Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
В этом протоколе описывается способ сбора сердечной интерстициальной жидкости из изолированного, перфузируемого сердца крыс. Чтобы физически отделить интерстициальный трансудат от перфузата коронарного венозного эффлюента, перфузированное сердце Лангендорфа перевернуто, а транссудатная (интерстициальная жидкость), сформированная на поверхности сердца, собирается с использованием мягкой латексной крышки.
В настоящем протоколе описывается уникальный подход, который позволяет собирать сердечный трансудат (КТ) из изолированного, засоленного персистированного сердца крыс. После выделения и ретроградной перфузии сердца в соответствии с техникой Лангендорфа сердце перевернуто в перевернутое положение и механически стабилизируется баллонным катетером, вставленным в левый желудочек. Затем поверх эпикардиальной поверхности помещается тонкая латексная крышка, ранее отлитая в соответствии со средним размером сердца крыс. Выход латексного колпачка соединен с кремниевой трубкой, а дистальное отверстие на 10 см ниже базового уровня сердца, создавая легкое всасывание. Концентрацию, непрерывно продуцируемую на эпикардиальной поверхности, собирают в пробирках с ледяным охлаждением для дальнейшего анализа. Скорость образования КТ варьировалась от 17 до 147 мкл / мин (n = 14) в контроле и инфарктных сердцах, что составляет 0,1-1% от перфузата венозного кровотока коронарных артерий. Протеомический анализ и высокий перфо(ВЭЖХ) показали, что собранный КТ содержит широкий спектр белков и пуринергических метаболитов.
Сердечная недостаточность (HF) является основной причиной смерти людей во всем мире 1 . HF часто возникает из-за миокардита, ишемических оскорблений миокарда и ремоделирования левого желудочка, что приводит к прогрессирующему ухудшению сердечной сократительной функции и качества жизни пациентов. Хотя успехи в кардиологии и кардиохирургии значительно снизили смертность от HF, они просто служат временными «задержчиками» неизбежно прогрессирующего процесса болезни, который несет значительную заболеваемость. Поэтому нынешнее отсутствие эффективного лечения подчеркивает необходимость выявления новых молекулярных мишеней, которые могут предотвратить или даже обратить вспять ВЧ. Это включает изменения внеклеточного матрикса, неконтролируемый сердечный иммунный ответ и взаимодействия между сердечными и несердечными клетками 2 .
Важно признать, что микроокружение, которое сердечные клетки подвергаются воздействиюФормирует иммунную и регенеративную реакцию поврежденного сердца. В изолированном, физиологическом растворе сердце, КТ образуется на поверхности сердца в виде небольших капелек, которые получены из интерстициального пространства жидкости ( т. Е. Микроокружения), как в физиологических, так и в патофизиологических условиях 3 , 4 , 5 . Поэтому анализ КТ ( т. Е. Интерстициальной жидкости) может помочь определить факторы, которые регулируют сердечный метаболизм и сократительную функцию 6 или влияют на функции иммунных клеток после миграции в поврежденное сердце. Потенциально это может привести к разработке новых терапевтических стратегий для лечения ВЧ.
Коллекция CT от мышиных сердец технически сложна. В обычных сердцах с перпендикулярным Langendorff эксклюзивная коллекция CT трудна, потому что смесь CT с коронарнойПерфузат венозного эффлюента непредсказуемо разбавляет любую концентрацию метаболитов / ферментов, высвобождаемых из интерстициального пространства. Одна из возможных стратегий преодоления этого ограничения заключается в том, чтобы исключить венозный сток путем канюлирования легочной и одновременной лигирования легочной вены 7 . Однако этот метод сталкивается с трудностями, связанными с канюлированием и лигированием легочной артерии и вены, вызывая потенциальную утечку венозных стоков в сердечный трансудат. Концепция использования модели с обратным сердцем была впервые представлена группой Kammermeier, которая перевернула изолированное перфузированное сердце в перевернутое положение и поместила тонкую латексную крышку на эпикардиальную поверхность для непрерывного отбора КТ без загрязнения венозных стоков 8 , 9 . С помощью этой процедуры показано, что КТ обеспечивает очень чувствительную меру метаболитов, высвобождаемых из сердца 9 ,Капиллярный перенос жирных кислот 8 и вирусных частиц 10 .
Совсем недавно парацерновые факторы, которые могут регулировать местный иммунный ответ и увеличивать сердечный ангиогенез 11 , были связаны с положительным эффектом терапии на основе стволовых клеток при сердечных заболеваниях. Анализ КТ в обратном сердце может помочь химически идентифицировать эти отдельные паракринные факторы. Кроме того, КТ может помочь выявить факторы, связанные с активацией иммунных клеток в организме in vivo .
Подробное описание коллекции CT с поверхности сердца, представленной здесь, экспериментально полезно для исследователей, изучающих взаимодействие иммунных клеток, фибробластов, эндотелиальных клеток и кардиомиоцитов по отношению к общей сердечной функции. Как упоминалось выше, интерстициальная жидкость переносит информацию для связи между клетками внутри сердца, whIch удобно оценивать по набору КТ. Подробное техническое описание, в том числе видео-протокол о том, как собирать КТ из обратного сердца, должно способствовать будущему применению этой уникальной техники.
Все эксперименты были одобрены местным регулирующим органом ( LANUV of Nordrhein-Westfalen, Германия) и проводились в соответствии с руководящими принципами использования животных. Животных кормили стандартной диеткой чау-чау и получали водопроводную воду ad libitum . Все оборудование и химикаты, необходимые для каждой стадии эксперимента, доступны в Таблице материалов .
1. Подготовка латексной крышки и внутрижелудочкового шара
2. Подготовка буфера Кребса-Хенселейта (КХБ) и системы перфузии Лангендорфа
3. Изоляция и канюляция сердца
ПРИМЕЧАНИЕ. Самцы крыс Wistar с весом тела 300-350 г использовали таким образом, чтобы размеры сердец соответствовали предварительно залитой латексной крышке. Крысам подвергали либо лигирование левого артериального нисходящего (ЛАД) в течение 50 мин, а затем реперфузию или обманывали. Подробная информация о методике индукции инфаркта миокарда (ИМ) была представлена в других местах 13 . Эксперименты с обратным сердцем у животных-инфаркта проводились через 5 дней после операции.
4. Модель обратного сердечника
5. Анализ КТ
Модель с обратным сердцем позволяет собирать сердечный интерстициальный трансудат в изолированном сердце ретро-перфузии крысы ( рис. 1А-С ). При перфузии при постоянном давлении 100 смH 2 O скорость образования промежуточной жидкости колебалась ...
Модель с обратным сердцем основана на хорошо зарекомендовавшем себя методе перфузии сердца Лангендорфа 12 и выполняется простым переворачиванием сердца в перевернутое положение и удерживанием этого положения с использованием жесткого внутрижелудочкового баллонного ка...
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Это исследование финансировалось NSFC 81570244, FoKo 23/2013 и SFB 1116 / B01 и Сердечно-сосудистым исследовательским институтом Дюссельдорф (CARID).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz |
Aluminum Mold | Home made | - | Reverse heart model |
Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
Double Distilled Water | Millpore | - | Disolving chemicals |
Medical Pressure Transducer | Gold | - | Langendorff apparatus |
Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
Glass Water Column | home made | - | Langendorff apparatus |
Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
Sterile Disposable Filters (0.2 µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
Wistar Rats | Janvier | - | Animals |
Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
Big Forceps | AESCULAP | - | Surgical Instruments |
8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены