Le modèle de coeur inversé pour la collecte de transudat interstitielle à partir du coeur de rat isolé

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour collecter le liquide interstitiel cardiaque à partir du coeur de rat isolé et perfusé. Pour séparer physiquement le transudat interstitiel du perfusat d'effluent veineux coronaire, le coeur perfusé de Langendorff est inversé et le transudat (fluide interstitiel) formé sur la surface cardiaque est recueilli à l'aide d'un cap de latex doux.

Résumé

Le présent protocole décrit une approche unique qui permet la collecte du transudat cardiaque (CT) à partir du coeur isolé et isolé par le sérum physiologique. Après l'isolement et la perfusion rétrograde du cœur selon la technique de Langendorff, le coeur est inversé dans une position à l'envers et est mécaniquement stabilisé par un cathéter à ballonnet inséré dans le ventricule gauche. Ensuite, un mince capuchon en latex - préalablement coulé pour correspondre à la taille moyenne du cœur du rat - est placé sur la surface épicardique. La sortie du capuchon latex est reliée au tube de silicium, avec l'ouverture distale 10 cm au-dessous du niveau de base du coeur, créant une légère aspiration. La CT produite en continu sur la surface épicardique est collectée dans des flacons refroidis par de la glace pour une analyse plus approfondie. Le taux de formation de CT variait de 17 à 147 μL / min (n = 14) dans le contrôle et les cœurs infarctus, ce qui représente 0,1-1% du perfusat effluent veineux coronaire. Analyse protéomique et perfo élevéLa Chromatographie liquide rmance (HPLC) a révélé que le TC recueilli contient un large spectre de protéines et de métabolites purinergiques.

Introduction

L'insuffisance cardiaque (HF) est la principale cause de décès chez les humains dans le monde ¹ . L'insuffisance cardiaque survient souvent en raison de la myocardite, des insultes ischémiques au myocarde et du remodelage ventriculaire gauche, entraînant une détérioration progressive de la fonction contractile cardiaque et de la qualité de vie des patients. Bien que les progrès de la cardiologie et de la chirurgie cardiaque ont considérablement diminué la mortalité des HF, ils servent simplement de «retardateurs» transitoires d'un processus de maladie inévitablement progressif qui entraîne une morbidité significative. Par conséquent, le manque actuel de traitement efficace souligne la nécessité d'identifier de nouvelles cibles moléculaires qui peuvent prévenir ou même inverser les HF. Cela inclut les changements dans la matrice extracellulaire, la réponse immunitaire cardiaque incontrôlée et les interactions entre les cellules cardiaques et non cardiaques ² .

Il est important de reconnaître que le microenvironnement que les cellules cardiaques sont exposées à la directionForme la réponse immunitaire et régénératrice du cœur blessé. Dans le coeur isolé et perfusé par voie saline, le CT est généré sur la surface cardiaque sous la forme de petites gouttelettes dérivées de l'espace interstitiel ( c'est-à-dire le microenvironnement), à la fois dans des conditions physiologiques et physiopathologiques ^{3 , 4 , 5} . Par conséquent, l'analyse de la CT ( c.-à-d., Le liquide interstitiel) peut aider à identifier les facteurs qui régulent le métabolisme cardiaque et la fonction contractile ⁶ ou influencent les fonctions des cellules immunitaires après leur migration dans le cœur blessé. Potentiellement, cela peut conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de la HF.

