 minutos nas mãos de um operador experiente.

4. Modelo de coração invertido

1. Gire suavemente a cânula aórtica até que a parede posterior do coração esteja na visão facial .
2. Remova o tecido conjuntivo com tesouraPara expor a abertura do átrio esquerdo, preparando-a para a canulação intraventricular.
3. Insira o balão de látex deflacionado ligado a um cateter rígido através do átrio esquerdo no ventrículo esquerdo.
4. Inflar o balão até preencher toda a cavidade ventricular (o volume de inflado está pré-marcado na seringa).
5. Inverta o coração até que esteja de cabeça para baixo, apoiando-o pelo cateter de balão intraventricular.
6. Conforme demonstrado na Figura 1C , estabilize mecanicamente o coração invertido em posição vertical usando o balão intraventricular com um cateter de metal rígido.
7. Ajuste a posição do coração para evitar a torção excessiva da raiz da aorta.
8. Ajuste a pressão diastólica para 3-5 mmHg (medida pelo balão intraventricular, veja a Figura 1C ).
9. Observe a superfície epicárdica do coração e assegure-se de formar pequenas gotículas.
10. Coloque a tampa de látex oNa superfície do coração empurrando suavemente para cobrir todo o coração usando os dedos.
11. Certifique-se de que a tampa de látex cobre a maior parte da superfície ventricular.
12. Remova as bolhas de ar, se houver, dentro da tampa e da tubulação, sugando suavemente com uma seringa de 1 mL.
13. Ajuste a abertura distal da tubulação CT-letting para 10 cm abaixo do nível horizontal do coração.
    NOTA: Este procedimento garante uma leve sucção por pressão hidrostática negativa.
14. Coletar gotas de CT em um tubo de coleta de 1,5 mL colocado em gelo misturado 1: 1 com NaCl. Colete cerca de 0.15-1.5 mL de TC.
    NOTA: A mistura de gelo / NaCl estabiliza a temperatura no tubo de recolha para baixo de zero (cerca de -4 ° C).
    NOTA: O tempo de amostragem depende do propósito experimental. O caudal da TC é de cerca de 27 ± 20 μL / min em animais operados simuladamente (n = 3) e 100 ± 47 μL / min para os animais com ligação coronária (n = 11).
15. Pesar e congelar as amostras CTEm nitrogênio líquido e armazená-los a -80 ° C para medições posteriores.

5. Análise da CT

1. Use o fluido CT para a análise de metabolitos, dependendo da questão científica.
   NOTA: Os dados mostrados na Figura 2 e na Figura 3 foram coletados a partir de uma perfusão de pressão constante (100 cmH ₂ O) e cerca de 0,15-1,5 mL de líquido CT foi coletado dentro de um período de 10 min. Este tempo e volume foram suficientes para a análise proteômica (mínima: 50 μL, Figura 2 ) ¹⁴ e HPLC (mínimo: 20 μL, Figura 3 ) ¹⁵ de várias purinas.

Resultados

O modelo de coração invertido permite a coleta de transudato intersticial cardíaco em um coração de rato isolado e retro-perfundido ( Figura 1A- C ). Quando perfundido a uma pressão constante de 100 cmH ₂ O, a taxa de formação de fluido intersticial variou entre 17 e 147 μL / min, totalizando 0,1-1% do efluente venoso coronariano no coração isolado.

O t...

Discussão

O modelo de coração invertido baseia-se na técnica de perfusão de coração de Langendorff bem estabelecida ¹² e é realizado simplesmente invando o coração para uma posição de cabeça para baixo e mantendo esta posição usando um cateter de balão intra-ventricular rígido. De forma tal, o transudato intersticial cardíaco pode ser fisicamente separado do perfusado de efluente venoso coronário, goteando pela gravidade da base do coração ⁹ . A TC pode ser colet...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Reverse heart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Reverse heart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Reverse heart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Reverse heart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemicals
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemicals
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemicals
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemicals
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Reverse heart model