מודל הלב הפוכה עבור אוסף transstate Interstitial מן הלב עכברוש מבודד

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לאסוף נוזל interstitial לב מבודדים, בלב עכברוש perfused. כדי להפריד פיזית transudate interstitial מ perfossate כלילי ורידי לב, הלב Langendorff perfused הוא הפוך, ואת transudate (נוזל interstitial) נוצר על פני הלב נאסף באמצעות כובע לטקס רכה.

Abstract

הפרוטוקול הנוכחי מתאר גישה ייחודית המאפשרת אוסף של transudate לב (CT) מן הלב מבודד, מלוחים perfused חולדה. לאחר בידוד ו זלילה מדרדר של הלב על פי טכניקת Langendorff, הלב הוא הפוך למצב הפוך הפוכה מיוצב מכנית על ידי קטטר בלון מוכנס לתוך החדר השמאלי. ואז, כובע לטקס דק - בעבר יצוק כדי להתאים את הגודל הממוצע של הלב חולדה - ממוקם מעל פני השטח epichardial. השקע של כובע לטקס מחובר צינורות סיליקון, עם פתיחת דיסטלי 10 ס"מ מתחת לרמת הבסיס של הלב, יצירת יניקה קלה. CT מיוצר ברציפות על פני השטח אפיקארדיאל נאסף בקבוקונים מקורר כקרח לניתוח נוסף. שיעור היווצרות ה- CT נע בין 17 ל -147 μL / min (n = 14) בשליטה ובליבות לא מקובעות, המייצגות 0.1-1% מהפרפוראטציה הקולית הוורידית. ניתוח פרוטאומי ופרפו גבוהRmance נוזל כרומטוגרפיה (HPLC) גילה כי CT שנאספו מכיל מגוון רחב של חלבונים ו metinerolic purinergic.

Introduction

אי ספיקת לב (HF) היא הגורם המוביל למוות בבני אדם בעולם ¹ . HF מתרחשת לעיתים קרובות עקב דלקת שריר הלב, עלבונות איסכמיים בשריר הלב, ושיפוץ חדרי החדר, מה שמוביל להידרדרות הדרגתית של תפקוד הלב וכלי הדם של המטופלים. למרות ההתקדמות הקרדיולוגית וניתוח לב הורידו באופן משמעותי את תמותה HF, הם רק לשמש "מעכבים" חולף של תהליך מחלה מתקדמת באופן בלתי נמנע, כי יש תחלואה משמעותית. לכן, היעדר הטיפול היעיל הנוכחי מדגיש את הצורך לזהות מטרות מולקולריות חדשות שיכולות למנוע או אפילו להפוך HF. הדבר כולל שינויים במטריצה ​​החוץ-תאית, תגובה חיסונית בלתי מבוקרת של הלב, ואינטראקציות בין תאי לב ולא-לב ² .

חשוב להכיר כי microenvironment כי תאים לב חשופים direcTly צורות התגובה החיסונית והתחדשות של הלב הפגוע. בלב המבודד, המלוח-מלוח, נוצר CT על פני השטח בצורת טיפות קטנות הנגזרות מחלל הנוזלים הבין-ממדי ( כלומר, מיקרו-סביבה), הן בתנאים פיזיולוגיים והן בפאתופיזיולוגיים ^{3 , 4 , 5} . לכן, ניתוח של CT ( כלומר, נוזל interstitial) עשוי לעזור לזהות גורמים המווסתים את חילוף החומרים של הלב ואת תפקוד התכווצות ⁶ או להשפיע על תפקודי התא החיסונית לאחר המעבר אל הלב הפגוע. פוטנציאל זה עשוי להוביל לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול ב- HF.

אוסף CT מ לבבות Murine הוא מאתגר מבחינה טכנית. ב Langendorff-perfused לבבות רגילים, את האוסף הבלעדי של CT קשה כי תערובת של CT עם קורונארY ורידי שפכים ורידי באופן בלתי צפוי מדלל כל ריכוז של מטבוליטים / אנזימים ששוחררו מן החלל interstitial. אחת האסטרטגיות האפשריות להתגבר על הגבלה זו היא להוציא את השפכים הוורידים על ידי חשיפת הריאתי ובאותו זמן ליגנציה של הווריד הריאתי. עם זאת, שיטה זו עומדת בפני קשיים הקשורים cannulation ו קשירת של העורק הריאתי ואת הווריד, גרימת דליפה פוטנציאלית של שפכים ורידי לתוך transudate הלב. הרעיון של שימוש במודל לב הפוכה הוצג לראשונה על ידי קבוצת קמרמאייר, שהפכה את הלב המבודד והמבודד למצב הפוך, והניחה כובע לטקס דק על משטח האפיכארדיאל כדי למדוד ללא הרף את ה- CT ללא זיהום של שפכים ורידיים ^{8 , 9} . באמצעות הליך זה, CT הוצגה לספק מדד רגיש מאוד של מטבוליטים שוחרר מהלב ⁹ ,העברה נימית של חומצות שומן ⁸ , וחלקיקים נגיפיים ¹⁰ .