La collecte de CT à partir de coeurs murins est techniquement difficile. Dans les coeurs réguliers Langendorff-perfusion, la collection exclusive de CT est difficile car le mélange de CT avec coronarLe perfusif d'effluent veineux dilue de manière imprévisible toute concentration de métabolites / enzymes libérés de l'espace interstitiel. Une stratégie possible pour surmonter cette limitation est d'exclure l'effluent veineux en canulant le système pulmonaire et en ligaturant simultanément la veine pulmonaire ⁷ . Cependant, cette méthode est confrontée à des difficultés associées à la canulation et à la ligature de l'artère et des veines pulmonaires, provoquant une fuite potentielle d'effluent veineux dans le transjugé cardiaque. Le concept de l'utilisation d'un modèle inverse du cœur a d'abord été introduit par le groupe de Kammermeier, qui a inversé le coeur isolé et perfusé dans une position à l'envers et a placé un mince capuchon latex sur la surface épicardique pour échantillonner continuellement la TDM sans contamination des effluents veineux ^{8 , 9} . En utilisant cette procédure, CT a montré qu'il fournissait une mesure très sensible des métabolites libérés par le coeur ⁹ ,Le transfert capillaire d'acides gras ⁸ et les particules virales ¹⁰ .

Plus récemment, les facteurs paracrins qui peuvent réguler la réponse immunitaire locale et augmenter l'angiogenèse cardiaque ¹¹ ont été impliqués dans les effets bénéfiques de la thérapie à base de cellules souches pour les maladies cardiaques. L'analyse de CT dans le coeur inversé peut aider à identifier chimiquement ces facteurs paracrine individuels. En outre, la CT peut aider à identifier les facteurs impliqués dans l'activation in vivo des cellules immunitaires dans le cœur.

La description détaillée de la prise CT de la surface cardiaque, fournie ici, est expérimentalement utile pour les chercheurs qui étudient l'interaction des cellules immunitaires, des fibroblastes, des cellules endothéliales et des cardiomyocytes par rapport à la fonction cardiaque globale. Comme mentionné ci-dessus, le fluide interstitiel porte l'information pour la communication cellulaire à cellulaire dans le cœur, whQui peut être facilement évalué par la collecte de CT. La description technique détaillée, y compris un protocole vidéo sur la façon de collecter le TC à partir du coeur inversé, devrait faciliter l'application future de cette technique unique.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par l'agence de réglementation locale ( LANUV de Nordrhein-Westfalen, Allemagne) et ont été réalisées selon les directives d'utilisation animale. Les animaux ont été nourris avec un régime régulier de chow et ont reçu de l'eau du robinet ad libitum . Tous les équipements et produits chimiques nécessaires à chaque étape de l'expérience sont disponibles dans la Table des matières .

1. Préparation du bouchon latex et du ballon intraventriculaire

1. Faire un moule en aluminium à l'aide d'une fraise correspondant à la taille moyenne du cœur du rat (poids corporel de 300 à 350 g). Polir le moule avec un papier émeri fini (10/0).
   REMARQUE: Les paramètres détaillés du moule sont présentés à la figure 1A .
2. Fixer verticalement le cou du moule en aluminium à la fraise pour préparer le capuchon latex.
   REMARQUE: La fraiseuse fait tourner lentement le moule. Alternativement, un moteur électrique peut être utilisé. Li>
3. Verser 20 ml de latex liquide (commercialement acheté, voir la Table des matières ) dans un bécher en verre de 50 ml.
4. Abaissez le moule jusqu'à ce que tout le corps du moule soit immergé dans la solution de latex.
5. Soulevez lentement le moule (5 cm / min) en tournant.
6. Continuez à faire tourner le moule pendant 15 minutes supplémentaires, jusqu'à ce que le latex sur la surface du moule soit solidifié.
7. Ajouter environ 1 g de poudre de talc à la surface du moule (déjà recouvert d'un mince film de latex) pour éviter tout dommage lors du détachement.
8. Détachez doucement avec les doigts le bouchon de latex déjà séché de la surface du moule; Le cap de latex est maintenant prêt à l'emploi ( Figure 1B ).
9. Raccorder la sortie du capuchon latex à un tube de silicium de 15 cm (ID = 0,2 mm), utilisé plus tard pour la collecte de la CT.
10. Remplir le ballon de latex ventriculaire avec de l'eau et le fixer solidement sur une canule métallique en forme de L reliée à une seringue remplie d'eau de 1 ml (> Figure 1C).
    REMARQUE: ceci sera utilisé pour assurer le positionnement vertical du coeur (voir ci-dessous).
11. Assurez-vous que le ballon est étanche à l'air en effectuant plusieurs tests de dégonflage / gonflement avec la seringue jointe de 1 mL.
12. Raccorder la canule, via une butée à trois voies, à un transducteur de pression pour la mesure future de la pression développée intraventriculaire ( Figure 1C ).

2. Préparation du tampon de Krebs-Henseleit (KHB) et du système de perfusion de Langendorff

1. Mettre en place un système de perfusion Langendorff en utilisant soit un mode à flux constant (entraîné par une pompe à rouleaux) soit à pression constante (généré par la pression statique dans une colonne de verre).
   NOTE: Les détails de la préparation du coeur de Langendorff ont déjà été décrits ¹² .
2. Préparer 2 L d'un KHB modifié (en mM: 116,02 NaCl, 4,63 KCl, 1,10 MgSO ₄ · 7H ₂ O, 1,21 K ₂ HPO ₄ 2,52 CaCl ₂ · 2H ₂ O, 24,88 NaHCO ₃ , 8,30 D-glucose et 2,0 pyruvate de sodium).
   1. Peser tous les produits chimiques mais CaCl ₂ et les dissoudre dans 1,8 L d'eau double distillée dans un ballon de 2 L.
   2. Enlevez le milieu avec du carbogène (95% O ₂ /5% de CO ₂ ) pendant au moins 5 minutes pour équilibrer (pH: 7,4) sous agitation magnétique.
   3. Ajouter 0,74 g de CaCl ₂ .2H ₂ O et augmenter le volume total à 2 L avec de l'eau double distillée.
   4. Continuer l'agitation et faire barboter le milieu avec du carbogène pendant 5 minutes supplémentaires.
   5. Filtrer le KHB à travers un filtre de 0,2 μm pour éliminer les petites particules qui peuvent entraver la microcirculation du coeur.
3. Préparation du système de perfusion Langendorff.
   1. Placez le KHB filtré dans un bain d'eau préchauffé (38 ° C); Continue de faire barboter avec du carbogène pour générer une pression de 100 cmH ₂ O insidE le réservoir KHB.
   2. Connectez le réservoir à la colonne de verre pour établir une pression hydrostatique de 100 cmH ₂ O pour la perfusion de Langendorff avec KHB; Continue de faire barboter le KHB à l'intérieur de la colonne avec du carbogène.
   3. Réglez la température du système de réchauffement afin que la température à la sortie de la canule aortique soit de 37 ° C.
   4. Assurez-vous que le système de tubes est sans bulle.
   5. Oxygéner le KHB avec du carbogène pendant 5 minutes supplémentaires, jusqu'à ce que le PO ₂ dans le KHB atteigne 500-600 mmHg (mesuré par un analyseur de gaz de sang).
4. Mettre en place le système de perfusion pour fonctionner à une pression constante de 100 cmH ₂ O ou à un débit constant d'environ 10-20 mL / min en utilisant une commutation manuelle. Alternativement, utilisez un contrôleur de pompe interchangeable STH pour passer instantanément au mode de perfusion.

3. Isolation et Cannulation du Coeur

NOTE: Rats Wistar mâles avec poids corporel de 300-350 g ont été utilisés de sorte que la taille des coeurs correspondait au cap de latex pré-coulé. Les rats ont subi soit une ligature de la descendance artérielle gauche (LAD) pendant 50 minutes, suivie d'une reperfusion ou ont été simulées. Les détails de la méthodologie pour l'induction de l'infarctus du myocarde (IM) ont été signalés ailleurs ¹³ . Les expériences de coeur inversé chez les animaux d'infarctus ont été effectuées 5 jours après l'opération.