לאחרונה, גורמי פרקרין שיכולים להסדיר את התגובה החיסונית המקומית ולהגדיל את אנגיוגנזה לב ¹¹ היו מעורבים בהשפעות החיוביות של טיפול מבוסס תאי גזע למחלות לב. הניתוח של CT בלב הפוך עשוי לסייע לזהות את הגורמים הפרקריים האישיים הללו באופן כימי. בנוסף, CT עשוי לעזור לזהות את הגורמים המעורבים ההפעלה vivo של תאים חיסוניים בלב.

התיאור המפורט של אוסף ה- CT ממשטח הלב, הניתן כאן, הוא שימושי עבור חוקרים החוקרים את יחסי הגומלין בין תאי החיסון, fibroblasts, תאי האנדותל, ואת cardiomyocytes ביחס לתפקוד הלב הכולל. כפי שצוין לעיל, נוזל interstitial נושאת את המידע לתקשורת תא אל תוך התא, בתוך הלב, WHIch ניתן להעריך בנוחות על ידי אוסף של CT. תיאור טכני מפורט, כולל פרוטוקול וידאו של איך לאסוף CT מן הלב הפוכה, צריך להקל על היישום העתידי של טכניקה ייחודית זו.

Protocol

כל הניסויים אושרו על ידי סוכנות הרגולציה המקומית ( LANUV של Nordrhein-Westfalen, גרמניה) בוצעו על פי הנחיות השימוש בבעלי חיים. בעלי החיים היו מוזנים בדיאטה סטנדרטית של צ'או וקיבלו את מי הברז. כל הציוד והכימיקלים הדרושים לכל שלב של הניסוי זמינים בטבלה של חומרים .

1. הכנת כובע לטקס ו בלון Intraventricular

1. יצירת עובש אלומיניום באמצעות מכונת כרסום התואמת את הגודל הממוצע של הלב חולדה (bodyweight של 300-350 גרם). פולנית תבנית עם נייר superfine (10/0) ​​אמרי.
   הערה: המדדים המפורטים של התבנית מוצגים בתרשים 1A .
2. אנכית לתקן את הצוואר של עובש אלומיניום למכונת כרסום כדי להכין את כובע לטקס.
   הערה: מכונת הטחינה גורמת לעובי להסתובב לאט. לחלופין, מנוע חשמלי יכול לשמש. Li>
3. יוצקים 20 מ"ל של לטקס נוזלי (רכש מסחרית, ראה טבלה של חומרים ) לתוך כוס זכוכית 50 מ"ל.
4. להנמיך את עובש עד הגוף כולו של עובש שקוע הפתרון לטקס.
5. הרם לאט את התבנית (5 ס"מ לדקה) תוך כדי סיבוב.
6. שמור סיבוב עובש במשך 15 דקות נוספות, עד לטקס על פני השטח של עובש הוא solidified.
7. הוסף על 1 גרם של אבקת טלק על פני השטח של עובש (כבר מכוסה על ידי סרט לטקס דק) כדי למנוע נזק בעת ניתוק.
8. בעדינות לנתק עם האצבעות כבר מיובש כובע לטקס משטח עובש; כובע לטקס מוכן כעת לשימוש ( איור 1 ב ).
9. חבר את שקע לטקס ל -15 ס"מ צינורות סיליקון (ID = 0.2 מ"מ), המשמש מאוחר יותר עבור אוסף של CT.
10. ממלאים את הבלון לטקס חדרית עם מים בתקיפות לתקן אותו על צינור מתכת בצורת L מחובר מזרק 1 מ"ל, מלא מים (> איור 1 ג).
    הערה: זה ישמש כדי להבטיח את מיקום זקוף של הלב (ראה להלן).
11. ודא כי הבלון הוא אטום על ידי ביצוע מספר ניפוח / ניפוח בדיקות עם המזרק המצורף 1 מ"ל.
12. חבר את הצינורית, דרך לעצור שלוש פעמים, כדי מתמר הלחץ למדידה העתידית של הלחץ פיתחה intraventricular ( איור 1C ).