1. Anesthésier les rats en utilisant un vaporisateur d'isoflurane (2% V / V) relié à une chambre de maintien d'animaux (20 L).
2. Transférez les rats à un tableau d'opération (pas contrôlé par la température) après l'atteinte de l'anesthésie profonde.
3. Soulevez la peau et les muscles juste en dessous du sternum à l'aide d'une pince et coupez le bord inférieur des côtes avec de gros ciseaux.
4. En utilisant des ciseaux fins, faites une petite coupe dans le diaphragme, à la marge de la côte. Coupez les côtes caudalement pour faire un rabat de la paroi thoracique ventrale entière.
5. Accrochez doucement le cœur avec le pouce aNd index et les doigts du milieu et lentement le soulever vers le haut de sorte que les vaisseaux cardiaques deviennent légèrement étirés.
6. Excise le cœur jusqu'à ce que l'aorte soit complètement exposée.
7. Placez le cœur dans un bêcher de 100 ml contenant 50 ml de KHB glacé (4 ° C) et déplacez-le vers l'appareil de perfusion.
8. Montez immédiatement le cœur via l'aorte sur une canule de gouttes et serrez-le avec une suture (4-0). Évitez les bulles d'air qui pénètrent dans le cœur.
9. Appliquer une pression de perfusion constante (100 cmH ₂ O). Alternativement, un débit total (à partir de 20 mL / min) peut être appliqué.
   Remarque: Le temps entre l'ouverture du thorax et la fixation du cœur à la canule de perfusion devrait prendre environ 3 minutes entre les mains d'un opérateur expérimenté.

4. Modèle à coeur inversé

1. Tournez doucement la canule aortique jusqu'à ce que la paroi postérieure du cœur soit en face .
2. Retirer le tissu conjonctif avec des ciseauxPour exposer l'ouverture de l'oreillette gauche, en le prêtant à la canulation intraventriculaire.
3. Insérez le ballon de latex dégonflé attaché à un cathéter rigide par l'atrium gauche dans le ventricule gauche.
4. Gonflez le ballon jusqu'à ce qu'il remplisse toute la cavité ventriculaire (le volume de gonflement est pré-marqué sur la seringue).
5. Inverser le cœur jusqu'à ce qu'il soit à l'envers, en le soutenant par le cathéter ballon intraventriculaire.
6. Comme le montre la figure 1C , stabiliser mécaniquement le coeur inversé en position verticale en utilisant le ballon intraventriculaire avec un cathéter métallique rigide.
7. Réglez la position du cœur pour éviter une torsion excessive de la racine aortique.
8. Réglez la pression diastolique à 3-5 mmHg (mesuré par le ballon intra-ventriculaire, voir Figure 1C ).
9. Observez la surface épicardique du cœur et assurez-vous que de petites gouttelettes se forment.
10. Placez le cap de latex oSur la surface du cœur en poussant doucement pour couvrir tout le cœur en utilisant les doigts.
11. Assurez-vous que le capuchon latex couvre la majeure partie de la surface ventriculaire.
12. Retirez les bulles d'air, le cas échéant, à l'intérieur du bouchon et du tube en aspirant doucement avec une seringue de 1 mL.
13. Réglez l'ouverture distale du tube de connexion CT à 10 cm au-dessous du niveau horizontal du coeur.
    REMARQUE: Cette procédure garantit une légère aspiration par pression hydrostatique négative.
14. Recueillir des gouttes de CT dans un tube de collecte de 1,5 ml placé dans de la glace mélangé 1: 1 avec du NaCl. Recueillir environ 0.15-1.5 mL de CT.
    REMARQUE: Le mélange glace / NaCl stabilise la température dans le tube de collecte en dessous de zéro (environ -4 ° C).
    REMARQUE: Le temps d'échantillonnage dépend du but expérimental. Le débit de la CT est d'environ 27 ± 20 μL / min chez les animaux simulés (n = 3) et 100 ± 47 μL / min pour les animaux ligaturés coronaires (n = 11).
15. Prendre des échantillons CT pesant et instantanésDans l'azote liquide et les stocker à -80 ° C pour les mesures ultérieures.

5. Analyse du CT

1. Utilisez le liquide CT pour l'analyse des métabolites, selon la question scientifique.
   NOTE: Les données présentées sur la figure 2 et la figure 3 ont été recueillies à partir d'une perfusion à pression constante (100 cmH ₂ O) et environ 0,15-1,5 ml de liquide CT a été recueilli en une période de 10 min. Ce temps et ce volume étaient suffisants pour les analyses protéomiques (minimum: 50 μL, Figure 2 ) ¹⁴ et HPLC (minimum: 20 μL, Figure 3 ) ¹⁵ de diverses purines.

Résultats

Le modèle de coeur inversé permet la collecte de transudats interstitiels cardiaques dans un coeur de rat rétro-perfusé isolé ( figure 1A- C ). Lorsqu'il a été perfusé à une pression constante de 100 cmH ₂ O, le taux de formation de fluide interstitiel variait entre 17 et 147 μL / min, soit 0,1 à 1% de l'effluent veineux coronaire dans le coeur isolé.

Discussion

Le modèle de coeur inversé est basé sur la technique de perfusion de cœur de Langendorff bien établie ¹² et est réalisé en inversant simplement le cœur en position de renversement et en maintenant cette position à l'aide d'un cathéter à ballonnet intra-ventriculaire rigide. De telle manière, le transjordé interstitiel cardiaque peut être physiquement séparé du perfusat d'effluent veineux coronaire, gouttant par gravité à partir de la base du coeur ^9...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Latex Solution	ProChemie	Z-Latex LA-TZ	http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latex-la-tz
Aluminum Mold	Home made	-	Reverse heart model
Universal Ovens	Memmert	UNB 400	Reverse heart model
Latex Balloon	Hugo Sachs	Size 4	Reverse heart model
Milling Machine	Proxxon	MF70	Reverse heart model
Sodium Chloride	Sigma	SZBD0810V	Chemicals
Sodium Hydrogen Carbonate	Roth	68852	Chemicals
Potassium Chloride	Merck	49361	Chemicals
Magnesium Sulphate Heptahydrate	Merck	58861	Chemicals
Potassium Dihydrogen Phosphate	Merck	48731	Chemicals
D(+)-Glucose Anhydrous	Merck	83371	Chemicals
Calcium Chloride Dihydrate	Fluka	21097	Chemicals
Balance	VWR	SE 1202	Weighing chemicals
Double Distilled Water	Millpore	-	Disolving chemicals
Medical Pressure Transducer	Gold	-	Langendorff apparatus
Medical Flow Probe	Transonic	3PXN	Langendorff apparatus
Heating Circulating Bath	Haake	B3 ; DC1	Langendorff apparatus
Laboratory and Vaccum Tubing	Tygon	R-3603	Langendorff apparatus
Animal Research Flowmeters	Transonic	T206	Langendorff apparatus
PowerLab Data Acquisition Device	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
LabChart Data Acquisition Software	AD Instruments	Chart 7.1	Langendorff apparatus
Peristaltic Pump	Glison	MINIPULS 3	Langendorff apparatus
Glass Water Column	home made	-	Langendorff apparatus
Water Bath Protective Agent	VWR	462-7000	Langendorff apparatus
Sterile Disposable Filters (0.2 µm)	Thermo Scientific	595-4520	Langendorff apparatus
Blood gas analyzers	Radiometer	ABL90 FLEX PLUS	Gas analyzer
70% ethanol	VWR	UN1170	Cleaning  tubings
100% ethanol	Merck	64-17-5	Cleaning tubings
Wistar Rats	Janvier	-	Animals
Stainless Scissors	AESCULAP	BC702R	Surgical Instruments
Stainless Scissors	AESCULAP	BC257R	Surgical Instruments
Big Forceps	AESCULAP	-	Surgical Instruments
8m/m Stainless Forceps	F.S.T	11052-10	Surgical Instruments
superfine (10/0) emery paper	3M	051111-11694	Reverse heart model