2. הכנת קרבס- Henseleit הצפת (KHB) ואת מערכת Langendorff זלוף

1. הגדרת מערכת זלוף Langendorff באמצעות זרימה קבועה (מונע על ידי משאבת הרים) או קבוע הלחץ (שנוצר על ידי לחץ סטטי בעמודה זכוכית) במצב.
   הערה: פרטים על הכנת Langendorff הלב תוארו בעבר ¹² .
2. הכן 2 L של KHB שונה (ב mM: 116.02 NaCl, 4.63 KCl, 1.10 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1.21 K ₂ HPO ₄ , 2.52 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 24.88 NaHCO ₃ , 8.30 D גלוקוז, ו 2.0 נתרן pyruvate).
   1. לשקול את כל הכימיקלים אבל CaCl ₂ ו לפזר אותם 1.8 L של מים מזוקקים פעמיים בקבוק 2-L.
   2. הבועה המדיום עם carbogen (95% O ₂ /5% CO ₂ ) במשך 5 דקות לפחות עבור איזון (pH: 7.4) תחת ערבוב מגנטי.
   3. הוסף 0.74 גרם של CaCl ₂ .2H ₂ O ולהעלות את נפח הכולל ל 2 עם מים מזוקקים פעמיים.
   4. המשך ערבוב מבעבע בינוני עם פחמן במשך 5 דקות נוספות.
   5. סינון KHB דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לחסל חלקיקים קטנים שעלולים לחסום את microcirculation של הלב.
3. הכנת מערכת זלוף Langendorff.
   1. מניחים את KHB מסונן לתוך אמבט מים מחומם מראש (38 ° C); לשמור מבעבע עם carbogen כדי ליצור לחץ של 100 ס"מ ₂ O InsidE מאגר KHB.
   2. חבר את המאגר לעמודה זכוכית להקים 100 cmH ₂ O לחץ הידרוסטטי עבור זלוף Langendorff עם KHB; להמשיך מבעבע KHB בתוך הטור עם carbogen.
   3. התאם את הטמפרטורה של מערכת ההתחממות, כך הטמפרטורה בבית השקע אבי העורקים הוא 37 מעלות צלזיוס.
   4. ודא כי מערכת צינורות הוא ללא בועה.
   5. לחמצן את KHB עם פחמן במשך 5 דקות נוספות, עד PO ₂ ב KHB מגיע 500-600 מ"מ כספית (נמדדת על ידי מנתח גז בדם).
4. הגדרת מערכת זלוף לרוץ או בלחץ קבוע של 100 cmH ₂ O או בזרימה קבועה של כ 10-20 מ"ל / דקה באמצעות מיתוג ידני. לחלופין, להשתמש בקר משאבת STH להחלפה כדי לעבור באופן מיידי למצב זלוף.

3. בידוד ו cannulation של הלב

הערה: חולדות Wistar זכר עם משקולות של 300-350 גרם שימשו כך גדלים של לבבות תאמו מראש הטלת לטקס. חולדות עברו גם קשירת של העורקים השמאלית יורד (LAD) במשך 50 דקות, ואחריו reperfusion או הופעלו הונאה. פרטים על המתודולוגיה של אינדוקציה של אוטם שריר הלב (MI) דווחו במקום אחר ¹³ . ניסויי הלב הפוכים בחיות האינפריות בוצעו 5 ימים לאחר הניתוח.

1. להרדים חולדות באמצעות מאדה isoflurane (2% V / V) מחובר לחדר בעל חיים מחזיק (20 L).
2. מעבירים את החולדות לטבלת הניתוח (לא טמפרטורה מבוקרת) לאחר הרדמה עמוקה הוא הגיע.
3. הרם את העור ואת השריר ממש מתחת לחזה באמצעות מלקחיים לחתוך סביב השוליים התחתונים של הצלעות עם מספריים כבדים.
4. בעזרת מספריים בסדר, לעשות חתך קטן לתוך הסרעפת, על שולי צלעות. חותכים את הצלעות caudally לעשות דש של הקיר החזה כולו הגחון.
5. בעדינות לתפוס את הלב עם האגודל אNd אינדקס ואצבעות באמצע לאט להרים אותו כלפי מעלה, כך כלי הדם להיות מתוח מעט.
6. הבלו את הלב עד אבי העורקים נחשף במלואו.
7. מניחים את הלב בתוך כוס 100 מ"ל המכיל 50 מ"ל של KHB קר כקרח (4 מעלות צלזיוס) ולהעביר אותו למנגנון זלוף.
8. מיד לעלות על הלב דרך אבי העורקים על צינורית נוטף בבטחה להדק אותו עם תפר (4-0). הימנע בועות אוויר נכנסים ללב.
9. החל לחץ זלוף קבוע (100 ס"מ ₂ O). לחלופין, קצב זרימה מלא (החל מ 20 מ"ל / דקה) ניתן להחיל.
   הערה: הזמן מפתיחת בית החזה כדי המצורף של הלב צינורית זלוף צריך לקחת בערך 3 דקות בידיו של מפעיל מנוסה.

4. הפוך לב דגם

1. בעדינות לסובב את צינורית אבי העורקים עד הקיר האחורי של הלב הוא בפנים אל פנים .
2. הסר את רקמת החיבור במספרייםכדי לחשוף את הפתיחה של אטריום שמאל, מה שהופך אותו מוכן cannulation intraventricular.
3. הכנס את בלון לטקס deflated מחוברת קטטר נוקשה דרך אטריום שמאל לתוך החדר השמאלי.
4. לנפח את הבלון עד שהוא ממלא את חלל החדר כולו (נפח מנפח מסומן מראש על המזרק).
5. הפוך את הלב עד שהוא הפוך, תומך בו על ידי קטטר בלון תוך תוך ורידי.
6. כפי שמוצג בתרשים 1C , לייצב באופן מכני את הלב הפוכה במצב זקוף באמצעות בלון תוך intraventricular עם קטטר מתכת נוקשה.
7. התאם את המיקום של הלב כדי למנוע פיתול מוגזם של שורש אבי העורקים.
8. התאם את הלחץ diastolic ל 3-5 מ"מ כספית (נמדדת על ידי בלון תוך חדרתי, ראה איור 1C ).
9. צפו על פני השטח של הלב של הלב ולוודא כי טיפות קטנות הטופס.
10. מניחים את כובע לטקס oאל פני השטח של הלב על ידי דחיפה בעדינות אותו כדי לכסות את הלב כולו באמצעות האצבעות.
11. ודא כי מכסה לטקס מכסה את רוב השטח החדר.
12. הסר את בועות אוויר, אם בכלל, בתוך הכובע ואת צינורות על ידי מציצה בעדינות עם מזרק 1 מ"ל.
13. התאם את הפתיחה הדיסטלית של צינור ה- CT לתת עד 10 ס"מ מתחת לרמה האופקית של הלב.
    הערה: הליך זה מבטיח מציצה קלה על ידי לחץ הידרוסטטי שלילי.
14. איסוף טיפות של CT בצינור 1.5 מ"ל צינור להציב בקרח מעורב 1: 1 עם NaCl. איסוף על 0.15-1.5 מ"ל של CT.
    הערה: תערובת הקרח / NaCl מייצבת את הטמפרטורה בצינור האיסוף מתחת לאפס (כ -4 ° C).
    הערה: זמן הדגימה תלוי במטרות הניסוי. קצב הזרימה של CT הוא כ 27 ± 20 μL / min בחיות המופעלות בדם (n = 3) ו 100 ± 47 μL / min עבור בעלי חיים ligated כלילית (n = 11).
15. לשקול ו-להקפיא דגימות CTב חנקן נוזלי ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס למדידות מאוחר יותר.

5. ניתוח של CT

1. השתמש נוזל CT לניתוח של מטבוליטים, בהתאם לשאלה המדעית.
   הערה: הנתונים המוצגים באיור 2 איור 3 נאספו מתוך זלוף לחץ מתמיד (100 ס"מ ₂ O), ועל 0.15-1.5 מ"ל של נוזל CT נאסף בתוך תקופה של 10 דקות. הפעם והנפח היו מספיק עבור proteomic (מינימום: 50 μL, איור 2 ) ¹⁴ ו HPLC (מינימום: 20 μL, איור 3 ) ¹⁵ ניתוח של purines שונים.

תוצאות

מודל הלב הפוכה מאפשר איסוף של transstate interstitial הלב בלב מבודד, רטרו perfused חולדה ( איור 1A- C ). כאשר perfused בלחץ קבוע של 100 cmH ₂ O, שיעור היווצרות נוזל interstitial נע בין 17 ו 147 μL / min, בהיקף של 0.1-1% של שפכים ורידי הלב כליל בלב בודד.

Discussion

מודל הלב הפוכה מבוסס על טכניקת זלוף הלב המבוצעת היטב של Langendorff ¹² , והיא מבוצעת על ידי הפיכת הלב למצב הפוך ולהחזקה בתנוחה זו באמצעות קטטר נוקשה בתוך חדר הבלון. בדרך זו, transudate interstitial הלב יכול להיות מופרד פיזית מן perfusate כלילי ורידי, נוטף על ידי כוח הכבידה מן הב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Reverse heart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Reverse heart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Reverse heart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Reverse heart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemicals
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemicals
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemicals
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemicals
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Reverse heart model